虾、蟹交叉过敏原的研究

目的分析不同虾蟹过敏原组分间的交叉反应,探讨交叉过敏原在虾、蟹等甲壳类过敏食物检测、诊断和疫苗设计中的意义。方法运用20例虾过敏患者血清和制备的凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白的8株单克隆抗体(mAbs),通过Western blot和间接竞争ELISA分析凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹的交叉过敏反应及它们的主要交叉过敏原。结果 Westernblot的结果显示,凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹分别能与85%、85%和75%的虾过敏患者血清IgE特异性反应;间接竞争ELISA的结果显示,3种虾蟹粗提液均可显著抑制虾过敏患者血清IgE与凡纳滨对虾蛋白的结合,最大抑制率分别93%、84%、60%;8株凡纳滨对虾原肌球蛋白的mAbs与日本沼虾和梭子蟹的Western blot和间接竞争ELISA反应中,6株mAbs可与日本沼虾和梭子蟹的相对分子质量为36 000蛋白反应。结论凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹之间存在交叉过敏反应,且具有多个交叉过敏原,其中原肌球蛋白是主要的交叉过敏原。     

凡纳滨对虾新过敏原烯醇化酶的鉴定

目的：鉴定凡纳滨对虾分子量为47 kD过敏原的性质。方法：采用丙酮沉淀法提取凡纳滨对虾总蛋白,通过SDS-PAGE、11例虾过敏患者血清IgE的Western blot。分析凡纳滨对虾中过敏原组份,运用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(Matrix-Assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS)鉴定凡纳滨对虾47 kD未知过敏原组分。结果：通过 SDS-PAGE电泳证明所提取的凡纳滨对虾总蛋白组分完全。Western blot 结果显示,凡纳滨对虾至少有14种与阳性血清反应的组分,其中,55%的虾过敏患者IgE与分子量为47 kD的蛋白分子发生特异性反应,质谱分析结果显示47 kD蛋白为烯醇化酶。结论：烯醇化酶是凡纳滨对虾的一种新的过敏原。     

斑节对虾过敏原的分离、鉴定与纯化

目的 对斑节对虾的主要过敏原进行分析、鉴定与纯化.方法 通过SDS-PAGE电泳分离斑节对虾的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对斑节对虾主要过敏原进行初步纯化.结果 斑节对虾粗提液SDS-PAGE显示其主要蛋白条带主要有7条,Western-blotting显示对斑节对虾过敏患者的阳性混合血清能与7个蛋白条带起反应,相对分子质量分别为71 000、43 000、34 000、23 000、21 000、20 000和19 000,离子交换层析可初步纯化出相对分子质量为34000和21 000的过敏原蛋白.结论本实验对斑节对虾过敏原进行了分离和鉴定,并初步纯化出斑节对虾的主要过敏原.     

凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白单克隆抗体的制备及其过敏原表位分析

目的制备凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白的单克隆抗体(mAb),运用它们和虾过敏患者血清分析凡纳滨对虾原肌球蛋白的过敏原表位。方法纯化的凡纳滨对虾原肌球蛋白免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和Western blot筛选并建立稳定分泌抗原肌球蛋白抗体的杂交瘤细胞株;腹水型mAbs经硫酸铵沉淀、Protein G亲和层析纯化;叠加ELISA分析mAbs的抗原结合表位;虾过敏患者血清lgE与mAbs的抑制Western blot和间接竞争ELISA分析原肌球蛋白的过敏原表位。结果共筛选出5株mAbs,它们之间叠加ELISA的叠加值均高于40%;其中B5和A5能显著抑制虾过敏患者血清IgE与原肌球蛋白的结合,抑制率分别为58.1%和48.6%,同时也能抑制66.7%和44.3%的血清IgE与虾蛋白粗提液反应。结论成功制备了5株分别结合原肌球蛋白不同抗原表位的单克隆抗体,其中B5和A5能结合其过敏原表位。     

中国人的虾、蟹致敏过敏原组分分析

目的：分析鉴定中国人群的虾、蟹致敏组分，确定主要过敏原及其致敏率，为深入研究食物过敏原检测及脱敏治疗提供依据。方法：通过46份虾蟹过敏症患者血清，对刀额新对虾、罗氏沼虾和锈斑鲟的蛋白粗提液进行Western blot 分析，统计数据得出其全部过敏原组分及其致敏率，并确定主要过敏原。结果：Western blot 结果显示，虾与过敏患者血清IgE的反应强于蟹，且虾、蟹间存在很多Mr相同的过敏原；32～38 kD原肌球蛋白（ TM）、40 kD精氨酸激酶（ AK）、60～80 kD血蓝蛋白（ Hc）和21 kD肌质钙结合蛋白（ SCP）是虾的主要致敏组分，TM、AK和Hc是虾、蟹共同的主要过敏原，其中TM的致敏率最高；与国外研究结果相比，AK、Hc和SCP的致敏率相对较高，且发现虾中48 kD蛋白组分（未知过敏原）也具有较高致敏率。结论：对中国人群而言，虾的致敏性强于蟹，且虾、蟹的主要致敏组分基本相同；中国人的虾蟹主要致敏组分及其致敏率与国外研究大致相同但略有差异；发现一种潜在的新型过敏原。     

淡水小龙虾主要过敏原原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫活性鉴定

目的:克隆、表达淡水小龙虾肌肉中主要过敏原原肌球蛋白(tropomyosin),并对其免疫活性进行鉴定。方法:根据甲壳类的泛过敏原tropomyosin基因的高度保守性设计简并引物,通过RT-PCR克隆出淡水小龙虾虾肉中过敏原tropomyosin的全长基因。将该基因与pET-28a载体连接并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经诱导异丙基-B-D-硫代乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni2+亲和层析柱纯化后,用Western blot检测该重组蛋白的免疫活性。结果:序列分析显示该基因包括一个编码284个氨基酸的开放阅读框,与已知虾、蟹、龙虾等的过敏原tropomyosin基因有较高同源性(>80%)。根据过敏原的命名规则,将其命名为Proc 1,并提交GenBank数据库,登录号为FJ769183。重组小龙虾tropomyosin在大肠杆菌中能高效的表达,Western blot检测结果显示该重组蛋白具有良好的免疫活性。结论:研究成功表达了具有免疫活性的淡水小龙虾原肌球蛋白,为虾过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

虾类和蟹类过敏原的交叉反应性研究

目的：分析虾类和蟹类过敏原交叉反应性，探讨其在食物过敏症的预防、诊断和治疗中的意义。方法：采用SDS-PAGE分析虾蟹的蛋白组分，Westernblot分析其过敏原组分，Westernblot和ELISA抑制试验研究虾类和蟹类的过敏原交叉反应性。结果：虾类、蟹类过敏原蛋白组分相似性与其种属关系相关，相对分子量（Mr）在20000、36000、38000、44000、68000、75000、85000处具有相同条带；Mr为36000的蛋白是虾的主要过敏原，胁为36000、66000、85000的蛋白是蟹的主要过敏原；青蟹蛋白和日本沼虾蛋白对其余虾蟹过敏原有抑制作用，并且随着抑制物浓度增加抑制效应增强。结论：虾类和蟹类过敏原有相似性，其中Mr在36000处相互之间存在较强的交叉反应。     

甲壳类动物4种过敏原的序列分析、抗原表位预测及三维结构建模

目的探明甲壳类动物各种过敏原之间是否存在相似性,以期深入研究甲壳类食品过敏原的构效关系。方法应用生物信息学方法,分析预测了甲壳类动物的4种过敏原—原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、肌球蛋白轻链(MLC)和肌质钙结合蛋白(SCP)的二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、线性抗原表位和三维结构等。结果 TM为超螺旋结构,而AK、MLC和SCP均为复合蛋白,含有较多的Turn和Coil结构;TM、AK、MLC和SCP 4种过敏原的亲水性区域均在60%以上,可塑性区域约为50%,抗原性区域均在60%以上。TM、AK、MLC和SCP分别有11、10、4和4个线性抗原表位。TM、AK、MLC和SCP的三维结构建模结果与相应的二级结构预测结果一致,基本能够反映此4种过敏原的空间构象。结论通过生物信息学方法分析,同时获得了甲壳类动物4种过敏原TM、AK、MLC和SCP的分子特征、抗原表位及部分三维结构,可望为进一步采用实验方法研究其构效关系奠定理论基础。     

Molecular cloning and expression analysis of hemocyanin gene from Macrobrachium nipponense

目的 克隆日本沼虾血蓝蛋白基因,进行生物信息学及时空表达分析. 方法 利用cDNA末端快速扩增技术( RACE)从肝胰腺中克隆血蓝蛋白基因cDNA全长序列,用生物学软件对其序列进行生物信息学分析,时空表达分析采用实时荧光定量PCR方法. 结果 日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长2 151 bp,包含14 bp的5'UTR、148 bp的3'UTR和189 bp的开放阅读框(ORF).ORF编码663个氨基酸,预测分子量为76.65kD,理论等电点为5.42,含有典型的3个血蓝蛋白结构域和2个保守的铜离子结合位点.与淡水螯虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白相似性分别为70％和63％.该基因在肝胰腺中的相对表达量最高,肌肉和血细胞表达较弱,大颚器官、表皮和卵巢几乎不表达:肝胰腺血蓝蛋白基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低;嗜水气单胞菌刺激后肝胰腺中的表达量显著增加. 结论 与其他甲壳动物相似,日本沼虾血蓝蛋白基因具有典型的结构域和保守的铜离子结合位点,在蜕皮间期的肝胰腺中呈高表达,是参与机体免疫防御反应的一种重要分子.     

猫过敏原白蛋白的克隆表达、纯化和免疫学特性鉴定

目的 克隆、表达猫过敏原白蛋白(Fel d 2),并分析其过敏原活性.方法 提取猫肝脏总RNA,逆转录合成cDNA,采用适宜引物进行PCR扩增目的 基因,随后将其克隆到原核表达载体PET24a( ),在大肠杆菌中进行表达,镍亲和柱层析法提纯重组蛋白,Western blot检测其过敏原活性.结果 序列分析表明所克隆白蛋白的序列由1 752 bp组成,编码584个氨基酸,与Genebank上的基因序列(NM 001009961)同源性为99.9%.SDS-PAGE显示表达的重组白蛋白Mr65 000.免疫印迹表明重组白蛋白具有与猫过敏原过敏病人血清IgE结合活性.结论 表达的重组白蛋白具有与猫过敏患者血清IgE结合活性.