腺相关病毒介导的GDNF对卡那霉素致耳蜗损害的保护性研究

目的 利用腺相关病毒（adeno-associated virus．AAV）．不同血清型对不同宿主细胞转导率存在差异的特点，探讨不同血清型AAV对耳蜗各种细胞尤其是毛细胞的转染率，进一步探讨高转染率的血清型AAV转导神经胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurtrophic factor，GDNF）对卡那霉素致鼠耳蜗损害的保护作用。方法采用不同血清型的AAV携载标记基因绿荧光蛋白EGFP，微注射到鼠耳蜗，荧光显微镜检测耳蜗内EGFP的表达分布和强度。应用筛选出的高转导率的血清型AAV构建携载GDNF的载体，微注射到卡那霉素耳聋模型鼠耳蜗内，经脑干诱发电位检测听力阈值，ELISA法检测耳蜗外淋巴液GDNF蛋白表达，免疫组化检测GDNF蛋白在细胞内的表达，耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞染色检测细胞的凋亡。结果荧光显微镜结果显示七种AAV血清型转导的EGFP均可分别在耳蜗的不同细胞内表达，其中AAV3-EGFP特异性在耳蜗内毛细胞表达，AAV1-EGFP在耳蜗内毛细胞等高效表达。在卡那霉素耳聋模型鼠中，注射AAV1-GDNF的耳蜗听力阈值比对侧耳低，GDNF在注射耳蜗内的表达水平比对照组高，其在耳蜗内的表达分布与EGFP的表达相似，治疗耳的耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞比对照耳幸存多。结论作为耳蜗基因治疗的载体，AAV血清型具有高转导率。AAV1型载体转导的GDNF保护了耳蜗功能．可以作为一个有价值的方法预防氨基糖甙类抗生素导致的耳聋。本研究为今后耳蜗毛细胞的进一步研究，以及对由于单基因突变导致的隐性遗传性耳聋开展耳蜗的基因治疗提供依据。     

腺相关病毒转导EC-SOD对耳蜗药物性损害的保护作用

目的探讨腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为载体,介导分泌型超氧化物歧化酶（extracel-lular superoxide dismutase,EC-SOD）基因,转染耳蜗细胞后对卡那霉素致大鼠耳蜗损害的保护作用。方法构建AAV8血清型载体,携载绿荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）或EC-SOD基因,体外感染细胞,蛋白电泳检测EC-SOD的表达;将AAV8-EGFP和AAV8-EC-SOD分别微注射到卡那霉素耳聋模型大鼠耳蜗内,检测听性脑干反应阈值变化,生化法检测耳蜗外淋巴液EC-SOD酶活性,免疫组织化学检测EC-SOD蛋白在耳蜗细胞内的表达,耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞染色检测细胞存活的数量。结果AAV8转导的绿荧光蛋白可在耳蜗内毛细胞、螺旋韧带细胞、内沟细胞等多种细胞内表达。体外蛋白电泳检测EC-SOD在细胞培养液中存在单体、二聚体、四聚体等;在AAV8-EC-SOD组注射载体的耳蜗外淋巴液中EC-SOD酶活性明显高于AAV8-EGFP组,转导的EC-SOD在耳蜗内的表达分布与绿荧光蛋白的表达相似。在卡那霉素耳聋模型鼠中,AAV8-EC-SOD组的ABR反应阈值变化比AAV8-EGFP组明显小,AAV8-EC-SOD组的耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞比AAV8-EGFP组的存活多,差异有显著统计学意义。结论AAV8型载体可转染耳蜗内多种细胞,AAV8型转导的EC-SOD可以拮抗氨基糖甙类抗生素对耳蜗的损害。     

重组腺相关病毒rAAV—NT4-ADNF-9转染大鼠耳蜗组织的体外研究

目的：包装携载神经营养素（NT4）与活性依赖性神经营养因子-9（ADNF-9）融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADN-9，并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法：使用pSSHG-CMV-NT4-ADN-9、pFG140和pAAV／Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备ADN-9重组腺相关病毒（AAV），应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度；体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞；将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞，于24h后提取组织行RT-PCR以检测rAAV—NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果：应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×10^14cfu／L，表明成功构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后，经RT—PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织中得到表达。结论：构建的重组病毒rAAV-NT4ADNF-9在体外可成功转染耳蜗组织，用于基因治疗的研究。     

腺病毒携带EGFP基因经完整圆窗膜转导豚鼠耳蜗的实验研究

目的研究腺病毒携带目的基因经完整圆窗膜途径耳蜗转导的可行性及安全性，为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法20只白色红目豚鼠，术前及术后分别行听性脑干反应（ABR）检查。实验组（12只）以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），对照组（8只）以人工外淋巴液注入豚鼠圆窗龛内。分别于术后5天、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片，耳蜗冰冻切片观察。结果于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因的转导方法对听力无明显影响。转染耳蜗及对侧耳蜗内目的基因呈广泛表达。5天组表达产物最高，14天组逐渐降低。对照组耳蜗未见EPFP表达。结论于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因转导的方法对耳蜗无明显毒害作用，且能够将目的基因成功转导至双侧耳蜗组织并广泛表达。     

重组杆状病毒载体介导新生大鼠耳蜗Corti器体外模型基因转染研究

目的建立新生大鼠耳蜗Corti器体外培养模型,探讨重组杆状病毒作为内耳基因转染载体的可行性及其转染特点。方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,建立新生大鼠耳蜗Corti器体外模型,加入携带报告基因的病毒悬液,观察外源基因表达情况。结果耳蜗Corti器体外培养48小时后,培养组织生长良好。Bac-GFP联合丁酸钠可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞,同时并没有改变Corti器的正常结构。结论新生大鼠离体内耳组织转基因培养法是内耳基因治疗实验研究的一种可行方法。杆状病毒可以在体外高效、安全、快速的转染毛细胞和螺旋神经节细胞,有希望成为内耳基因治疗的新型载体。     

经完整圆窗膜途径EGFP基因在大鼠耳蜗中的表达

目的 研究经完整圆窗膜途径进行耳蜗基因转导的可行性及安全性，为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法 24只SD大鼠术前及术后分别行听性脑干反应(ABR)检查。实验组(18只)用阳离子脂质体携带的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein，EGFP)基因，对照组(6只)用生理盐水，注入置于圆窗龛处的明胶海绵内。分别于术后3、7、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片观察。结果 于圆窗龛处放置明胶海绵的转导方法对听力无明显影响。转染耳蜗呈明显的绿色荧光。3天组表达产物最高，7天组逐渐降低，14天组更弱。对侧及对照组耳蜗均未见荧光表达。结论 于圆窗龛处放置明胶海绵进行基因转导的方法对听力没有影响，且能够成功转染耳蜗组织，是一种行之有效的方法。     

腹侧听泡外入路小鼠耳蜗鼓阶基因导入的实验研究

目的研究腺病毒携带目的基因经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的可行性及目的基因的表达特点,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法16只健康5周龄C57BL/6J小鼠,腺病毒组10只,以重组腺病毒携带有Hath-1和增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）,人工外淋巴液组6只以人工外淋巴液,经腹侧听泡外入路导入耳蜗鼓阶底转。分别于术后第7天分别行听性脑干反应（ABR）检查后取双侧耳蜗标本做基底膜铺片、耳蜗冰冻切片观察基因的表达。结果经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法对听力影响较小。腺病毒组耳蜗内目的基因呈广泛表达。对照组耳蜗未见荧光表达。结论经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法对听力影响较小,且能够将目的基因成功转导至耳蜗组织并广泛表达。     

Cx26、Cx30与非综合征耳聋的研究现状及基因治疗的展望

遗传性耳聋可分为综合征性耳聋(syndromic hearing loss,SHL)和非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing loss,NSHL)。目前与遗传性耳聋关系最密切的两种连接蛋白是Cx26和Cx30,二者在耳蜗的生理功能上起着举足轻重的作用。随着人们对生活质量要求的提高,众多耳聋患者的听力亟待解决,目前基因治疗被认为是耳聋治疗最有希望的方法之一。本文就连接蛋白26、30与非综合征性耳聋的研究现状及耳聋基因治疗常用载体、常用治疗基因及内耳基因转导途径等方面的最新研究进展进行综述。     

病毒与非病毒载体转染新生大鼠血管纹边缘细胞的比较研究

目的通过病毒与非病毒载体对原代培养的新生大鼠内耳血管纹边缘细胞转染情况的比较，选择出适合边缘细胞的基因治疗载体。方法用质粒（pEGFP—N1）、血清5型重组腺病毒（rAd5）以及血清2型重组腺相关病毒（rAAV2）三种载体转染新生大鼠（≤72小时）耳边缘细胞，通过对转染效率、细胞凋亡以及细胞活性的检测将三种载体加以比较。结果对边缘细胞的转导效率依次为rAd5〉rAAV2〉pEGFP—N1，AnnexinV—APC／7-AAD双染法检测转染阳性细胞的损伤情况依次为rAAV2〈rAd5〈pEGFP—N1，CCK一8法检测转染后的细胞活性依次为rAAV2〉rAd5〉pEGFP—N1。结论病毒载体相对于非病毒载体以其高转导效率、低细胞毒性在对原代培养的新生大鼠耳边缘细胞的转染中表现出明显优势。与血清2型重组腺相关病毒比较，相对高效、低毒性的血清5型重组腺病毒更适用于原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞的基因转染研究。     

腺相关病毒介导自杀基因系统对头颈肿瘤细胞体外杀伤效应

目的探讨腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的I型人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk)联合羟甲基无环鸟苷(ganciclovir,GCV)系统(HSV- tk／GCV)对头颈肿瘤细胞系的敏感性,以及组蛋白脱羧酶抑制剂FR901228对AAV-HSV-tk／GCV系统头颈肿瘤细胞系的体外杀伤效应的影响。方法采用AAV各血清型转染三种头颈肿瘤细胞系(黑色素瘤细胞系B-16,人喉鳞状细胞癌细胞系HEp-2和人上颔窦癌细胞系NKO-1),检测荧光表达强度。进一步应用AAV携载HSV-tk／GCV系统感染细胞系,以及与FR901 228联合应用,XTT法检测肿瘤杀伤效应。实时定量PCR检测细胞中tk基因的含量及其表达。结果经统计学分析显示,不同血清型AAV对三种细胞系转染率有显著差异。AAV1型对B-16,AAV2型对HEp-2以及AAV3型对NKO-1转导效率高。AAV介导的HSV-tk／GCV系统对三种细胞系均具有明显的杀伤效应,FR901228增加了细胞内tk基因的含量及其表达,同时明显提高了肿瘤杀伤效应,其LD50明显小于对照组。结论头颈肿瘤的细胞系对AAV介导的HSV-tk/GCV系统均高度敏感,联合FR901 228增强对肿瘤的杀伤效应,可望成为头颈肿瘤基因治疗的新途径。     

Management of cancer of the base of tongue

The management of base of tongue cancer has evolved steadily over time. Organ preservation with primary radiation therapy has produced excellent oncologic and functional outcomes. Concomitant chemotherapy has become important in patients with locoregionally advanced disease. Planned neck dissection after organ preservation therapy continues to be an integral step for regional control. This article reports the results of a literature review of base of tongue cancer emphasizing a multidisciplinary approach to obtain optimal results in terms of cure and quality of life.     

耳廓开放性外伤的治疗方法探析

目的 探讨耳廓开放性外伤的治疗方法。方法 23耳耳廓开放性外伤经彻底清创，肝素生理盐水冲洗伤口后，对位缝合。术后用抗生素抗感染、丹参扩张血管、罂粟碱改善微循环。结果 23耳中2耳失访，18耳完全成活，1耳部分成活，2耳完全坏死。结论 耳廓撕裂伤、断伤、带有皮蒂的耳廓离断伤，由于断端双侧血管丰富，经对位缝合后容易成活。但耳廓完全离断伤由于缺乏血供，经对位缝合后不易成活，可采用去皮血管植入包埋法，带肌蒂皮瓣移植法或尝试显微外科技术施行血管吻合，以提高耳廓完全离断伤的成活率。