结核分枝杆菌毒素蛋白 higB 的原核表达及分析

目的：克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a（＋）-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32 a（＋）质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达载体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的 构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（Early secretory antigenic target，ESAT-6）基因的pET原核表达载体，诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因，产物通过双酶切克隆入pET-32a（＋）质粒，经PCR、酶切、测序等方法鉴定后，转入大肠杆菌BL21菌体中哪诱导表达，并经镍柱纯化、Western—blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致；表达融合蛋白分子量约25kDa，并能与特异性单抗结合，具有一定活性。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌复苏因子D的克隆及测序分析

目的 克隆结核分枝杆菌Rv2389c基因.方法 常规方法提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA,PCR扩增结核分枝杆菌Rv2389c基因,经内切酶酶切、胶回收,将片段亚克隆到T载体中,转化至DH5α.以PCR鉴定的阳性菌落转至LB中培养,菌液进行质粒提取、酶切、胶回收,回收片段再克隆至表达载体pET30a中,转化至DH5α中.PCR阳性菌落转至LB中培养,测序确定插入片段的正确性.结果 构建了Rv2389c重组表达质粒PET30a-Rv2389c.结论 成功克隆了结核分枝杆菌复苏因子Rv2389c基因.     

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（Early secretary antigenic target，ESAT-6）基因的pET原核表达载体，诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因，产物通过双酶切克隆入pET-32a（＋）质粒，经PCR、酶切、测序等方法鉴定后，转入大肠杆菌B121菌体中IPTG诱导表达，并经镍柱纯化、Western．blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致；表达融合蛋白相对分子质量约2．5Xlo＇，并能与特异性单抗结合，具有一定免疫学活性。结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌fbpB基因植物表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌fbpB基因的植物表达载体,为在植物中表达该基因奠定基础。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增fbpB编码基因,然后将其克隆到植物表达载体pBI121上,并进行鉴定。结果:重组载体经菌液PCR鉴定为阳性克隆后再经双酶切鉴定可见约13kb和1kb的2条特异性条带,与预期大小相一致,测序结果表明克隆的fbpB基因序列与Genbank上公布的相一致。结论:成功构建了fbpB基因的植物表达载体,为研制和开发新型的结核疫苗打下坚实的基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85A真核表达质粒的构建与鉴定

目的：构建结核分枝杆菌Ag85A重组真核表达质粒，为DNA疫苗的研究提供靶基因。方法：采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出结核杆菌Ag85A分泌性蛋白的基因，应用T-A克隆技术，直接与pUCan-T载体连接，转化大肠杆菌JMl09(E．coli JMl09)，蓝白筛选，阳性克隆经酶切鉴定和DNA测序证实基因碱基无误后，用NheⅠ和XbaⅠ双酶消化，回收的小片段与用NheⅠ和XbaⅠ消化的真核表达质粒pCI-neo连接，转化E.coli JMl09，筛选阳性克隆酶切鉴定。结果：经酶切鉴定，证实结核分枝杆菌重组真核表达质粒pCI-Ag85A构建正确。结论：结核分枝杆菌真核表达质粒pCI-Ag85A构建成功，为进一步研究其作为一种结核病DNA密菌在预防和治疗结核病中的作用奠定了基础。     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

凋亡素原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的 构建凋亡素基因的原核表达载体,进行表达并制备表达蛋白的多克隆抗体.方法 构建凋亡素 pGEM-T/Apoptin载体,并将凋亡素基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白.用表达蛋白常规免疫Balb/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度.结果 凋亡素基因被成功的克隆至pET-28a(+),表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与预期结果一致,Balb/c小鼠经5次免疫后,得到了滴度为1:5×10~5血清抗体.结论 凋亡素原核表达载体的成功构建和多克隆抗体的制备为进一步研究凋亡素的功能和凋亡素的应用研究奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a prokaryotic expression vector for apoptin and prepare polyclonal antibody of apoptin.Methods Apoptin gene amplified from pGEM-T/Apoptin plasmid by PCR was cloned into pET-28a(+).E.coli BL21(DE3) was transformed by the recombinant plasmid,and apoptin protein expression induced by IPTG was analyzed by SDS-PAGE.BALB/c mice were immunized with the protein and the titer of the antibody was determined using indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results Apoptin gene was successfully cloned into pET-28a(+),and the expression of a protein with relative molecular mass of about 17 000 was identified by SDA-PAGE.After 5 immunizations of the mice with the protein,the blood antibody titer reached 1:5×10~5.Conclusion The prokaryotic expression vector for apDptin is successfully conslructed and the polyclonal antibody of apoptin is Obtailled.which allows further functional study of apoptin.     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的原核表达重组质粒pET-amastin.方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-amastin.结果:扩增出大小约550 bp的无鞭毛体蛋白基因,重组质...     

转录因子Oct-4基因的克隆和原核表达

目的克隆转录因子Oct-4基因、构建原核表达载体。方法从人胚胎标本中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Oct-4基因的cDNA,再通过基因重组技术将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,纯化后SDS-PAGE分析表达产物。结果电泳证实RT-PCR扩增产物与预期长度一致,测序结果与GenBank公布的Oct-4基因序列一致较好,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量47KD左右出现目的蛋白表达条带。结论成功构建了pET-Oct-4原核表达载体,表达并纯化出Oct-4蛋白,为进一步研究Oct-4蛋白打下了实验基础。     

小鼠周脂素基因的原核表达及纯化

目的构建小鼠周脂素（prilipin,Plin）原核表达载体,表达周脂素蛋白并进行初步纯化,为研究周脂素的功能奠定基础。方法通过酶切从pMD18-Plin重组载体上酶切下周脂素目的基因,定向插入原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果构建的pET-32a-Plin载体能够表达周脂素重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的50%,经初步纯化后,纯度达95%以上。结论成功构建了周脂素原核表达载体,并在原核系统中表达了重组蛋白,纯化的蛋白纯度较高,可用于后续试验。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

hPSF蛋白的原核表达质粒的构建及分析鉴定

目的:构建hPSF蛋白原核表达质粒,在体外观察其与GAGE6调控区结合现象。方法:从人成纤维细胞中提取总RNA,利用hPSF特异性引物通过RT-PCR方法扩增hPSF cDNA编码序列,克隆入pET-28a载体中,构建重组载体pET-28-hPSF。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE分析在相对分子质量约100kD处出现了1条蛋白条带,免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达hPSF蛋白。结论:成功构建了hPSF原核表达载体,并能够在大肠埃希菌中有效表达hPSF,为进一步研究hPSF的生物学作用奠定了基础。     

融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建人类regucalc in重组原核表达载体。方法用RT-PCR的方法从人类肝癌细胞系HepG2中扩增出regucalc in基因cDNA序列,应用T克隆载体及pET-32 a(+)表达载体后,将质粒转化进入原核表达菌株进行表达。结果表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,在45 000处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建融合表达载体Pet-regucalc in,并在原核细胞中表达出人类regucalc in-H is融合蛋白。