单细胞微凝胶电泳技术的研究和应用

在研究辐射生物效应中, 检测DNA 损伤的方法很多。例如: 细胞遗传学方法染色体畸变、微核、姐妹染色单体互换等等。但上述方法费时费力, 并有一定的局限性。八十年代由O st ing 等首次提出的用微板电泳技术检测单细胞水平DNA 损伤。后经Singh 等进一步改进和完善了单细胞微凝胶电泳Single Cellm icrogel elect ropho resis 简称SCGE) 技术, 又称彗星检测法(Comet assay)。该方法突破了传统局限性, 即设备、操作简便, 所需细胞少、无需放射性示踪剂, 而且灵敏、快速, 整个实验过程从来样到结果分析可在一个工作日完成的新技术。因此, 该技术在国外有关研究领域已得到广泛应用。近年来, 国内一些研究领域也引进和建立此方法。主要用于环境诱突变剂或诱癌剂引起的DNA 损伤ö修复的研究; 癌症病人放、化疗方案的最佳选择及科学预后的研究; 作为生物标记进行生物监测及流行病学、毒理遗传学等诸多领域的研究。目前, 也有一些专家学者将此技术应用于植物细胞的研究。SCGE 技术在本实验室已建立, 其方法是使包埋于琼脂糖中的细胞经裂解去掉细胞浆, 在碱性环境下DNA 双链螺旋成为单链, 在电泳电场作用下DNA 断链离开细胞核向正极迁移出现“彗星”状拖尾现象, 再通过荧光染料溴化乙啶结合DNA 显色检测其损伤程度。为将此技术推广于辐射生物效应体内外研究中, 本实验选用在辐射生物效应中经常用的人血淋巴细胞(HBL ) , 中国仓鼠肺细胞(CHL ) 和兔血淋巴细胞这3 种细胞探索利用此技术检测DNA 损伤的可行性。实验结果表明: SCGE 技术能够对单个细胞DNA 损伤进行研究, 荧光测定核DNA 直径和迁移DNA (即彗星尾) 长度, 而尾长度和尾部荧光强度与DNA 链的断裂呈正相关。由于“彗星”成像是因损伤DNA 在电泳中从核内迁出, 因此它的尾长和密度等是评价与量化电泳结果的重要因素。我们选用上述3 种细胞接受60Co2·线照射后, 经SCGE 技术检测DNA 损伤, 照射组与未照射组DNA 迁移距离经统计学检验, 差异显著性水平A= 0. 5。细胞经照射处理后可引起DNA 电泳迁移, 而迁移长度随照射剂量的增加而延长。此项技术可从受照人员外周血淋巴细胞DNA 电泳迁移长度来估算受照剂量, 从而为评价急性照射和慢性小剂量长期照射的损伤程度提供科学依据。     

采用单细胞凝胶电泳技术检测断裂剂对精子DNA损伤

背景与目的：讨论精子SCGE方法的实用性,对检验指标进行比较。材料与方法：选择不同浓度的已知断裂剂(H2O2,MMS),对人精子进行体外染毒、小鼠进行体内染毒,采用SCGE检测精子DNA损伤,选择3种不同检测指标。结果：对检测指标进行相关分析,结果显示,DNA头部百分比与彗星尾长、尾矩间存在相关关系。以DNA头部百分比为指标,方差分析表明,染毒剂量存在统计学差异;q检验显示,剂量组间差异存在统计学意义;对检测指标与染毒剂量的回归方程有统计学意义。结论：改进的精子SCGE法可以用于化合物遗传毒性评价。检测指标间存在相关关系,在具体实践中,可根据条件选择检验指标。     

用单细胞凝胶电泳技术检测甲醛对小鼠睾丸细胞的DNA损伤

背景与目的：研究甲醛对离体和体内小鼠睾丸细胞DNA的损伤作用。材料与方法：以6、30、60、120 μmol/L甲醛浓度处理离体小鼠睾丸生精细胞,以0.2、2、20 mg/kg的甲醛腹腔暴露小鼠,利用单细胞凝胶电泳检测睾丸生精细胞DNA的损伤作用。结果：甲醛在6μmol/L时就可以使小鼠离体睾丸细胞产生DNA损伤,与阴性对照不同 (除 tail moment外),并随浓度增加DNA迁移也相应增加,到30 μmol/L时DNA损伤最为明显,但随浓度升高DNA迁移反而减少,当甲醛浓度为120 μmol/L时DNA迁移与阴性对照相似。腹腔注射0.2、2 mg/kg的甲醛组小鼠睾丸细胞DNA迁移高于对照组,0.2 mg/kg组DNA迁移最为明显。 结论：甲醛对小鼠睾丸细胞具有遗传性损伤,低剂量时是以细胞DNA断裂损伤为主,而高剂量时可能引起其他方式的损伤。     

运用单细胞凝胶电泳研究稀土元素钬对小鼠骨髓细胞DNA的损伤

背景与目的:探讨稀土元素钬对小鼠骨髓细胞DNA的损伤.材料与方法:给小鼠灌胃氧化钬的盐酸溶液,24h后取股骨骨髓细胞进行单细胞凝胶电泳,观察有无染色体损伤和DNA损伤.结果:试验表明在20～80 mg/kg剂量范围内,彗星细胞的尾长随剂量的增加而增长,而头长则随剂量的递增而缩短,并且在40～80 mg/kg剂量范围内与阴性组差异存在显著性;同时,拖尾率与DNA损伤率也随剂量的增加而升高.结论:稀土元素钬对小鼠骨髓细胞DNA具有一定的损伤作用.     

提前获取早熟凝集染色体环快速估算受照剂量的可行性研究

目的：缩短培养时间,拟合γ射线诱发离体人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体环（premature condensation chromosomerings,PCC-R）的剂量-效应曲线,探讨快速估算生物剂量的可行性。方法：~（60）Coγ射线照射离体人外周血,剂量为0、1、3、6、10、15、20 Gy,照后分别培养44和48 h,收获前1 h加入冈田酸,分别计数PCC-R频率,拟合受照44与48 h的剂量-效应曲线并进行比较。结果：培养44 h较48 h获得的分析细胞数略少,PCC-R率略低于48 h结果（各个剂量点间的差异均无统计学意义）。外周血淋巴细胞PCC-R率随照射剂量的增加而增加,0～15 Gy剂量范围内二者之间满足直线方程Y=-0.015 2＋0.062 5D（R~2=0.983 9）。结论：缩短培养时间至44 h,PCC-R仍然可以用于15 Gy以内的辐射事故的剂量估算。     

不同肿瘤细胞株对153Sm的敏感性及剂量-效应关系研究

目的　研究三种不同肿瘤细胞株对放射性核素1 53Sm的药物敏感性及剂量 -效应关系。方法　采用MTT法观察放射性同位素1 53Sm作用于前列腺癌PC 3细胞、乳腺癌ER 75 30细胞和非小细胞肺癌A549细胞后各细胞株生长受抑制的程度并绘制抑制率曲线。结果　PC 3、ER 75 30、A549细胞加入放射性同位素1 53Sm72h后 ,细胞形态发生变化 ,表现为细胞形态不规则 ,贴壁能力下降 ,透光度降低 ,还可见部分细胞崩解死亡 ,且效应随着药物浓度的增加更为明显。在同一剂量下抑制率由大到小为PC 3 >ER 75 30 >A549。三种肿瘤细胞对1 53Sm的敏感性不同 ,PC 3最敏感 ,ER 75 30和A549细胞的敏感性相对较差。结论　放射性同位素1 53Sm对肿瘤细胞的生长具有抑制作用 ,不同肿瘤细胞1 53Sm的敏感性不同 ,研究剂量 -效应关系及药物敏感性有利于指导临床治疗个体化。     

自体外周血干细胞移植支持下超大剂量化疗治疗非何杰金氏淋巴瘤的初步报告

目的：报告４例非何杰金氏淋巴瘤（ＮＨＬ）在外周血干细胞移植（ＰＢＰＣＴ）支持下接受超大剂量化疗（ＨＤＣ）的初步经验并评价所用ＰＢＰＣ动员方案的动员效果，预处理方案的耐受性以及ＰＢＰＣ回输后造血重建情况。方法：４例高危ＮＨＬ经常规化疗获首次缓解后，采用ＣＴＸ３５００ｍｇ／ｍ２＋Ｇ－ＣＳＦ３．５－５μｇ／（ｋｇ·次）＋Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ１０ｍｇ作动员方案，经ＣＢＶ＋Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ（ＣＴＸ３６００ｍｇ／ｍ２，ＶＰ－１６１２００ｍｇ／ｍ２．ＢＣＮＵ３００ｍｇ／ｍ２和Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ１００ｍｇ／ｍ２）或ＴＢＩ８Ｇｙ＋ＶＰ－１６１２００ｍｇ／ｍ２治疗后回输ＰＢＰＣ。结果：每例患者分离２次，分别采集到ＭＮＣ１．７－４．３×１０８／ｋｇ，ＣＦＵ－ＧＭ１．５－２．８×１０４／ｋｇ和ＣＤ＋３４细胞３．１－８．８×１０６／ｋｇ。回输ＰＢＰＣ后，均获快速重建造血功能，ＡＮＣ＞０．５×１０９／Ｌ和Ｐｔ＞５．０×１０９／Ｌ的时间为８～１２天和８～１６天。非造血系统毒性包括心脏毒性反应，恶心呕吐，轻度肝功能异常和粘膜炎等。结论：ＰＢＰＣＴ支持下超大剂量化疗是治疗ＮＨＬ安全可行的临床手段，值得进一步研究探索。     

放射治疗对宫颈癌病人DNA损伤及hprt基因突变的初步研究

目的：评价放射治疗对宫颈癌患者造成的遗传学损伤。方法：取15例宫颈鳞癌放疗患者放疗前及放疗累积剂量为0Gy、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy、60Gy时的外周静脉血,以彗星实验检测淋巴细胞的DNA损伤,采用多核细胞法测hprt基因位点突变率。结果：各累积剂量组淋巴细胞DNA拖尾率比照射前显著升高（P〈0.01）,并且在0-60Gy之间,拖尾率与累积照射剂量之间成线性关系。各累积剂量组尾长比照射前均增加（P〈0.01）,在照射剂量累积30Gy时,尾长均值达最大。尾长与累积剂量间不成线性关系。hprt基因位点突变率在照射后升高,与照射前相比,在照射累积剂量为30Gy、40Gy和50Gy时,显示有统计学意义差别（P〈0.05）。hprt基因突变率与累积剂量间呈现较好的剂量-效应关系。结论：宫颈癌患者放疗后造成外周血淋巴细胞DNA损伤及hprt基因突变,hprt基因突变和彗星实验用于评价放疗造成的损伤,具有较高的敏感性。     

基于CT参数分析模型评估辐射诱导小鼠肺纤维化剂量-效应关系研究

目的 基于肺纤维化影像学改变建立剂量-效应模型,定量分析辐射剂量与诱导肺纤维化间的关系。方法 8~10周龄C57BL6雌性小鼠随机分组接受单次20Gy X线照射。照射前后不同时间点行CT扫描成像,图像经三维分割算法获得影像学肺密度与肺部体积值定量参数。经梯度剂量X线照射后,基于基因芯片与病理学验证后对CT参数进行逻辑回归建模。结果 20Gy照射后24周受照鼠肺密度较空白对照组显著增加[(-289.81±12.06)HU∶(-377.97±6.24)HU,P<0.001]。照射组小鼠平均肺体积较对照组明显缩小[(0.44±0.03)cm³∶(0.66±0.01)cm³,P<0.001)]。影像学定量分析结果与HE及Masson染色法观察到的肺纤维化结果相符,与肺纤维化基因标志物转录表达水平呈正相关(R²=0.75,P<0.001)。经逻辑回归建模得到辐射诱导肺密度增加的剂量为(13.64±0.14)Gy (R²=0.99,P<0.001);引起肺体积减小的剂量为(16.17±4.36)Gy (R²=0.89,P<0.001)。结论 CT肺密度与肺体积定量分析可作为评估小鼠放射性肺纤维化程度的可靠影像学参数,肺纤维化影像学改变剂量-效应模型可为进一步比较肺部大剂量低分割照射及半肺野照射致肺纤维化研究提供实验基础。     

人外周血淋巴细胞微核分析用于估算离体模拟局部照射剂量的研究

目的：探讨利用人外周血淋巴细胞微核分析估算局部照射剂量的可行性。方法：收集2例人外周血样本,每例血样分为两部分,一部分不照射,另一部分再分成两组分别于1和5 Gy的⁶⁰Co γ射线下离体照射,剂量率为1 Gy/min。将来自同一样本的照射血与未照射血按1∶3或3∶1比例混合以模拟局部照射,共分析8组混合血样中双核淋巴细胞微核（MN）率,利用国际原子能机构（IAEA）推荐的Dolphin's模型推算混合血中受照血的微核率,并采用卫生行业标准（WS/T 178—1999）推荐的剂量效应曲线估算局部照射剂量。结果：各组混合血样MN分布均不符合泊松分布。1 Gy照射组估算的局部剂量与实际照射剂量偏差较大,5 Gy照射组估算的局部剂量与实际照射剂量较接近。结论：离体情况下,MN能较好的用于估算局部照射剂量,且MN可能更适用于较高剂量的估算。     

44. Study the level of DNA breakage in workers exposed to styrene by single cell gel electrophoresis

Objective: Study the level of DNA breakage in workers exposed to styrene. Methods: 35 workers aging from 18 to 40 exposed to styrene half a year above were observed as exposed group, in the mean time, 57 workers in the same district who hadn't been exposed to known genotoxicant were selected as control. Bloods of them were sampled and DNA lesions were detected by single cell gel electrophoresis. Results: Compared with control, the ratio between the length of Comet tail and the total length of Comet in exposed group significantly increased, especially it raised following the styrene concentration exposed, but it was not different among different working age groups. Conclusions: DNA is damaged by styrene, and it appears as dose-response relationship.     

Fas抗体诱导的膀胱癌细胞凋亡

背景与目的：Fas是死亡因子,可以诱导细胞的凋亡性死亡,但许多表达Fas的恶性肿瘤细胞却不能进行凋亡性死亡,可能与其表达水平低下有关,为此我们研究了细胞Fas表达水平与抗Fas治疗生物学效应之间的相互关系。方法：分别将低表达Fas的膀胱癌细胞系EJ细胞进行脂质体介导的方法转染Fas基因和肿瘤坏死因子α（TNFα)处理,并用流式细胞直接免疫荧光术检测Fas的表达;单细胞电泳和流式细胞技术检测鼠抗人Fas单克隆抗体DX2 IgG1κ诱导转染Fas基因的、经TNFα处理的和未转染未处理的EJ细胞的细胞DNA损伤和凋亡。结果：流式细胞直接免疫荧光术检测EJ细胞Fas表达阳性率19．18％,经TNFα处理后的EJ细胞Fas表达阳性率28．03％,转染Fas基因后的EJ细胞Fas分子表达阳性率68．69％。鼠抗人Fas单克隆抗体DX2 IgG1κ诱导的EJ细胞组细胞电泳后所产生的拖尾现象轻微;DX2 IgG1κ对TNFα处理组的拖尾现象明显,而对转Fas基因组可引起最强的细胞拖尾现象,经统计学分析后表明,3组细胞的尾长与总长的比值之间差异均有显著统计学意义,P＜0．01;流式细胞技术检测EJ细胞和转Fas基因组EJ细胞中的凋亡细胞分别为7．4％和66．3％。结论：EJ细胞系对Fas抗体触发细胞凋亡的敏感性依赖于细胞表面Fas的表达水平。     

人高、低转移大细胞肺癌细胞株双向凝胶电泳图像分析

背景与目的　肺癌转移是肺癌的恶性标志和特征,也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。 为了更好地了解和阐明肺癌转移的分子机制,发现早期诊断和逆转肺癌转移的分子标志物,本研究应用双向 凝胶电泳技术,比较人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和人低转移大细胞肺癌细胞株(NL9980)间蛋白质组 表达的差异。方法　利用固相pH梯度双向凝胶电泳,分离L9981和NL9980细胞株的总蛋白,用图像分析 软件比较分析并识别细胞间的差异表达蛋白质。结果　应用比较蛋白质组学技术对L9981和NL9980细胞 株的蛋白质表达进行双向电泳分离,成功地获得了蛋白组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱。在三次 重复实验结果中,在L9981和NL9980细胞株中检测到的蛋白质点数分别为902±169和941±173,蛋白质斑 点位置在IEF方向的平均偏差为(0.858±0.076)mm,在SDS PAGE方向的平均偏差为(1.514±0.127)mm, 蛋白质表达量的变异为12.06%～12.22%。经ImageMaster软件分析后发现有15个蛋白质点仅在L9981 肺癌细胞株中检测到有表达,27个蛋白质点仅在NL9980中检测到有表达。发现4个蛋白质点在两种肺癌 细胞株中均存在,但在两种细胞株间的表达量差异在2倍以上,其中3个蛋白质点在L9981中表达量显著高     

人鼻咽癌细胞系HONE1的蛋白质双向凝胶电泳分析

目的：研究人鼻咽癌细胞系HONE1的蛋白质表达特征。方法：抽提鼻咽癌细胞系HONE1总蛋白,双向凝胶电泳（2－DE）分离、银杂显色,用凝胶成像仪和PDQUEST软件获取HONE1总蛋白的2－DE图像;根据获得的2－DE凝胶图像,从胶上切取分辨良好、染色较浓的蛋白质点,用胰蛋白酶原位水解,所获酶解肽段经基质辅助激光解吸飞行的时间质谱（MALDI－TOF－MS）测定Mr;以测得肽段Mr为肽质量指纹（PMF）,通过Pepldent软件搜索SWISS－PROT和TrEMBL数据库而识别该点对应的蛋白质。结果：建立了双向凝胶电泳分离总蛋白、质谱鉴定银染蛋白质点的方法,并鉴定出人鼻咽癌细胞系HONE1中表达较强的10个点相应的蛋白质。 结论：本研究为建立人鼻咽癌细胞HONE1的2－DE参考图和蛋白质数据库提供了有用的基础性研究资料,为进一步识别鼻咽癌特异性的蛋白质奠定了实验基础。     

Uracil misincorporation in human DNA detected using single cell gel electrophoresis

Poor folate status may be important in the aetiology of several epithelial cell malignancies including cancer of the uterine cervix. Folic acid is essential in the synthesis of purine nucleotides and the pyrimidine nucleoside thymidine and it is probable that imbalances in these DNA precursors negatively effect DNA stability and may ultimately lead to malignant transformation. The development of a modified 'comet assay' using the bacterial DNA repair enzyme uracil DNA glycosylase, to detect misincorporated uracil in human DNA is reported here. The effect of perturbing folic acid and deoxyuridine levels on uracil misincorporation in normal human lymphocytes and cultured human tumour cells was investigated using this assay. HeLa cells and peripheral human lymphocytes incubated as agarose-embedded nucleoids, with 1 unit of uracil DNA glycosylase per microg of DNA, contained low levels of uracil in their DNA. Both HeLa cells and stimulated human lymphocytes cultured in folate-deficient medium were growth arrested. Incubating human lymphocytes in folate-deficient medium significantly increased the level of uracil detected compared with control cells. HeLa cells showed an increase in non-specific DNA damage (strand breaks). Deoxyuridine (100 microM) significantly increased the level of uracil detected in the DNA of both folate-deficient and control HeLa cells. It appears that this modified comet assay specifically detects misincorporated uracil in single human cells. It should, therefore, prove valuable in determining the role of folic acid status in DNA instability and cancer.      

Trichostatin A enhances radiosensitivity and radiation-induced DNA damage of esophageal cancer cells

BackgroundTrichostatin A (TSA) is emerging as a potential component of anticancer therapy. In this study, we aimed to identify the radiosensitizing effects of TSA in esophageal squamous carcinoma cell lines and identify the genomic alteration of histone acetylation associated with TSA treatment.MethodsEC109 and KYSE450 cells were pretreated with TSA (0.1 µM) for 12 hours prior to irradiation, and the cell viability, flow cytometry, and comet assays were performed to analyze cell growth, cell apoptosis, and DNA damage, respectively. Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) was performed to identify the acetylation sites of histone H3 lysine 9 (H3K9), which was altered by TSA.ResultsOur data showed that TSA could sensitize esophageal cancer cells to radiation by inducing cell cycle arrest and increasing cell apoptosis. DNA damage induced by radiation was enhanced by TSA treatment. In addition, a total of 105 differential peak-related genes were found to be associated with TSA treatment, which was identified using ChIP-Seq with specific antibodies against acetylated histone H3K9.ConclusionsOur data suggest that pretreatment with TSA can enhance ionizing radiation-induced DNA damage of esophageal cancer cells, which was associated with the altered histone modification of whole genome. TSA has potential implications for clinical use in increasing the anticancer efficacy of radiation.     

PM2.5对支气管上皮细胞DNA损伤作用研究

目的：探讨大气细颗粒物（PM_2.5）染毒对人支气管上皮细胞（HBE） DNA损伤的作用。方法：分别用8、20、50 μg/mL的PM_2.5水溶液染毒HBE细胞24 h后,单细胞凝胶电泳实验（SCGE）检测DNA损伤情况。10和50 μg/L的PM_2.5水溶液染毒HBE细胞,以未染毒细胞作为阴性对照组,10 μmol/L的Cr⁶⁺水溶液为阳性对照组,实时荧光定量PCR （qPCR）检测DNA损伤修复基因hOGG1、hMTH1的mRNA表达水平的变化,Western blot检测hOGG1、hMTH1蛋白表达变化。结果：单细胞凝胶电泳检测8、20和50 μg/mL PM_2.5水溶液染毒组HBE细胞的尾部DNA含量、尾长、尾距较阴性对照组明显增加（P < 0.05或P < 0.01）。qPCR结果显示,与阴性对照组比较,HBE细胞hOGG1 mRNA表达水平在10和50 μg/mL PM_2.5水溶液染毒以及阳性对照Cr⁶⁺水溶液染毒后分别升高75.0%、132.0%、214.0%;hMTH1 mRNA分别升高61.0%、144.0%、75.0%。Western blot结果显示,与阴性对照组比较,HBE细胞hOGG1蛋白表达水平在10和50 μg/mL PM_2.5水溶液染毒以及Cr⁶⁺水溶液染毒后分别升高47.6%、64.0%、47.0%;hMTH1蛋白分别升高20.5%、49.8%、20.9%。结论：PM_2.5水溶液染毒对HBE细胞DNA具有明显的损伤作用,并引起HBE细胞DNA损伤修复基因hOGG1、hMTH1表达水平升高。     

体外硫芥对人外周血淋巴细胞DNA的损伤

目的与方法：利用碱性单细胞凝胶电泳（ＳＣＧＥ）技术在体外检测硫芥对人外周血淋巴细胞的损伤情况。结果与结论：结果表明：在硫芥的作用下细胞ＤＮＡ的迁移率和迁移长度增加,且呈显著剂量效应关系。     

Determination of radiation-induced damage in lymphocytes using the micronucleus and microgel electrophoresis ‘Comet’ assays

DNA damage assays may be useful as rapid predictors of normal tissue radiosensitivity in clinical samples. We measured in vitro radiation-induced (2 Gy) damage to lymphocytes from cancer patients and normal healthy donors using both the micronucleus and microgel electrophoresis (Comet) assays simultaneously. For damage assessment, there was a good correlation (P < 0.001) between the mean comet lengths and the fraction of cells with comets. There was no correlation with initial damage, determined as the proportion of cells within a sample that formed comets, in comparison with the mean frequency of micronuclei per binucleate cell. However, there appeared to be an association between the determination of repair proficiency in the Comet assay and the mean frequency of micronuclei per binucleate cell in lymphocytes from cancer patients.     

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯对小鼠肺细胞DNA的损伤作用

目的： 探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)对小鼠肺细胞DNA的损伤作用。方法：以生理盐水作为阴性对照组,用不同浓度DEHP(5、25、125、625 μmol/L)对小鼠肺细胞进行体外染毒,应用单细胞凝胶电泳技术检测肺细胞DNA的断裂程度。结果：当DEHP的浓度为125和625 μmol/L时,肺细胞尾部DNA百分含量、尾矩和Olive 尾矩与阴性对照组相比均升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论：DEHP在体外可造成小鼠肺细胞的DNA断裂损伤。