TCR Vβ7.1基因转染外周血单个核细胞后表达及抗癌作用

目的研究TCRVβ7.1基因在恢复肝癌病人细胞毒性T细胞(CTL)功能方面的作用。方法以RTPCR方法扩增TCRVβ7.1基因并构建Vβ7.1-pLXSN表达载体。重组体以脂质体转染外周血单个核细胞(PBLs),流式细胞仪检测转染效率,DNALadder实验和透射电镜观察转染后T细胞诱导肿瘤细胞凋亡情况。结果TCRVβ7.1基因转染PBLs后可有效表达并诱导肿瘤细胞凋亡。结论该方法为T细胞介导的肿瘤基因治疗提供了有效途径。     

肺结核患者外周血记忆性T细胞及B细胞亚群的检测分析

摘要：目的探讨肺结核患者外周血记忆性T及B细胞亚群的表达水平。方法采用流式细胞仪检测肺结核患者（TB）、潜伏感染者（LTBI）、健康人（HD）外周血记忆性T、B细胞亚群水平及B细胞表达水平;利用Elispot技术检测外周血单个核细胞（PBMC）结核菌抗原特异性IFN-γ分泌水平。     

Wnt5a对成熟树突状细胞诱导初始性T细胞向记忆性T细胞分化的作用

目的:利用负载供者抗原的未成熟或成熟树突状细胞(imDCs或mDCs)体外诱导受者初始性T细胞(TNs)的活化、增殖和分化,并研究Wnt5a基因在这一过程中的可能的作用及其机制。方法:构建高表达Wnt5a基因的重组腺病毒,转染imDCs。建立同种异体小鼠皮肤移植模型,分选培养受体小鼠的imDCs,mDCs和T_Ns。在96孔板中用负载供者抗原的imDCs、转染腺病毒Ad/CMV/Wnt5a的imDCs、转染腺病毒Ad/CMV/LacZ的imDCs,和正常mDCs与记忆性T细胞(TMs)进行混合淋巴细胞反应。流式细胞术检测T_Ns向T_Ms分化的情况。ELISA检测共培养上清中IL-2,IL-10,IFN-γ细胞因子的浓度。RT-PCR检测T细胞中Wnt/β-catenin通路相关的基因表达情况。双荧光素酶报告基因检测混合淋巴细胞反应中T_Ns的β-catenin/TCF信号通路转录活性。结果:RT-PCR和免疫荧光检测发现mDCs中的Wnt5a的表达水平显著高于imDCs(P<0.05)。与负载供者抗原的mDCs相比,imDCs组可显著诱导T_Ns向T_Ms的分化,上调IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌(P<0.05)。双荧光素酶报告系统检测显示mDCs共培养TNs可显著增强β-catenin/TCF信号通路转录活性(P<0.05)。此外,imDCs通过转染高表达Wnt5a基因的重组腺病毒,也显著提高了其诱导TNs向T_Ms的分化的能力,同时也显著活化了Wnt/β-catenin信号通路(P<0.05)。结论 :在负载供者抗原的DCs与受者T_Ns混合淋巴细胞反应过程中,可诱导T_Ms分化形成,其中DCs的Wnt5a基因介导的T_Ns内β-catenin/TCF信号通路转录激活可能是其中一条重要的途径。     

树突状细胞对肿瘤特异性CTL体外激发、扩增及功能的作用研究

目的:研究凋亡肿瘤细胞负载的DCs联合细胞因子对T细胞体外激发、扩增及功能的诱导作用。方法:人B淋巴瘤细胞株Raji经顺铂(DDP)诱导凋亡，体外共育法负载DCS，DCs和T细胞体外共培养观察DC5对T细胞的效应，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析T细胞表型：ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-10的含量；溶血实验检测细胞毒性T细胞(CTL)产生穿孔素的能力；体外肿瘤杀伤实验分析CTL的特异性肿瘤杀伤作用。结果：凋亡肿瘤细胞负载联合CD40激发的DCs能有效地激发自体T细胞的体外扩增并诱导具有较特异杀伤肿瘤细胞作用的CTL。结论：凋亡肿瘤细胞负载的DCS在CD40信号的作用下对自体T细胞具有较强的激发和扩增效应．所获得的CTL对肿瘤细胞具有较特异的杀伤作用。     

TCR Vβ17．1基因转染外周血单个核细胞后表达及抗癌作用

目的研究TCR Vβ7．1基因在恢复肝癌病人细胞毒性T细胞(CTL)功能方面的作用。方法以RT-PCR方法扩增TCR Vβ7．1基因并构建Vβ7．1-pLXSN表达载体。重组体以脂质体转染外周血单个核细胞(PBLs)，流式细胞仪检测转染效率，DNA Ladder实验和透射电镜观察转染后T细胞诱导肿瘤细胞凋亡情况。结果TCR Vβ7．1基因转染PBLs后可有效表达并诱导肿瘤细胞凋亡。结论该方法为T细胞介导的肿瘤基因治疗提供了有效途径。     

Foxp3基因转染对人CD4+CD25-T细胞表型和功能的影响

目的探讨体外Foxp3基因表达对CD4^＋ CD25^-T细胞功能的影响。方法将编码人Foxp3基因全长的逆转录病毒表达载体,转染人外周血CD4^＋CD25^-T细胞。以流式细胞仪方法检测转染后CD4^＋CD25^-T细胞表面CD25、CDl27分子及CTLA4分子的表达变化,以流式细胞仪及RT—PCR检测Foxp3基因在转染细胞中的表达。体外刺激、观察转染后的Foxp3细胞的增殖反应,以及重组细胞对CD4^＋CD25^-T细胞增殖反应和细胞因子分泌的作用。结果转染后Foxp3基因在CD4^＋CD25^-T细胞中呈高水平表达。转染细胞表面CD25、CTLA4分子均呈高水平表达,而CDl27分子表达水平下降,且IL-2并不能诱导其增殖。转染细胞与CD4^＋CD25^-T细胞共同培养可有效抑制CD4^＋CD25^-T细胞的增殖反应及细胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ的分泌。结论Foxp3基因转染可有效诱导CD25及CTLA4分子表达,并使转染细胞具有调节性T细胞的功能。     

人IFN-β基因脂质体转染胶质瘤细胞对凋亡的诱导作用

目的:观察β-干扰素(IFN-β)基因脂质体pSV2IFN-β转染人胶质瘤细胞系SHG44及其转染后对SHG44细胞的凋亡诱导作用. 方法:应用MTT比色法检测脂质体pSV2IFN-β转染后转染组与对照组SHG44细胞增殖的差异;细胞免疫荧光染色检测脂质体pSV2IFN-β转染后,SHG44细胞IFN-β的表达情况. 应用流式细胞仪Annexin法检测脂质体pSV2IFN-β转染后SHG44细胞的凋亡情况,采用透射电镜观察肿瘤细胞凋亡的形态学改变. 结果:IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β转染SHG44胶质瘤细胞系后4 d和6 d时,对肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用,抑制率分别为16.7%和32.7%. 细胞免疫荧光法检测表明转染后胶质瘤细胞具有显著的IFN-β表达,流式细胞仪Annexin法检测表明转染组与对照组的凋亡率分别为66.8%与19.8%,两组相比具有显著差异(P＜0.01);透射电镜观察,发现有凋亡细胞存在,表现为细胞皱缩,染色质边集. 结论:IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β可转染SHG44胶质瘤细胞系,并对胶质瘤细胞的凋亡具有明显的诱导作用.     

急性T淋巴细胞白血病细胞系JM分泌抑制因子在体外对T细胞凋亡及细胞周期的影响

目的　研究急性 T淋巴细胞白血病细胞系 JM分泌的抑制因子 (TL SFJM)在体外对 T细胞凋亡及细胞周期的影响 .方法　以 TL SFJM作用于有丝分裂原 PHA、蛋白激酶 C(PKC)活化剂 PMA和同种异体抗原 (alloantigen)活化的人或小鼠 T细胞 ,应用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期 .结果　 TL SFJM在体外可诱导 PHA/IL - 2活化的小鼠胸腺细胞的凋亡 .TL SFJM在体外可诱导 alloantigen活化的人外周血单个核细胞 (PBMC)的凋亡 ,且把细胞周期阻遏在 G1期 .TL SFJM对 PMA诱导的人 PBMC活化抗原 CD2 5的表达无明显影响 ,也不引起凋亡 .结论　 TL SFJM在体外可诱导 PHA、alloantigen活化的 T细胞凋亡 .     

PADRE/MUC4 重组腺病毒转染树突状细胞诱导特异性CTL体外杀伤作用研究

目的:观察PADRE/MUC4重组腺病毒转染树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)及体外特异性杀伤作用.方法:pAd-CMV-PADRE/MUC4转染HLA-A2健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)来源的未成熟DC,TNF-α诱导成熟后与自体PBMC混合培养刺激3周,Cr51和Elispot实验检测CTL体外杀伤活性.结果:Cr51和Elispot检测结果显示PADRE/MUC4转染DC可以诱导产生特异性CTL,而pAd-CMV-GFP组和空白对照组不能产生有效特异性CTL.结论:腺病毒载体介导多表位嵌合基因(PADRE/MUC4)转染未成熟DC,在体外可以诱导产生特异性CTL,对表达MUC4肿瘤细胞具有杀伤效应.     

TLR9在非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞抗肿瘤免疫中的调控作用

目的 研究TLR9激动剂--含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血单个核细胞(PBMC)抗肿瘤免疫的影响.方法 分离36例NSCLC患者PBMC和肺癌细胞,RT-PCR检测TLR9 mRNA表达.PBMC分别经空白培养、不含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸(non-CpG ODN)和CpG ODN共培养72 h.3H-TdR掺入法测定PBMC增殖变化.流式细胞仪检测T细胞表面CD69分子变化、T细胞亚群比例以及CD8+T胞内IFN-γ和IL-4的表达.ELISA法测定PBMC上清液IFN-α的浓度,并评价抑制性ODN和氯喹对IFN-α产生的影响.分别以自体肿瘤细胞和K562细胞为靶细胞(T),以PBMC为效应细胞(E)流式细胞仪检测不同E/T时PBMC的细胞毒活性.结果 NSCLC患者PBMC表达TLR9 mRNA,其表达强度(0.76±0.09)与健康者(0.77±0.09)差异无统计学意义(t=0.00,P=1.00).CpG ODN诱导肺癌患者PBMC增殖(P<0.01),上调CD3+T细胞表面CD69分子表达(P<0.01),增加CD4+T/CD8+T比值(P<0.01),增强CD8+T产生IFN-γ的能力(P<0.01).CpG ODN促进PBMC分泌IFN-α(P<0.01),抑制性ODN和氯喹抑制CpG ODN诱导产生的IFN-α.CpG ODN增强PBMC对K562和自体肿瘤细胞的细胞毒活性(均P<0.01).结论 TLR9参与调控NSCLC患者的抗肿瘤免疫,TLR9的激活效应主要包括促进PBMC活化、增殖并诱导产生IFN-α,增加PBMC中CD4+T的比例并促进CD8+T分泌IFN-γ,增强PBMC对肿瘤细胞的细胞毒活性.     

晚期肺腺癌患者外周血T淋巴细胞亚群检测的临床意义

目的检测55例晚期肺腺癌初治患者治疗前外周血T淋巴细胞亚群的表达,并探讨其与培美曲塞联合顺铂方案化疗疗效间关系。方法采用流式细胞术检测经病理组织学或细胞学检查确诊的55例晚期肺腺癌初治患者治疗前外周血单个核细胞(PBMC)中总T细胞(CD3+)、Th细胞(CD3+CD4+)、Tc细胞(CD3+CD8+)、CD4+/CD8+、记忆T细胞(CD45RO+)、原始T细胞(CD45RA+)的比例。结果化疗无效组患者外周血原始T细胞高于有效组(P=0.04);化疗有效组患者外周血记忆T细胞较高,但差异尚不具统计学意义(P=0.25);两组总T细胞、Th细胞、Tc细胞及CD4+/CD8+无显著性差异。结论晚期肺腺癌患者外周血原始T细胞与化疗疗效相关,原始T细胞较高者近期疗效差。检测患者外周血原始T细胞对预测患者化疗疗效有一定的预测作用。     

高效抗逆转录病毒治疗对T细胞亚群上第二受体影响的研究

目的；研究高效抗逆转录病毒治疗(HAART)后T细胞亚群上第二受体的变化及其意义。方法：采用流式细胞仪检测CD4^ 、CD8^-、CD4^ CD45RA^ 以及CD4^ CD45RO^ 细胞表面CCR5及CXCR4的表达水平。结果：HIV感染后，第二受体在CD4和CD8以及记忆型和处女型CD4T细胞亚群上的表达水平，与正常对照没有显著性差异。HAART治疗仪能在一定程度上改变细胞表面的第二受体水平。结论：第二受体参与了HIV的致病过程，B期之前开始抗病毒治疗将有较好的疗效。     

氧化低密度脂蛋白干预记忆性CD8+T细胞亚群的分化

目的 探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对CD8+记忆性T细胞亚群分化的影响及其机制.方法 将雌性10周龄未发生糖尿病NOD小鼠随机分为2组(n=5):ox-LDL组及对照组.断颈处死各组小鼠磁珠分离脾脏CD8+T细胞体外培养(IL-2),ox-LDL组加入ox-LDL 30μg/mL体外刺激24 h,ox-LDL未处理组作为对照组.24 h后分离细胞.体外实验利用流式细胞仪检测各组以下指标:胞内CD8+IFN-γ+确定胰岛β细胞特异性杀伤性CD8+T细胞的比例;细胞表面分子CD8、CD44、CD62L确定CD8+记忆性T细胞的不同亚群分化;T细胞相关转录因子TCF-1及STAT-3的活化确定关键性转录因子的作用.体内实验中,将各组CD8+记忆性T细胞通过尾静脉注射的方法移植给未发病NOD小鼠,同时设立未移植的模型对照组,每5 d检测血糖1次,监测小鼠的血糖改变及生存率.结果 相比对照组,ox-LDL(30μg/mL)作用24 h后,胰岛β细胞特异性杀伤性CD8+T细胞活化减少[(0.7±0.03)%vs(2.7±0.14)%,P<0.01],记忆性T细胞中的效应记忆性T细胞形成数目减少[(10.3±0.71)%vs(30.3±1.36)%,P<0.01],干细胞样记忆性T细胞增加[(72.3±3.8)%vs(55.1±2.61)%,P<0.05].T细胞转录因子TCF-1及p-STAT-3活化的也受到抑制[TCF-1:(14.5±0.82)%vs(34.2±1.23)%,磷酸化STAT-3:(3.3±0.12)%vs(22.1±1.1)%,P<0.01].T细胞移植给未发病NOD小鼠后,ox-LDL处理组小鼠血糖升高明显低于对照组(P<0.05),且生存率提高(P<0.05).结论 ox-LDL干扰记忆性CD8+T细胞核转录因子TCF-1活化及STAT-3的磷酸化,抑制长效杀伤作用的效应性和记忆性CD8+T细胞形成,诱导干细胞样记忆性CD8+T细胞形成,从而阻止胰岛β细胞自身免疫损伤及□型糖尿病的发生.     

结核患者抗原特异性CD8~+记忆T细胞的检测分析

目的研究活动期肺结核患者和潜伏感染者CD8+记忆T细胞的产生及分布特性。方法 24例活动性肺结核患者均为确诊的住院患者,22例潜伏感染者经ELISPOT检查确定。取外周血分离获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),以结核分枝杆菌抗原ESAT-6刺激,通过CD8、CD107a、CCR7、CD45RA抗体共染色,采用流式细胞术分析。结果建立了基于CD107a为分子标识的结核抗原特异性CD8+T细胞检测方法。对24例活动性肺结核患者及22例潜伏感染者对比分析发现,与潜伏感染者相比,肺结核患者CD45RA阳性CD8+记忆T细胞TEMRA亚群比例显著增加[(59.94±3.87)%vs(46.65±2.88)%,P=0.020 3],CD8+效应记忆T细胞TEM亚群分布频率显著降低[(38.14±3.87)%vs(52.34±2.95)%,P=0.014 2]。结论肺结核患者与潜伏感染者抗原特异性CD8+记忆T淋巴细胞亚群的比例存在明显差异,可能与体内抗原刺激的程度及特异细胞免疫应答反应相关。     

多发性硬化患者外周血CD8+记忆性T细胞亚群效应细胞因子的表达及其与病情严重程度的相关性

目的 探讨多发性硬化患者外周血CD8+记忆性T细胞亚群效应细胞因子穿孔素和颗粒酶-B的表达及其与病情严重程度的相关性.方法 采用扩展的残疾状况量表(EDSS)对19例多发性硬化患者的病情进行评估,采用流式细胞仪和直接免疫荧光法检测其CD8+记忆性T细胞亚群的数量,同时选择20例健康体检者作为对照.结果 多发性硬化患者组CD8+效应记忆性T细胞和终末效应记忆性T细胞的数量均明显少于健康对照组,差异有显著性(P＜0.05).CD8+效应记忆性T细胞的数量与病情的严重程度呈负相关.结论 CD8+效应记忆性T细胞和终末效应记忆性T细胞的数量可作为一项评估多发性硬化病情严重程度的指标.     

HIV感染对记忆型和处女型CD4+T细胞上CD95的影响

目的：了解CD95在HIV感染者记忆型和处女型CD4^-T细胞表面的表达情况，探讨Fas／CD95在HIV感染中的作用。方法：采用流式细胞检测仅(FACS)对HIV感染者外周血CD4^ T细胞表面CD95、CD45RA、CD45RO的表达进行分析，用ENSA检测血清中Fas水平。结果：HIV感染后，血清Fas水平随疾病的进展而逐渐升高，同时伴有处女型T细胞表面CD95表达增高以及记忆型T细胞CD95表达逐渐下降。结论：Fas参与了HIV的感染过程。研究Fas和CD95、CD45RA、CD45RO之间的关系，可以加深对HIV致病机制的认识，并可了解疾病的进展情况和指导治疗。     

正常人PBMC中T细胞的PD-1表达及其表型分析

目的观察正常人外周血单个核细胞(PBMC)T细胞的PD-1表达,并对其表型进行分析。方法分离正常成年人PBMCs,利用流式细胞术检测CD4、CD8、CD45RA、CD27和PD-1等表面分子的表达;通过对比分析,了解PD-1+T细胞表型与记忆T细胞的关系。结果正常成年人周围血中CD4+PD-1+T细胞和CD8+PD-1+T细胞的平均表达水平为(8.71±3.97)%,CD8+PD-1+T细胞的频率为(2.44±0.76)%。正常人外周血CD4+PD-1+T细胞可分成3个亚群,即初始T细胞(CD45RA+CD27+T细胞)、中央记忆型(CD45RA-CD27+)T细胞和效应记忆型(CD45RA-CD27-)T细胞,其比例分别为(18.5±8.79)%、(65.0±13.84)%和(15.5±5.12)%,而在CD4+PD-1-T细胞中3种T细胞的比例分别为(68.25±10.33)%、(27.75±9.04)%和(3.0±1.22)%。结论正常人周围血中存在CD4+PD-1+T细胞,并且多为中央记忆T细胞,而CD4+PD-1-T细胞则多为初始T细胞。     

结核患者外周血αβT和γδT细胞亚群免疫亚型细胞分布的探讨

目的:检测健康成人和结核患者外周血αβT细胞亚群以及γδT细胞亚群分布情况.方法:采集健康成人及结核病患者外周血,用不同荧光素标记单抗染色后,用流式细胞术检测 αβT细胞免疫亚型CD45RA+CD27+初始型细胞(Tnaive)、CD45RA-CD27中央记忆型T细胞(Tcm)+、CD45RA-CD27-效应记忆型T细胞(Tem)和CD45RA+CD27-效应型T细胞(Teff);γδT细胞中Vδ1、Vδ2、Vδ1-Vδ2-(即Vδ3-8)4种免疫亚型的百分率.结果:与健康成人比较,结核患者CD4+αβT细胞中Tnaive、Teff细胞的百分率降低(P<0.01),Tem细胞的百分率升高(P<0.01),Tcm细胞差异无统计学意义(P>0.05).结核与健康成人比较,患者CD8+αβT细胞中Tnaive、Tcm细胞的百分率降低(P<0.01和P<0.05),Tem、Teff细胞的百分率升高(P<0.01).与健康成人比较,结核患者Vδ1γδT细胞中Tnaive、Tcm细胞的百分率降低(P<0.05),Tem细胞的百分率升高(P<0.05),Teff细胞差异无统计学意义(P>0.05);结核患者Vδ2γδT细胞中Tcm细胞的百分率降低(P<0.05),Tem、Teff细胞的百分率升高(P<0.05,P<0.01),Tnaive细胞差异无统计学意义(P>0.05);结核患者Vδ3-8γδT细胞中Tem细胞的百分率升高(P<0.05),Tnaive、Tcm、Teff细胞差异无统计学意义(P>0.05).结论:结核病患者外周血中αβT和γδT细胞亚群分布均有显著改变.     

小儿传染性单核细胞增多症患者外周血CD45RO＋、CD45RA＋T淋巴细胞亚群表达的研究

目的探讨传染性单核细胞增多症（IM）患儿CD4＋T辅助淋巴细胞CD4＋CD45RO＋和CD4＋CD45RA＋T淋巴细胞亚群的变化.方法用流式细胞术检测了30例活动期IM、急性期及恢复期患者CD4＋T辅助细胞CD45RO、CD45RA的表达率,并与对照组进行了比较.结果 IM患者急性期与对照组相比CD4＋CD45RO＋明显增高（P〈0.05）,CD4＋CD45RA＋明显对低于对照组（P〈0.05）;恢复期CD4＋CD45RO＋与急性期比较明显降低（P〈0.05）,但仍高于正常对照组（P〈0.05）;CD4＋CD45RA＋与急性期相比明显升高（P〈0.05）,但仍低于对照组（P〈0.05）.结论 CD4＋CD45RO＋和CD4＋CD45RA＋T淋巴细胞在IM患者的细胞免疫中起重要作用,CD45RA＋T辅助细胞减少是导致机体免疫功能失去平衡的重要原因.     

应用四色荧光分析技术测定造血干细胞移植后患者CD45RA+细胞的变化

目的探讨流式细胞技术测定造血干细胞移植(HSCT)后患者外周血中初始T细胞CD45RA 的变化与临床意义。方法收集来自南方医院的49例造血干细胞移植病人的移植前、移植之后15、30、90和180 d不同时间点的90份肝素抗凝外周血标本。应用流式细胞技术测定外周血CD4 CD45RA /CD8 CD45RA 细胞数的动态变化。结果在49名造血干细胞移植患者外周血标本中选择90份样本进行检测,移植后30 d,CD8 CD45RA 细胞即能恢复到正常水平,而CD4 CD45RA 细胞产量半年之内仍低于正常并持续缓慢增长。经HSCT患者的胸腺再生输出功能明显低于自体干细胞移植患者(P<0.01)。异体外周血干细胞移植患者的胸腺恢复能力显著比异体骨髓移植患者更快(P<0.05)。结论通过流式细胞仪检测患者外周血中CD4 CD45RA / CD8 CD45RA 细胞的变化,可以相对定量地检测患者的胸腺再生输出功能,并通过测量新生T细胞的合成来监视胸腺功能在免疫重建中的作用,为临床干细胞移植治疗提供有力的数据。