人类14-3-3ζ和GCH1蛋白相互作用的初步研究

目的 寻找人类14-3-3ζ蛋白的相互作用蛋白,为进一步揭示14-3-3ζ的作用机理提供线索.方法 以14-3-3ζ为"诱饵",利用酵母双杂交系统筛选人脑cDNA文库得到"猎物"蛋白,通过GST pulldown技术和哺乳动物细胞内免疫共沉淀技术验证14-3-3ζ和"猎物"蛋白的特异性结合.结果 首次利用酵母双杂交cDNA文库筛选技术发现了14-3-3ζ能够与GTP环化水解酶Ⅰ(GTP cyclohydrolase 1,GCH1)相互作用,并通过了体内和体外的蛋白质结合实验证实了这两个蛋白质之间的特异性相互作用.结论 发现并验证了14-3-3ζ与GCH1之间的蛋白质相互作用,为进一步深入研究这两种蛋白质的功能及所引起的相关疾病的发病机理提供了新的线索.     

原癌基因LMO3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 通过筛选LMO3的相互作用蛋白,进一步了解LMO3的作用及可能机制.方法:酵母双杂交方法 筛选LMO3相互作用蛋白,并通过酵母结合试验、免疫共沉淀及荧光共定位等进行验证.结果:在初步获得相互作用蛋白CIB的基础上,在酵母中证实了LMO3与CIB的相互作用,并通过酵母结合试验确定了CIB与LMO3的相互作用位点,发...     

hCDC14A与BRAP2相互作用的初步研究

目的： 筛选hCDC14A(human cell division cycle gene 14A)的相互作用蛋白，探索功能联系。方法： 酵母双杂交筛选hCDC14A的可能相互作用蛋白，Pulldown实验和免疫共沉淀实验验证蛋白质间相互作用，免疫荧光显微镜观察目的基因在细胞中的表达和定位，体内泛素化实验提示可能的相互作用机制。结果： 酵母双杂交筛查到BRAP2(BRCA1 associated protein 2)为hCDC14A的可能相互作用蛋白，两者有共同定位，BRAP2可以增强hCDC14A的泛素化修饰。结论： BRAP2可以与hCDC14A相互作用，可能是hCDC14A的泛素连接酶。     

NALP3富含亮氨酸重复序列结构域识别人细胞周期蛋白H和禽冠状病毒蛋白

 目的：寻找与NALP3富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat, LRR）结构域相互作用的蛋白质分子。方法：克隆NALP3富含亮氨酸重复序列（NALP3-LRR）结构域的DNA序列并经测序检验。应用酵母双杂交技术,构建以NALP3-LRR结构域为诱饵基因的酵母双杂交载体,对人胚肺cDNA文库进行杂交筛选,经酵母回交实验验证蛋白质在酵母细胞内的相互作用并对阳性克隆的DNA进行序列测定和生物信息学分析。将筛选到的阳性克隆进一步用免疫共沉淀实验验证NALP3-LRR结构域与阳性蛋白之间相互作用的可靠性。结果：成功克隆NALP3-LRR结构域的DNA序列并经测序检验正确。用酵母双杂交技术对人胚肺cDNA文库进行酵母杂交筛选共获得4个阳性克隆。免疫共沉淀实验证实能与NALP3-LRR结构域发生相互作用的阳性蛋白是人细胞周期蛋白H和禽传染性支气管炎病毒株Cal99的ORF1a。结论：NALP3的富含亮氨酸重复序列结构域能与人细胞周期蛋白H和禽冠状病毒蛋白发生相互作用。     

α1A-肾上腺素受体与骨形成蛋白-1的相互作用研究

目的 :在α1-AR 3种亚型中 ,α1A-AR的效应最强、功能最广泛 ,但原因一直不明 ,有研究者认为“非G蛋白”可能是一种参与因素。方法 :本研究采用酵母双杂交方法 ,以α1A-AR的细胞内游离C末端 (32 2 - 4 6 6aa)作为诱饵 (bait) ,在酵母细胞中对预转化的人脑cDNA文库进行筛选。对筛选出的克隆进行测序 ,采用免疫共沉淀和免疫荧光等方法在HEK2 93细胞中进一步观察“非G蛋白”与α1A-AR相互作用。结果 :(1)在酵母双杂交实验中 (Y187酵母细胞 ) ,筛选出骨形成蛋白 1片段与α1A-AR细胞内游离C末端 (32 2 - 4 6 6aa)结合 ,但不与α1B-AR…     

应用酵母双杂交系统筛选Foxp3△2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人外周血白细胞cD-NA文库中筛选与转录因子Foxp3相互作用的蛋白,为进一步研究Foxp3的转录调控机制奠定基础。方法:首先构建pG-BKT7-Foxp3△2酵母双杂交诱饵载体,转化AH109酵母细胞,检测其毒性及自激活作用;然后将诱饵质粒与人外周血白细胞cDNA文库共转AH109酵母细胞,筛选了与Foxp3△2存在相互作用的蛋白。结果:成功构建了pGBKT7-Foxp3△2酵母表达载体,经转染AH109酵母细胞,无有毒性,无自激活作用。获得了40个阳性克隆,经生物信息学分析,其中9个具有开放读框。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一组可与Foxp3△2相互作用的候选蛋白,为进一步研究Foxp3△2功能奠定了基础。     

14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质和PC12细胞中的分布

本实验采用免疫组织化学、免疫荧光组织化学和免疫印迹技术对14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质(SN)和PC12细胞中的分布情况进行了研究。在大鼠黑质内,免疫组化和免疫荧光结果显示14-3-3蛋白的γ、ε、θ、ζ四个亚型呈阳性反应,而β和η亚型未见明显阳性反应;在PC12细胞中,6个亚型均呈免疫荧光阳性反应;在黑质中,Westernblot结果显示14-3-3各亚型蛋白表达的相对水平为ε>γ>ζ>θ;而在PC12细胞中各亚型的表达水平为γ>ε>β>ζ>η>θ。本实验的结果提示ε、γ、ζ和θ亚型可能在黑质中发挥主要作用。本研究的结果为研究14-3-3蛋白在Parkinson病中的作用提供了形态学依据。     

NMDA受体亚单位NR2D与MOCA相互作用的鉴定

目的:寻找N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2D的结合蛋白,为探讨NR2D在视网膜兴奋性毒性损伤中的作用提供依据。方法:构建了包含NR2D细胞内C末端的cDNA片段为诱饵质粒,应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库,并用免疫共沉淀实验进一步验证NR2D与其结合蛋白之间的相互作用,免疫荧光显微镜观察NR2D和目的蛋白在视网膜中的共表达。结果:酵母双杂交筛选到细胞黏附修饰因子(modifier of cell adhesion,MOCA)为NR2D可能的相互作用蛋白,两者在视网膜有共定位。结论:MOCA能特异结合谷氨酸受体NR2D,这为进一步研究谷氨酸的兴奋性毒性参与视网膜退行性变的机制奠定了实验基础。     

14-3-3ζ蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

为了探讨14-3-3ζ蛋白在中枢神经系统内的分布,本文采用纯化的基因重组型14-3-3ζ蛋白免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗14-3-3ζ蛋白单克隆抗体;Western blot及免疫组织化学法鉴定抗体。结果显示:制备的单克隆抗体能特异性识别基因重组14-3-3ζ蛋白和大鼠脑匀浆32kD蛋白。免疫组化染色结果显示,14-3-3ζ蛋白在大鼠中枢神经系统广泛分布,在皮层、海马、杏仁核和基底前脑的免疫阳性染色较强,免疫阳性产物位于神经元胞浆内。本研究结果提示,14-3-3ζ蛋白可能具有多样化的生理功能。     

14-3-3zeta在T1期非小细胞肺癌中的表达及其临床病理意义

目的探讨14-3-3ζ在T1期非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其临床病理意义。方法采用免疫组化、免疫印迹及RT-PCR技术检测110例T1期NSCLC及癌旁正常肺组织中14-3-3ζ蛋白的表达。结果 T1期NSCLC中14-3-3ζ蛋白及mRNA表达水平均较正常肺组织明显增强,14-3-3ζ的表达与患者的年龄、性别及病理学分型不相关。但随着肺癌分化程度的降低,14-3-3ζ的表达逐渐增强。在淋巴结转移阳性的癌组织中,14-3-3ζ表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。生存曲线分析结果显示14-3-3ζ表达阴性患者的5年生存率及平均生存时间均高于表达阳性者。结论 14-3-3ζ与肺癌的分化程度、淋巴结转移及患者预后密切相关,提示14-3-3ζ有可能作为判断T1期NSCLC发展与预后的生物学指标之一。     

14-3-3蛋白的研究进展

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族,主要以同源/异源二聚体形式存在,通过磷酸化丝/苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的2个结构域结合。7种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在信号转导途径中发挥调控作用。     

14－3－3蛋白的新认识

14-3-3蛋白是一个在真核生物中广泛表达的高度保守的酸性蛋白家族,主要以同源/异源二聚体形式存在,在哺乳动物中由7种亚型组成。7种不同亚型的14-3-3蛋白在人类细胞中发挥着重要作用。本文就14-3-3蛋白的序列保守性和独特性、结构特征、结合靶点、调控机制以及作为潜在药物治疗靶点的相关研究进展做一综述。     

蛋白14-3-3蛋白亚型与癌症

14-3-3蛋白家族在真核细胞中广泛表达且高度保守,据报道其与心血管疾病、神经元损伤、帕金森病以及支气管哮喘等疾病有关联,近年来研究发现14-3-3蛋白与癌症的发生和发展也密切相关,而涉及的癌症包括胆管癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、口腔癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、卡波济肉瘤、脑膜癌、直肠癌、星形细胞瘤等几乎所有常见癌症。14-3-3蛋白对癌症增殖、转移、凋亡以及耐药等影响作用已经得到证实,其调控机制也得到部分揭示,并且已合成了影响14-3-3蛋白与其他蛋白相互作用的特异小分子阻断药物。人体内的14-3-3蛋白家族包含β,ε,γ,η,θ(τ),ζ和σ7种亚型,不同亚型有不同的组织定位和功能。阐明各亚型在不同肿瘤中的分布、作用及其调控机制,对我们进一步认识和治疗癌症均有一定的指导意义。     

14-3-3 Protein isoforms and atypical patterns of the 14-3-3 assay in the diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease

A positive 14-3-3 assay is a criterion for probable Creutzfeldt-Jakob disease (CJD). Cerebrospinal fluid (CSF) 14-3-3 is usually detected by immunoblot using an antibody that recognizes all of the 14-3-3 isoforms. In a few cases, the antibody recognizes an inferior band and this pattern is associated with false positive results. We analyzed 43 CSF (26 CJD, 17 controls) samples using antibodies against specific isoforms (beta, epsilon, gamma, tau, xi) and compared the results with those obtained with the standard antibody. The anti-gamma and anti-beta antibody achieved similar results but the presence of atypical patterns made the standard antibody more accurate for the CJD diagnosis. To study the nature of the inferior band, CSF samples were probed with antibodies against light chain immunoglobulins, and immunoblots of human IgG with the standard antibody. The experiments suggested a cross-reaction of the anti-14-3-3 antibody with light chain immunoglobulins.     

CDC25 B与14-3-3相互作用的研究

有研究表明在肿瘤发生发展的过程中,癌细胞的有丝分裂失控是肿瘤发生的主要原因。因此,对细胞分裂调控机制的研究成为目前研究的热点。其中细胞分裂周期25 B （ cell division cycle 25 B, CDC25B）和14-3-3是与细胞分裂有着密切关系的调控子。目前研究已经发现PKA／CDC25B／MPF （ CDC2-cyclinB1）和PKA／CDC25B／14-3-3／MPF是调控细胞有丝分裂的两条重要信号转导途径。蛋白激酶A （ pro-tein kinase A, PKA）是一种环磷酸腺苷（ cyclic adenosine monophosphate, cAMP）依赖性蛋白激酶,可以通过磷酸化下游的靶蛋白,抑制靶蛋白正常发挥作用,从而发挥调节作用。实验研究发现, PKA可以通过磷酸化CDC25B某些位点的丝氨酸残基,使CDC25B处于磷酸化状态,不能使成熟促进因子（ maturation pro-moting factor, MPF）的催化亚基细胞分裂周期2蛋白（cell division cycle 2, CDC2）第15位酪氨酸脱磷酸,因而不能激活MPF,使细胞分裂发生阻滞,不能发生G2／M的转化。14-3-3可以通过CDC25B／14-3-3／MPF途径调节有丝分裂,14-3-3通过结合已经发生磷酸化的CDC25 B的氨基酸（丝氨酸或者苏氨酸）残基,阻止CDC25B进入细胞核,从而引起细胞分裂的阻滞畅这样也就提示可以将14-3-3作为靶位点进行靶向治疗,治疗肿瘤疾病。     

Immune regulations by 14-3-3: A misty terrain

The 14-3-3 proteins are known for their functions related to the cell cycle and play a prominent role in cancer-related diseases. Recent studies show that 14-3-3 proteins are also regulators of immune responses and are involved in the pathogenesis of autoimmune and infectious diseases. This focused review highlights the significant and recent studies on how 14-3-3 proteins influence innate and adaptive immune responses; specifically, their roles as immunogens and cytokine signaling regulators are discussed. These revelations have added numerous questions to the pre-existing list of challenges, including understanding the 14-3-3 proteins' mechanism of immunogenicity to dissecting the isoform-specific immune regulations.     

14-3-3蛋白在生殖细胞中的作用

14-3-3蛋白是在所有真核细胞中广泛表达的一类高度保守的酸性蛋白家族,主要通过磷酸化依赖的方式与靶蛋白结合从而发挥其调控作用。到目前为止,我们已经发现14-3-3蛋白能与超过300种蛋白质相互作用,几乎参与细胞的所有重要生理、病理过程。14-3-3蛋白在受精卵和卵母细胞中既与通道蛋白、烟碱乙酰胆碱受体相互作用,又参与信号转导、细胞凋亡和细胞周期的调控并且在精子的发生中发挥重要作用。本文主要对14-3-3蛋白在生殖细胞中的可能功能作一简要介绍。     

PrP106-126多肽抑制14-3-3β蛋白二聚体形成的研究

目的 探讨PrP蛋白和PrP106-126多肽对14-3-3蛋白二聚体形成的影响 方法 将重组表达纯化的0.25 μg、0.5 μg和1μg PrP蛋白、人工合成的PrP06-126肽分别与重组的14-3-3β共孵育,分别通过非变性聚丙烯酰胺凝胶的Western Blott检测PrP蛋白和PrP106-126肽对14-3-3β二聚体和多聚体的形成影响.将不同浓度的PrP与250 μmol/L的PrP106-126肽和14-3-3蛋白共孵育,检测PrP蛋白对PrP106-126肽对14-3-3β二聚体和多聚体的形成影响.随后,将200μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L的PrP106-126多肽分别作用于HeLa细胞8h后,检测细胞内的14-3-3二聚体形成.结果 PrP蛋白与14-3-3蛋白共孵育后,14-3-3二聚体和多聚体的信号随着PrP浓度的增加明显增强；PrP106-126多肽共孵育时,14-3-3二聚体和多聚体的信号随着PrP浓度的增加而减弱；不同浓度的PrP蛋白可以拮抗PrP106-126多肽对14-3-3β二聚体的形成.而且PrP106-126多肽可以干扰HeLa细胞中的二聚体形成.结论 PrP蛋白促进14-3-3二聚体的形成,而PrP106-126多肽干扰二聚体的形成,且PrP蛋白具有拮抗PrP106-126肽干扰14-3-3二聚体形成的作用.