两种体外培养人牙周韧带成纤维细胞方法比较

目的探索一种在体外短时间内简便、可靠获取大量人牙周韧带成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast,HPLF)、建立稳定的体外培养体系的方法。方法采用酶消化法和组织贴块法进行HPLF体外原代培养及传代培养的对比研究。通过细胞形态学、超微结构观察及波形蛋白和角蛋白免疫组化染色等对细胞进行定性研究;测定细胞生长曲线了解细胞生长基本规律及其增殖能力。结果采用酶消化法和组织贴块法均可成功的进行HPLF连续传代培养。最高传代数为30代。培养的细胞具有成纤维细胞的典型形态,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,生长稳定期倍增时间为48~72h。组织块培养法需培养时间长,原代培养获取的细胞量较少,较难传代。酶消化法可短时间内获取大量细胞,细胞产量高,但操作手续复杂易污染,细胞易受损伤。结论成功建立了一个稳定的HPLF体外培养体系。除常用的组织块法外,胰蛋白酶及胶原酶联合消化法不失为一种简便、快速、可靠的组织原代分离培养方法。     

人牙周韧带细胞膜片的体外实验研究

目的 观察体外培养人牙周韧带细胞(hPDLCs)的成骨、成脂能力;构建hPDLCs膜片并鉴定膜片细胞外基质的主要结构蛋白.方法 通过酶联组织块法分离并纯化培养hPDLCs;免疫细胞化学法鉴定hPDLCs来源及干细胞标志物STRO-1表达情况;取第2～4代细胞分别用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养,茜素红及油红O染色检测hPDLCs的成骨、成脂能力;制备成熟的hPDLCs膜片,苏木素-伊红(HE)及免疫组织化学染色法鉴定膜片细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白的表达情况.结果 经原代培养的hPDLCs抗波形蛋白染色阳性,干细胞标志物STRO-1染色阳性,证实hPDLCs来源于间充质并具有干细胞潜在分化能力;hPDLCs在诱导成骨、成脂分化培养14～16 d后,茜素红及油红O染色结果阳性提示hPDLCs具有良好的成骨及成脂分化能力;HE染色及免疫化学染色发现hPDLCs膜片高表达细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白.结论 本研究从细胞分离培养,来源鉴定、多向分化潜能诱导及细胞膜片技术等方面证实PDLCs中存在成体干细胞,提示hPDLCs膜片能为牙周组织再生种子细胞提供新来源,可进一步深入研究.     

人牙周韧带细胞在聚羟基乙酸支架上体外三维培养的实验研究

目的：应用聚羟基乙酸(polyrglycolic acid，PGA)作为人牙周韧带细胞(periodontal ligament cell，PDLC)的三维体外培养支架，观察细胞的形态学特征和生物学性状。方法：将人牙周韧带细胞与PGA三维支架进行体外复合培养，用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞形态结构及其与支架的粘附性和组织相容性，并用Ⅰ型胶原抗体检测细胞的Ⅰ型胶原分泌情况。结果：光镜和扫描电镜显示，人PDLC在PGA三维支架上粘附良好，分泌基质旺盛。免疫组化染色显示细胞支架复合物中Ⅰ型胶原表达阳性。结论：人PDLC在PGA三维支架上能够维持其形态学特征及生物学性状。聚羟基乙酸具有良好的粘附性和生物相容性，适宜进一步作为构建组织工程化牙周韧带的支架材料。     

诱导成体人牙周韧带干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的从成体人牙周组织中分离培养牙周韧带干细胞，研究其分化为软骨细胞的可行性。方法选取10～15岁的年轻患者因正畸拔除的健康牙齿，刮取根中1／3的牙周膜，采用组织块培养法得到牙周韧带细胞，待细胞达一定量后用有限元稀释法进行单细胞克隆，筛选牙周韧带干细胞（PDLSC），体外采用离心管聚集体诱导法进行软骨化诱导培养，光镜下观察诱导细胞形态学的改变，甲苯胺蓝染色、免疫组化、RT-PCR等方法检测胶原和糖蛋白的体外表达情况。结果体外离心管聚集体诱导培养3周后，实验组呈白色半透明状，甲苯胺蓝染色显示在外周区域有大量软骨基质成分沉积，组织学显示有较为明显的软骨陷窝。免疫组化及RT-PCR检测到Ⅱ型胶原表达，Ⅱ型胶原染色呈强阳性。对照组细胞团块逐渐收缩、崩解，组织学检测无软骨陷窝结构，Ⅱ型胶原免疫组化结果阴性。结论从成体人牙周组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能，也为牙周组织工程的应用奠定了实验基础。     

体外培养的人牙髓细胞、牙周韧带细胞几种基质表达和碱性磷酸酶分泌的研究

目的：研究并比较培养的５～７代人牙髓细胞和牙周韧带细胞几种基质表达和碱性磷酸酶分泌的情况。方法：细胞培养、免疫组化、碱性磷酸酶活性分析。结果：两种细胞均在培养的第９天进入生长静止期，两种细胞培养液中碱性磷酸酶活性在增殖期达到高峰，以后活性下降。两种细胞均表达ＦＮ、Ⅲ型胶原、ＢＭＰ。当培养的细胞密度较高时，ＦＮ和Ⅲ型胶原以纤维状结构覆盖于细胞表面。结论：传代的人牙髓细胞和牙周韧带细胞的上述几种基质表达方式、碱性磷酸酶活性相似。     

人牙周韧带细胞与壳聚糖-胶原支架体外培养的实验研究

目的:探讨壳聚糖-胶原支架在人牙周韧带细胞(PDLC)体外培养中的作用.方法:将体外培养PDLC接种于壳聚糖-胶原支架上,通过MTT法测定细胞增殖情况,通过半定量PCR检测细胞mRNA合成变化.结果:与传统的平板培养相比,PDLC在壳聚糖-胶原支架上的增殖及mRNA合成情况有显著性差异(P<0.05).结论:该复合支架可以作为PDLC的载体;对PDLC的增殖及细胞外基质的合成均有较好地促进作用.     

米诺环素对体外培养的人牙周韧带细胞生物活性的影响

目的 研究米诺环素对体外培养的人牙周韧带细胞(HPDLCs)增殖及生物合成的影响。方法 将不同浓度的米诺环素(1、5、20、100、500、2500 mg/L)加入体外培养的HPDLCs,共孵育2d后,在倒置显微镜下观察其对细胞形态的影响,并分别检测其对细胞的增殖活性、蛋白合成及DNA合成的影响。结果 在5-100mg/L的浓度范围内,米诺环素可显著促进HPDLCs的增殖及生物合成(P<0.01)。但高浓度(2500 mg/L)的米诺环素则严重抑制细胞的生物学活性。结论 一定浓度的米诺环素能提高HPDLCs的生物学活性,但过高浓度的米诺环素具有细胞毒性,不利于牙周组织的修复和再生。     

维A酸对体外培养的人牙周韧带细胞的生物学作用

目的:探讨维A酸对体外培养的人牙周韧带细胞的生物学作用。方法:体外培养人牙周韧带细胞。分别以不同浓度的维A酸作用于细胞,在倒置显微镜下观察不同浓度的维A酸对细胞形态与排列的影响;并通过MTT法、酶动力学方法及考马斯亮蓝法检测维A酸对细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及蛋白质合成的影响。结果:维A酸能增强牙周韧带细胞的碱性磷酸酶活性,10-6mol／L浓度的维A酸对细胞的作用效果最明显(P<0.01);而对细胞形态与排列、增殖能力及总蛋白合成无影响。结论:维A酸可促进牙周韧带细胞向成骨样细胞方向分化。     

五倍子对5种常见牙周细菌抑制作用的体外研究

目的：观察五倍子对5种常见牙周细菌的作用。方法：采用试管二倍稀释法，测定五倍子水提取物在体外厌氧环境对牙龈卟啉单胞菌，中间普氏菌，伴放线放线杆菌，具核俊杆菌和血链球菌的最小抑菌浓度（MIC），结果：五倍子对各实验细菌均有抑制作用。对牙周常见可疑致病菌牙龈卟啉单胞菌，伴放线放线杆菌，中间普错菌，具核梭杆菌的MIC值均为3．12％，对牙周有益菌血链球菌的MIC值则为12．5％，结论：浓度为3．12％的五倍子在不破坏牙周局部生态平衡的情况下可有效抑制牙周细菌的生长。     

The biomechanical properties of the periodontal tissues]

The literature review of the structure and biomechanical properties of the teeth-maxilla segment tissues and also the age and pathologic states dependencies is presented.     

牙周膜生物力学性质的试验研究进展

口腔正畸治疗中,牙齿的移动依赖于矫治力产生的牙周膜(Periodontal Ligament,PDL)反应,PDL的生物力学性质是正确理解正畸牙移动、牙周组织响应和制定正畸治疗计划的关键和基础。由于PDL组成成分多、牙根形态各异,对其生物力学性质的研究较为困难。该文拟对近年来研究PDL生物力学性质的各种试验方法做一综述。     

A freeze-fracture study of the periodontal ligament of the rat

Fibroblasts of the rat periodontal ligament were studied in situ by the freeze-fracture technique. Large surfaces of the protoplasmic and extracellular faces of the cell membrane as well as, the membranes of the RER, Golgi apparatus, and other cytoplasmic organelles were viewed at the ultrastructural level. Intramembrane particles representing membrane proteins were visualized, and their concentration in various membranes measured.
Features of the fibroblast cell surface appearing as rough patches were interpreted to represent areas of possible cell-to-matrix interaction. The use of the freeze-fracture technique in further studies of PDL fibroblast-matrix contact is discussed.     

人牙周韧带细胞成骨分化的差异表达蛋白质组学研究

目的 获得人牙周韧带细胞诱导成骨分化通路中的调节蛋白,探讨牙周韧带细胞诱导成骨分化的分子机制.方法 应用胶内差异双向电泳结合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱鉴定等蛋白质组学技术筛选人牙周韧带细胞诱导成骨分化的差异表达蛋白质组.结果 获得人牙周韧带细胞诱导成骨分化7 d的差异表达蛋白质图谱,确认有显著差异的蛋白质斑点61个,质谱鉴定29个蛋白质,包括细胞骨架蛋白及细胞骨架相关蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、基质合成、代谢酶和信号传导等蛋白.其中一组细胞骨架蛋白及细胞骨架相关蛋白同时发生改变,与牙周韧带细胞成骨分化早期细胞骨架重组、有丝分裂和细胞迁移等过程紧密相关.结论 建立了人牙周韧带细胞成骨分化早期的差异蛋白质组图谱,为牙周韧带细胞成骨分化的蛋白调控机制进一步研究提供了实验依据.     

A comparative study of human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro

Both periodontal ligament and gingival tissue are thought to harbor cells with the ability to stimulate periodontal regeneration, i.e., formation of new bone, cementum, and connective tissue attachment. To understand further the role of these cells in the regenerative process, we compared human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts, both derived from the same patient, same passage, in vitro. Protein and collagen production was significantly greater in periodontal ligament cells when compared with that of gingival fibroblasts. In addition, periodontal ligament cells had higher alkaline phosphatase levels when compared with those of gingival fibroblasts.     

牙周膜相关蛋白1在人牙周膜细胞成骨分化过程中的表达

目的 研究牙周膜相关蛋白1（PLAP-1）在人牙周膜细胞（PDLC）成骨分化过程中的表达变化,为明确PLAP-1 在牙周组织中的作用奠定基础.方法 酶消化法培养人PDLC,免疫细胞化学染色鉴定其来源和PLAP-1 的表达,茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）实验鉴定其成骨分化能力,定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测其成骨分化过程中,PLAP-1、Periostin、RGD-CAP、RUNX2、OCN 和OPN mRNA 表达变化,Western blot 检测PLAP-1、RUNX2 和OCN 蛋白表达变化并进行统计分析.结果 培养的人PDLC 来源于间充质;人PDLC 矿化诱导21 d 后茜素红染色阳性,矿化诱导后7、14、21 d 时ALP 活性较对照组明显增高（P ＜ 0.05）,具有成骨分化能力;PLAP-1 免疫细胞化学染色阳性;定量RT-PCR 和Western blot 结果显示,人PDLC 在mRNA 和蛋白水平均表达PLAP-1,且mRNA 表达量随人PDLC 成骨分化过程发生变化,诱导14 d上调,诱导21 d 下调,较对照组有明显差异（P ＜ 0.05）,Western blot 检测蛋白表达显示类似的表达趋势.结论 PLAP-1 在基因及蛋白水平均高表达于人PDLC,其表达量随人PDLC 成骨分化成一定模式,提示其参与调控牙周膜的功能与稳定,但其精细的调控功能还有待进一步深入研究.     

人釉原蛋白基因转染牙周膜细胞的实验研究

目的:构建含有人釉原蛋白(human amelogenin,hAm)基因的慢病毒载体质粒,用重组慢病毒感染人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells,hPDLCs),初步探讨釉原蛋白基因修饰种子细胞用于牙周组织工程修复的可行性.方法:采用RT-PCR方法获取hAm编码基因,构建慢病毒载体质粒FUAmW,重组质粒经双酶切及测序鉴定.聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法三质粒共转染293T细胞,获取重组慢病毒FUAmW FUGW,感染hPDLCs,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluoreseene protein,GFP)表达,流式细胞仪flow cvtometer,FCM)检测慢病毒载体转染效率.通过RT-PCR检测hPDLC中hAm基因的表达.结果:测序证实,RT-PCR产物序列与Genebank公布的Am编码序列一致,双酶切证实目的片段插入重组质粒.293T细胞及hPDLCs感染72h后.荧光显微镜下可见绿色荧光.FCM测得GFP感染2种细胞的阳性率分别为69.46%和33.99%.RT-PCR证实重组慢病毒FUAmW感染的细胞能表达hAm基因.结论:成功构建含有人釉原蛋白基因的慢病毒载体质粒,经293T细胞包装.得到重组慢病毒可感染牙周膜细胞.     

5种牙本质黏结剂对人牙周膜细胞毒性的比较

目的：比较5种牙本质黏结剂对人牙周膜细胞的毒性作用。方法：原代培养人牙周膜细胞,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)和浸提液法,观察5种牙本质黏结剂(Super Bond C&B、Clearfil SE Bond、G-Bond、Single Bond2、Adper Easy One)不同体积分数浸提液(100%、50%、25%)作用不同时间(24 h、48 h、72 h)对人牙周膜细胞的毒性作用。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：5种牙本质黏结剂对人牙周膜细胞的细胞毒性Super BondP<0.05),48 h与72 h无显著差异(P>0.05)。结论：5种牙本质黏结剂细胞毒性程度不同,Super Bond C&B、G-Bond和Clearfil SE Bond的细胞毒性均较轻微,Single Bond2的细胞毒性较强。     

Lactate dehydrogenase isoenzymes of the human periodontal ligament

The isoenzymes of lactate dehydrogenase (E. C. 1. 1. 1. 27.) from the periodontal ligament on the root surface of extracted erupted permanent human teeth have been separated and quantitated by means of cellulose acetate membrane electrophoresis.
LDH-3 and LDH-4 were the predominating isoenzymes. and smaller amounts of LDH-2 and LDH-5 were also present. Only traces of LDH-1 could be seen. The results indicate the presence of both aerobic and anaerobic metabolic pathways in the human periodontal ligament.
These pathways bring about an efficient, economical energy production under normal circumstances, and make the survival of this tissue possible under hypoxic conditions, when the blood supply is briefly interrupted. The results further show that determinations of the survival time of the periodontal ligament on a tooth outside its alveolus have to be made by activity measurements of both aerobic and anaerobic enzymes.