sRAGE通过AGEs-RAGE信号轴抑制小鼠SGCs的凋亡

目的探讨可溶性RAGE(soluble form of receptor for advanced glycation-end products,sRAGE)对晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)-晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation-end products,RAGE)介导的C57BL/6J小鼠SGCs(spiral ganglion cells,SGCs)凋亡及RAGE受体表达的影响。方法不同浓度的sRAGE作用于培养5天后的螺旋神经节细胞和加入AGEs-BSA作用2 h后的SGCs细胞,采用免疫荧光法鉴定SGCs,通过流式细胞术检测细胞凋亡,以及RT-PCR检测RAGE的mRNA的表达,琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行确认,同时采用western blot技术检测凋亡相关蛋白Bax、BCL-2及caspase-3的表达情况。结果原代培养获得足够数量以及活性良好的SGCs,并用小鼠抗神经微丝蛋白抗体染色以鉴定。单纯向SGCs加入不同浓度的sRAGE,细胞凋亡无明显增加,RAGE受体的表达无明显增多;而不同浓度sRAGE加入AGEs作用的SGCs后,可见SGCs的凋亡随sRAGE浓度增加而减少,呈浓度相关性,RAGE受体的mRNA表达也随之减弱。凋亡相关蛋白中,BCL-2表达升高,Bax及cleaved caspase-3表达降低。结论 s RAGE可以减少AGEs诱导的SGCs的凋亡,并减少膜上RAGE受体的表达,可能与s RAGE竞争性结合AGEs而不产生相应生物学效应有关。     

晚期糖基化终末产物与糖尿病听力损害

糖尿病听力损害的发病机制到目前为止还尚未完全明确，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）的形成过多及与其受体的相互作用是重要机制之一。本文从AGEs在糖尿病听力损害发病中的作用及其可能机制等方面做一综述。     

RAGE和NF-kB及p21在小鼠螺旋神经节细胞的表达研究

目的：通过研究晚期糖基化终产物受体（RAGE）、核转录因子NF-xB、p21在幼、老年C57BL／6j小鼠螺旋神经节细胞（SGC）的表达，探讨老年性聋的发病机制。方法：将C57BL／6j小鼠分为2月龄、10月龄组各25只，分别行组织学切片观察耳蜗SGC形态结构，免疫组织化学检测RAGE、NF_xB、p21在SGC中的表达，利用IPP6图像分析软件计算平均光密度值，值越大，表达量越多。结果：①10月龄小鼠SGC数目明显比2月龄少，分别为（20±6）个和（39±5）个，差异有统计学意义（P〈0．01）；②RAGE在2月龄和10月龄小鼠耳蜗SGC平均光密度值分别为0．179±0．025和0．308±0．050；NF-”B在2月龄和lO月龄小鼠耳蜗SGC平均光密度值分别为0．181±0．045和0．335±0．120；p21在2月龄和10月龄小鼠耳蜗SGC平均光密度值分别为0．160±0．023和0．365±0．031，两组分别比较，差异均有统计学意义（P〈O．05）。结论：RAGE、NF-kB、p21在SGC中有表达且随年龄增大表达增多，推测RAGE、NF-xB、p21可能参与老年性聋的发病过程。     

晚期糖基化终产物受体在小鼠耳蜗中表达的初步探讨

目的通过研究晚期糖基化终产物受体(RAGE)在小鼠耳蜗中的表达,初步探讨RAGE与老年性聋关系。方法将C57BL/6J小鼠分为2月龄、10月龄组,分别行ABR阈值检测,组织学切片观察耳蜗形态结构,免疫组化和realtime PCR检测RAGE在耳蜗中的定位和定量表达,半定量RT-PCR检测其配体S100B在耳蜗中的表达情况。结果 :(1)10月龄小鼠较2月龄ABR阈值明显提高;(2)RAGE主要在两组小鼠耳蜗的螺旋神经节细胞,内外毛细胞和血管纹中表达,10月龄C57BL/6J小鼠耳蜗中RAGE平均光密度值比2月龄小鼠大,两组间差异有统计学意义;(3)2月龄组耳蜗中RAGE相对表达量为1±0.15,10月龄组小鼠耳蜗中RAGE相对表达量为2.0816±0.117,两组间差异有统计学意义;(4)配体S100B在10月龄小鼠耳蜗中表达增高。结论 RAGE在C57BL/6J小鼠耳蜗中有表达且随年龄增大表达增强,可能与配体S100B相互作用导致听力下降,提示RAGE可能与老年性聋的发病机制有关。     

晚期糖基化终产物受体在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的：探讨晚期糖基化终产物受体（RAGE）在喉鳞状细胞癌（LSCC）中的表达与临床意义。方法：采用免疫组织化学SP法和RT—PCR法测定RAGE在37例LSCC中的表达,并以喉癌旁组织作为对照组,结合LSCC的临床和病理特征进行分析。结果：RAGE表达于细胞质与细胞膜中,在LSCC中的阳性率（51．4％）明显高于喉癌旁组织（25．0％）（P〈0．05）。在不同的病理分级中,RAGE的表达差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：RAGE的表达与LSCC的生长、分化有关。     

喉鳞状细胞癌中RAGE与amphoterin的表达

目的：探讨RAGE(receptor for advanced glycation end products)与amphoterin在喉鳞状细胞癌中的表达与临床意义。方法：采用免疫组织化学SP法测定RAGE及amphotein在27例喉鳞状细胞癌中的表达，并以声带息肉作为对照组，结合喉鳞状细胞癌的临床特征进行分析。RAGE与amphoterin主要定位于细胞膜上，表达强度按阳性细胞数计算。结果：RAGE在喉鳞状细胞癌的表达明显高于在声带息肉中的表达，转移性喉鳞状细胞癌表达高于非转移性喉鳞状细胞癌。Amphoterin在几乎所有的喉鳞癌中表达，且高于声带息肉中的表达。结论：RAGE与amphoterin的表达与喉鳞状细胞癌的侵袭和转移有关，可作为预测喉鳞状细胞癌转移潜能的指标。     

2型糖尿病听力损害患者与AGEs及APN的相关性研究

目的研究2型糖尿病听力损害患者与晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）及脂联素（adiponectin,APN)的浓度之间的相互作用关系。方法用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清AGEs和APN的含量。实验组为糖尿病患者104例,其中糖尿病伴有听力损害者49例（A组）,糖尿病不伴有听力损害患者55例（B组）;对照组为47例健康者（C组）。结果3组受检者体重指数（BMI）、总胆固醇（TC）水平比较,差异均无统计学意义( P>0.05);而空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、餐后2小时血糖（2hPG）、低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇( HDL-C)、甘油三脂( TG)、AGEs、APN水平比较,差异均有统计学意义( P<0.05);与C组相比,A组及B组FPG、HbA1c、2hPG、LDL-C、TG、AGEs水平均明显升高,HDL-C、APN均明显降低（P<0.05）;与B组相比,A组AGEs水平升高,APN水平降低（P<0.05）;在糖尿病听力损害患者中,AGEs与FPG、2hPG、LDL-C、HbA1c、糖尿病病程、听力平均值均呈正相关( P<0.05)。APN与BMI、FPG、2hPG、HbA1c、糖尿病病程、听力平均值均呈负相关,与HDL-C呈正相关( P<0.05)。结论血清AGEs、APN与2型糖尿病听力损害的发生及发展具有相关性。临床上AG-Es、APN可作为早期评估糖尿病听力损害及预测其预后的参考指标。     

衣霉素诱导螺旋神经节细胞内质网应激反应性细胞凋亡的研究

目的 探讨衣霉素是否可诱导螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell,SGCs)产生内质网应激反应性细胞凋亡及其发生机制.方法 采用出生3 d内的SD大鼠,取出螺旋神经节细胞体外培养3 d后,加入不同浓度的衣霉素24 h后,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞存活率并选取适当的诱导浓度;免疫组织化学鉴定培养的螺旋神经节细胞;hochest 33258检测细胞核形态;Western blot检测GRP78/BiP、Caspase-12蛋白的表达.结果 可以选取2μg/ml的衣霉素作为诱导浓度;培养的细胞经免疫组化抗神经丝蛋白抗体证实为SGCs;hochest33258核染色发现衣霉素诱导后出现凋亡样改变的细胞核;Western blot检测发现经衣霉素诱导后GRP78/BiP及Caspase-12蛋白在细胞内表达更多,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01).结论 衣霉素可以诱导大鼠离体SGCs产生内质网应激反应性细胞凋亡,且具有浓度依赖性;Caspase-12可能参与其凋亡机制的发生.     

C57BL/6J小鼠初级听皮层神经元凋亡与caspase-3表达的年龄相关性改变

目的探讨不同月龄C57BL／6J小鼠初级听皮层中caspase3的表达及初级听皮层神经元凋亡情况,探讨两者之间的关系以及caspase--3、凋亡在老年性聋发生、发展中的作用。方法分别选取2月龄（15～20克）和10月龄（45～60克）C57BL／6J小鼠各15只,免疫组织化学法染色检测两组C57BL／6J小鼠初级听皮层caspase-3的表达情况,末端转移酶介导的原位缺口末端标记染色（TUNEL）技术检测两组小鼠初级听皮层神经元凋亡状况。结果与2月龄组C57BI．／6J小鼠相比,10月龄组C57BL／6J小鼠初级听皮层中caspase-3的表达显著增多,初级听皮层神经元凋亡数目明显增多（P值均〈0．01）,且caspase-3的表达与神经元的凋亡呈正相关（r=0．5202）。结论caspase3的表达可能在老年性聋的发生、发展过程中起重要作用,它参与了小鼠初级听皮层神经元的凋亡调控过程,可能是老年性聋的发病机制中一个重要因素。     

年龄相关性听力损失大鼠听皮层、蜗核、耳蜗SOD、MDA变化及神经细胞凋亡初步观察

目的通过测定年龄相关性听力减退大鼠听皮层、蜗核、耳蜗组织中超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的变化及神经细胞凋亡率,初步探讨老年性聋与氧化损伤及神经细胞凋亡的关系。方法选用3月龄（听阈20&#177;5dB SPL）及18月龄（听阈55&#177;10dB SPL）Wistar大鼠各30只,硫代巴比妥酸（thibabituric acid,TBA）法测定MDA含量,黄嘌呤氧化酶法（xanthine oxidase,XO）测定总SOD活性,Annexin V-FITC／PI双染法流式细胞仪检测神经细胞凋亡率。结果①与3月龄组大鼠相比,18月龄组大鼠听皮层、蜗核、耳蜗中SOD活性下降,MDA含量升高,组间比较,差异均有显著统计学意义（P〈0．05）。②18月龄组大鼠听皮层、蜗核神经细胞凋亡率比3月龄组大鼠相应部位的神经细胞凋亡率增加,组间比较,差异有显著统计学意义（P〈0．05）。③神经细胞凋亡率与SOD活性呈负相关（r=0．65,P〈0．05）,与MDA含量正相关（r=0．59,P〈0．05）。结论听皮层、蜗核、耳蜗中氧化损伤及神经细胞凋亡与老年性聋的发生发展有关,氧化损伤可能是诱发细胞凋亡的机制之一。     

脑衍生的神经营养因子及其受体trk B在老年性大鼠耳蜗中的表达

目的：探讨脑衍生的神经营养因子（BDNF）及其受体trk B在老年性大鼠耳蜗中的表达。方法：采用实时定量PCR的方法对正常老年大鼠（老年非耳聋组）与老年性耳聋大鼠（老年耳聋组）及非老年正常大鼠（对照组）耳蜗组织中的BDNF和trkB mRNA表达进行定量分析。结果：定量分析结果显示，老年耳聋组耳蜗神经元和毛细胞中BDNF的表达比对照组明显减少（P＜0．01）；老年非耳聋组BDNF的表达与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。表达于神经元的trk B在老年耳聋组、老年非耳聋组和对照组差异均无统计学意义（P＞0．05）。结论：老年性大鼠耳蜗中BDNF的表达与老年性大鼠耳聋的发病机制可能密切相关。     

庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤机制初步研究

目的探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion cell,SGC）的损伤机制。方法取出生后2～6天昆明种乳小鼠耳蜗,利用酶消化和机械分离相结合的方法分离出SGC,并进行体外培养。将培养4天的SGC用4%多聚甲醛室温固定30min,以小鼠源神经纤维细丝蛋白（Neurofilament-68/200kDa,NF-L＋H）单克隆抗体作为一抗,按照SP法（streptavidin-perosidase法,链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）对所培养细胞进行免疫细胞化学染色,对SGC作出鉴定。将培养第4天的细胞分为4组：空白对照组及3种浓度的庆大霉素干预组（庆大霉素终浓度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L）,作用48h后收集各组细胞进行透射电镜分析。结果SGC原代培养获得成功,经NF-L＋H抗体免疫细胞化学染色,其胞质及突起均呈阳性反应,染成棕黄色,一般有相对生长的两个突起,为典型的双极神经元。在透射电镜下观察SGC超微结构,3种浓度的庆大霉素组SGC与空白对照组相比,均出现明显的形态学改变,这种改变与凋亡相关。结论庆大霉素对小鼠耳蜗SGC有直接毒性作用,可导致细胞凋亡,线粒体损伤在这一过程中可能具有重要意义。     

阳离子脂质体介导小鼠原代螺旋神经节细胞NT-3基因转染的实验研究

目的通过阳离子脂质体携带构建的神经营养因子-3(NT-3,Neurotrophin-3)-绿色荧光蛋白基因(pEGFPC2)转染小鼠耳蜗原代培养的螺旋神经节细胞,观察NT-3-pEGFPC2的共表达及其对螺旋神经节细胞生长的影响。方法构建携带绿色荧光蛋白报告基因的重组质粒-NT3 pEGFPC2,建立体外培养原代小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的方法,并用神经丝蛋白(NF200)单克隆抗体进行免疫组化染色鉴定。利用阳离子脂质体携带重组质粒瞬时转染原代小鼠耳蜗螺旋神经节细胞,观察转染后NT-3的表达及对螺旋神经节细胞生长数量的影响。结果成功培养了小鼠原代耳蜗螺旋神经节细胞。基因转染后24 h在荧光显微镜下观察到胞体及轴突发出绿色荧光的螺旋神经节细胞。用Western blot方法检测到相应NT-3蛋白表达。继续培养12 d后各组细胞数量均减少,但NT-3转染组细胞减少数量低于空载体组。结论阳离子脂质体可作为NT-3基因的载体。NT-3的基因转染对抑制耳蜗螺旋神经节细胞的退行性变有一定作用。     

腺病毒介导Bcl-2基因对原代螺旋神经节细胞存活的促进作用

目的研究外源性细胞凋亡相关基因Bcl-2对原代培养的螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)存活及突起生长的影响,以期找到保护SGCs的有效方法。方法大鼠螺旋神经节细胞原代培养,免疫印迹法(western blot)检测转染AdEasy系统构建携带Bcl-2和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的腺病毒后SGCs表达Bcl-2蛋白的水平。免疫细胞组织化学染色鉴定螺旋神经节细胞,计数SGCs的数目。结果AdEGFP/Bcl-2组SGCs的存活数目分别高于AdEGFP组及空白对照组,AdEGFP组的存活SGCs细胞数略少于空白对照组。结论Bcl-2蛋白能促进体外SGCs细胞存活,腺病毒本身有轻微的细胞毒性,但表达外源性Bcl-2基因却可以保护SGCs不受腺病毒细胞毒性损害。     

螺旋神经节细胞无血清培养方法的研究

目的：通过对比不同培养条件下螺旋神经节细胞（SGCs）的生长特性,从而确定一种可以获得足够数量和纯度的SGCs体外培养的最佳方法。方法：采用出生3d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,观察有血清培养基及无血清培养基,加或不加阿糖胞苷（Ara—c）对体外培养SGCs纯度及活性的影响。免疫组织化学鉴定培养的螺旋神经节细胞。结果：使用DMEM／F12培养基及B27添加剂,联合5μmol／L Ara-c作用48h,能有效抑制非神经细胞增殖,得到比较纯的SGCs。通过hochest33258及PI双标,发现Ara-C对SGCs毒性较小。得到的细胞经免疫组织化学抗神经丝蛋白抗体证实为SGCs。结论：本实验建立的方法,所获得的SGCs纯度较高,细胞活性保持良好,为体外研究外周听觉系统疾病提供了重要方法。     

17-AAG联合EGCG对人鼻咽癌细胞株增殖和凋亡的影响及机制研究

目的　研究17-烯丙胺-17-去甲氧基格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）单药或联合使用对人鼻咽癌细胞CNE的凋亡诱导作用,寻找鼻咽癌治疗的新方向。方法　MTT法和荧光染色分别检测CNE增殖抑制率及细胞形态的变化;RT-PCR检测Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达。结果　①17-AAG、EGCG单独作用于CNE细胞24、48、72 h,均有抑制作用,与时间和剂量相关（P＜0.01）;两者联合抑制作用显著增 加,且表现出时间、剂量依赖性（P＜0.01）。②RT-PCR检测联合用药时Caspase-3和Bax的mRNA表达明显高于单独用药组,Bcl-2 mRNA明显低于单独用药组。结论　17-AAG联合EGCG可显著抑制CNE细胞增殖,其可能与上调Bax和Caspase-3的表达发挥其抗鼻咽癌细胞的生长增殖作用。     

A study of gentamicin injury mechanisms using cultured mouse cochlear spiral ganglion cells

Objective To study gentamicin injury mechanisms using postnatal mouse cochlear spiral gangcells (SGC).Methods SGCs were isolated using a combinatorial approach of enzymatic digestion and mechanical sep...