抗2型登革病毒M蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的 克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因片段,在pET-32a(+)表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用于免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力.结果 获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6和Ⅲ3D2;相对亲和力均在105 以上.Westernblot显示2株mAb能特异识别重组M蛋白.结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒M蛋白的2株mAb,为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具.     

抗重组幽门螺杆菌VacA单克隆抗体的制备

目的 制备抗重组幽门螺杆菌致细胞空泡毒素抗原(VacA)的单克隆抗体(mAb).方法 用基因工程菌pQr30-v-DH5α大最表达重组蛋白VaeA,经Ni2+-NTA树脂纯化后,Western blot鉴定抗原性,免疫家兔后ELISA法检测血清VacA抗体鉴定其免疫原性.用重组vacA免疫Balb/c小鼠.取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/O细胞融合,HAT选择性培养和间接EIJSA进行筛选,并检测所分泌抗体的效价和分析Ig类别.结果 获得4株能稳定分泌VacA mAb的杂交瘤细胞,能分泌IgG2b、lgM和IgG1 3类抗体,轻链均为k型.其中,IgG1 mAb经Western blot鉴定能与重组VacA发牛特异性反应.结论 应用纯化的重组VacA,成功获得了能稳定分泌幽门螺杆菌VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备了单克隆抗体.为进一步研制检测VacA的试剂盒及探讨VacA的致病机制奠定了基础.     

抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人骨桥蛋白(hOPN)的单克隆抗体(mAb),用于其功能研究.方法:构建OPN的原核表达载体pTriEx-1-hONP载体,转化Tuner(DE3)placI感受态大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达.利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白,纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原.以重组纯化的OPN蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/O进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性,并用免疫组化方法检测了正常月经周期子宫内膜OPN的表达.结果:pTriEx-1-hONP表达的OPN蛋白主要为可溶性形式,经镍柱纯化后,蛋白纯度可达85%以上.纯化的OPN重组蛋白免疫小鼠后经融合筛选,得到2株稳定分泌抗人OPN的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和587,两株mAb的免疫球蛋白亚类分别IgG1和IgG2a.通过ELISA和Western blot等方法鉴定,抗OPN的mAb能与OPN蛋白特异性结合.通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的OPN的检测表明,子宫内膜腺上皮在增生期、分泌早期,OPN呈弱阳性表达;分泌中、晚期OPN呈强阳性表达.结论:以纯化的重组hOPN为免疫原成功制备了鼠抗hOPN的mAb,并初步进行了应用,为研究hOPN的功能打下了良好基础.     

抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)M蛋白N端1~43氨基酸(aa)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb。用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株。Westernblot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性,并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAbIg亚类。为分析mAb识别位点,进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达,以Westernblot初步定位mAb识别位点。结果:获得1株可分泌特异性抗SARS-CoVM蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株(3H9),Ig亚类鉴定为IgG2a,轻链为κ型。Westernblot显示其mAb可特异识别SARS-CoVM蛋白N端1~43aa,间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应,其识别位点位于M蛋白N端16~28aa。结论:成功获得1株抗SARS-CoVM蛋白N端1~43aamAb杂交瘤细胞,并初步定位其识别位点。     

抗SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的:研制抗SARSCoVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的GSTN免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗SARSCoVN蛋白mAb;用免疫双扩散鉴定Ig亚类;Westernblot和免疫组化鉴定mAb的特异性;间接ELISA检测mAb的腹水效价、相对亲和常数。结果:获得1株可分泌特异性mAb的抗SARSCoVN蛋白的杂交瘤细胞系3E10H,Ig亚类为IgG2b;其腹水效价为8×10-5;其相对亲和力1.725×10-10mol/L,Westernblot和免疫组化阳性。结论:获得特异性抗SARSCoVN蛋白的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

目的: 制备人核迁移蛋白(hNudC )的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性.方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET-28b/hNudC, 表达带有6-His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性.结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(ê) , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶ 64和1∶ 32; 腹水mAb的效价分别为1∶ 1×105和1∶ 5×104.mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg-01和人脐带血来源的CD41 巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白.结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础.     

河南华溪蟹金属硫蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备小鼠抗河南华溪蟹金属硫蛋白(MT)单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法分别利用小泛素样修饰蛋白(SUMO)融合表达系统和碱性磷酸酶(phoA)分泌表达载体制备河南华溪蟹重组蛋白SUMO-MT和His-MT,以SUMO-MT为免疫抗原、His-MT为检测抗原,利用杂交瘤技术建立抗河南华溪蟹MT mAb杂交瘤细胞株。采用间接ELISA测定mAb腹水效价,Western blot法、Dot-ELISA分析mAb的特异性。结果成功建立了2株稳定分泌抗MT蛋白的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为mAb-MT2和mAb-MT3,均属于IgG1亚类。腹水效价分别为1∶500 000、1∶1000 000,Western blot和Dot-ELISA结果证实2株mAb均能特异性识别重组MT和内源性MT。结论成功制备了具有较高特异性的河南华溪蟹MT mAb。     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

Mucin 16蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备与鉴定

目的:在原核生物中表达带有His标签的mucin 16N端重组蛋白(简称为His-mucin 16N),制备抗mucin 16的单克隆抗体(mAb)。方法:将mucin 16基因片段插入原核表达载体pET-32,在大肠杆菌中表达重组蛋白,用亲和纯化方法纯化后免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合。筛选可稳定分泌抗mucin 16抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞株,用Westernblot、ELISA、免疫荧光和免疫组化等方法分析和鉴定抗mucin16的mAb。结果:表达并纯化了His-mucin 16N蛋白;筛选出几株可稳定分泌特异性抗人mucin 16 mAb的细胞株;挑选出效价高、特异性好的1株进行纯化。获得的抗mucin 16 mAb,可用于Western blot、ELISA、免疫组化、免疫荧光等检测,并鉴定该抗体亚型为IgG1。通过上述免疫学实验,分析了在不同肿瘤细胞中mucin 16的表达情况。结论:在原核生物中成功表达和纯化带His标签的mucin 16N重组蛋白,制备出具有高特异性的抗mucin16的mAb。     

抗O型口蹄疫病毒VP1单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗O型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白VP1的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：以自行构建表达的O型FMDV—VP1表位重组蛋白（VP1epi）为抗原免疫BALB／c小鼠，按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用Western blot、间接ELISA和斑点免疫测定法对mAb的特异性进行鉴定。结果：成功地获得1株分泌抗VPlepi重组蛋白mAb的杂交瘤细胞株“C7”，其分泌的mAb为IgG1亚类，能特异性地识别VP1epi重组蛋白，其腹水效价可达1：12800。斑点免疫测定法显示，该mAb能很好地识别灭活的FMDV。结论：VP1epi重组蛋白可代替FMDV制备抗天然FMDV—VP1的mAb。抗O型FMDV—VP1 mAb的成功制备，为进一步研究开发新型FMDV的检测方法奠定了基础。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶Dusp23单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶23（Dusp23）单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp23功能的研究奠定基础。方法以纯化的原核表达Dusp23为免疫原,免疫BALB／c小鼠。待免疫小鼠血清效价满足融合需要,取其脾细胞与Sp2／0细胞融合,经多次筛选及克隆化建立可稳定分泌抗Dusp23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将细胞株打入BALB／c小鼠腹腔制备腹水,用ProteinG亲合层析柱纯化所得腹水获得纯化抗体,ELISA及Western—blot检测抗体的效价和亲和力,并用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。利用纯化后的两株单克隆抗体对临床收集的肝癌组织标本进行免疫组化分析。结果筛选到2株（N012和N013）可以稳定分泌人双特异性磷酸化酶23（Dusp23）单克隆抗体的细胞株,并对其进行纯化和鉴定,两株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：5120和1：2560,腹水效价分别为1：25600和1：12800,以肝癌细胞HepG2和重组Dusp23蛋白为抗原,利用纯化后的两株抗体Western-blot鉴定结果均在预期位置出现阳性条带。两株杂交瘤细胞分泌抗体的亚型鉴定N012和N013均为IgG1型,轻链均为K型。两株抗体分别与临床肝癌组织标本免疫组化结果均为阳性。结论成功制备两株能特异性识别Dusp23的单克隆抗体,为进一步研究Dusp23的生物学功能,揭示其与肿瘤发生发展之间的关系奠定了基础。     

骨桥蛋白单克隆抗体的制备及其特异性分析

为了研制骨桥蛋白(OPN)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性。本研究在毕赤酵母中表达具有良好免疫原性的重组人OPN蛋白的基础上,用重组人骨桥蛋白(rhOPN)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选杂交瘤细胞,并结合免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别的抗原位点进行分析。结果共获得4株能够识别OPN不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,3株为IgG1,1株为IgG2a。这些mAb能与重组人OPN特异性结合。本研究的四株抗体中,只有4G2B5能够检出与肿瘤转移密切相关的OPN-c的条带,预示该抗体可用于判断肿瘤预后和高转移肿瘤的临床检测。本研究成功获得了针对骨桥蛋白的特异性mAb,同时为进一步研究OPN蛋白的结构和功能提供了重要工具。     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B(GPA/GPB)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用人“O”型血红细胞作为免疫源,免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,用谱红细胞筛选阳性克隆;采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价。分别用快速定性试纸和酶处理红细胞检测mAb的Ig亚类及抗原表位。用Western blot鉴定抗GPA/GPB mAb的特异性。结果:获得4株分泌抗M、1株抗N及3株抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞培养上清mAb的效价介于1×2-4~1×2-8之间,腹水mAb的效价在1×2-7~1×2-12之间。除1株mAb 1C1C9C4为IgM外,其他7株mAb均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAb抗原表位的检测,确定4株和1株mAb可分别特异性结合于GPA的M、N抗原表位;另3株mAb 6D7C9、7C9H4和7C9G11与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,均可结合GPA、GPB蛋白。结论:成功地建立了4株分泌抗M、1株分泌抗N及3株分泌抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株,可用于MNSs血型系统的研究及鉴定,并为制备双功能抗体用于病毒、肿瘤疾病的诊断和治疗打下了坚实的基础。     

人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

抗rhEPO单克隆抗体的制备及初步应用

目的 :研制抗人促红细胞生成素的特异性单克隆抗体 (mAb) ,对其生物学特性进行初步鉴定 ,并用于转基因羊乳中重组人促红细胞生成素 (rhEPO)的提纯。方法 :以自制的rhEPO粗品免疫BALB/c小鼠 ,制备抗rhEPO的mAb。以Westernblot和间接ELISA法 ,对所获mAb进行初步鉴定。以纯化的mAb同预活化的Sepharose 4B偶联 ,制得mAb亲和层析柱 ,并用于转基因羊乳中rhEPO的提纯。结果 :获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞株 (1E7和 2E6 )。Ig亚类 (型 )的鉴定分别为IgG1和IgG2b ,轻链均为κ型。用Westernblot证实 ,获得的mAb可特异性地识别rhEPO。用自制的免疫亲和层析柱用于转基因羊乳中rhEPO的提纯 ,具有很好的吸附作用 ,回收率达 70 %。结论 :成功地获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞。用自制的免疫亲和层析柱提纯转基因羊奶中的rhEPO具有较高的吸附效率     

抗Ⅳ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制Ⅳ型登革病毒(DENV-4)非结构蛋白1(NS1)特异性的单克隆抗体(mAbs),并鉴定其特异性。方法:在表达具有良好抗原性的重组DENV4-NS1蛋白的基础上,用重组DENV4-NS1蛋白和灭活的DENV-4免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光测定法(IFA)和Western blot分析对mAb的特异性进行鉴定;通过竞争抑制试验对mAb识别的抗原位点进行分析。结果:获得15株特异性针对DENV4-NS1的mAbs,与其他3型DENV的NS1不产生交叉反应。mAb的Ig亚类测定均为IgG1。竞争抑制试验显示,15株mAbs存在2个不同识别抗原位点。结论:成功地获得特异性针对DENV4-NS1蛋白的mAbs,为进一步研究DENV4-NS1蛋白的结构与功能及研制DENV-4的临床诊断试剂奠定了基础。     

抗人LSECtin单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗肝脏、淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:采用原核表达的LSECtin免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,采用蛋白印迹、间接免疫荧光、流式细胞术和免疫组化染色法鉴定mAb的特异性。结果:共获得8株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。mAb的Ig亚类均为IgG,效价达1∶106~1∶107。这些mAb均可识别转染3T3细胞膜上的人LSECtin,6株mAb可特异识别肝脏窦内皮细胞。结论:成功地制备8株抗LSECtin的mAb,经免疫印迹、流式细胞术和免疫组化染色检测,这些mAb的特异性良好,为研究LSECtin的功能提供了有力的试剂。     

诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

目的:建立能稳定分泌抗诺如病毒(Norovirus)N蛋白的单克隆抗体(mAb)细胞株, 制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb, 为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料.方法:用E.coli表达的GⅡ组广州株NVgz01(DQ369797)Norovirus-N蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 使用HAT选择性培养基培养融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对.结果:通过细胞融合和克隆化, 共筛选出4株分泌抗Norovirus-N蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9.间接ELISA和Western blot检测结果表明, 这4株mAb都可以与E.coli表达的GⅡ组广州株Norovirus-N蛋白产生特异性反应, 并且能与天然粪便标本中的GⅡ组Norovirus产生特异性反应.配对结果显示N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度.结论:获得了诺如病毒GⅡ组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础.     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。