培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化

目的探讨体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞、脂肪细胞分化的方法,以及钙结节形成、Ⅰ型胶原表达等情况. 方法分离人骨髓间充质干细胞,经过原代培养和传代培养,分别加入成骨诱导、脂肪诱导培养体系,经过倒置显微镜观测与HE染色了解诱导后细胞形态变化,并通过von Kossa染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、苏丹黑染色与油红O法染色鉴定细胞的性质.另取2代细胞体外培养,加入成骨诱导分化试剂,以碱性磷酸酶(ALP)为检测指标计数细胞阳性率,比较成骨诱导1、2、3、4周时细胞碱性磷酸酶的变化.结果体外培养的MSCs在合适的条件下能够向成骨细胞、脂肪细胞分化.细胞经成骨诱导2～3周时细胞碱性磷酸酶阳性率最高,达到85%.结论 MSCs体外培养在一定条件下向成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞分化,体外培养时形成钙结节,并表达Ⅰ型胶原.培养2～3周后细胞经成骨诱导分化细胞ALP阳性率较高.     

兔骨髓间充质干细胞的制备及诱导成骨的实验研究

目的:在体外原代培养兔骨髓间充质干细胞,观察兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性,为用于组织工程学的种子细胞培养提供实验基础。方法:自兔股骨、胫骨取骨髓,分离骨髓间充质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液两组进行培养,对第3代细胞进行酶动力学法碱性磷酸酶(ALP)活性检测及钙结节茜素红染色,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果:两组细胞其培养液中的ALP含量不断升高,经过两独立样本t检验,矿化液诱导组第2,6,10天的ALP水平较正常对照组均明显升高(P<0.05)。细胞表现出成骨细胞特性,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外适当的培养条件下,增殖能力很强,可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学活性观察

目的建立兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养、扩增的方法，并进行生物学活性观察。方法穿刺抽取新西兰大耳白兔骨髓5ml，通过密度梯度离心法获取MSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第2代细胞用矿化液连续培养后，进行ALP及矿化结节染色。结果体外成功建立兔骨髓间充质干细胞分离扩增传代的方法，能够连续传至8～9代；矿化液培养的细胞ALP及矿化结节染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养，具有向成骨细胞诱导分化的特性，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

miR-30a-5p在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的生物学功能及验证

目的：探讨并验证重组miRNA-30a-5p体外转染对人骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的生物学作用。方法：人工重组合成从人骨髓MSCs定向成骨分化差异性表达miRNA基因芯片结果中筛选成骨性表达量显著增高的miRNA-30a-5p。从人体骨髓中分离培养MSCs,成骨诱导分化过程中于体外转染重组miRNA-30a-5p,并通过茜素红S法染色检测钙盐沉积、碱性磷酸酶（ALP）钙钴法染色及ALP比色法定量检测成骨细胞ALP活性,对比观察研究重组miRNA-30a-5p在人骨髓MSCs定向成骨诱导分化过程中的生物学功能。结果：成功分离培养人骨髓MSCs并诱导其成骨定向分化。经体外向MSCs转染miRNA-30a-5p并诱导其成骨定向分化,转染效率为（37.32±2.43）%。分别于诱导培养第14、21天行ALP染色观察、ALP活性测定、茜素红钙盐结节染色检测各组细胞成骨活性,结果显示miRNA-30a-5p mimics转染组MSCs成骨分化特性显著性增强（P〈0.05）。结论：miRNA-30a-5p在MSCs定向成骨分化的过程中具有一定的促进增强作用,被转染的MSCs向成骨细胞定向分化表达有所增加,为进一步阐明人骨髓MSCs定向成骨分化的分子生化机制,细胞移植修复治疗骨缺损奠定了理论基础。     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

骨髓间充质干细胞建立的成骨细胞培养模型的研究

目的：为骨折骨缺损治疗的基础实验研究建立理想的细胞模型,观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养状态下的生长情况,对其向成骨细胞分化及分化能力进行研究.方法：采用全骨髓密度梯度离心法联合差速贴壁法从兔股骨骨髓中提取、分离、纯化BMSCs,取第3代BMSCs细胞分为两组进行培养,A组：为用含有诱导剂的低糖DMEM培养基的诱导培养组;B组：为常规培养组.倒置显微镜及HE染色观察记录各代次细胞形态等特征;CD44,CD90检测细胞表形,通过碱性磷酸酶（ALP）染色及标准化钙结节计数,鉴定细胞成骨活性.结果：兔骨髓间充质干细胞生长状态良好,培养7 d后各组细胞形态趋于一致,多呈长梭形,培养2 wk后对两组细胞进行ALP染色,可见A组细胞质内ALP染色阳性反应明显,B组染色显色弱.21 d时A组细胞茜素红染色后钙化结节数量多且较大,B组有少量钙结节形成,但较小.A组标准化钙结节计数显著高于B组差异具有显著统计学意义（P〈0.05）.结论：通过密度梯度离心法联合差速贴壁法所获得的BMSCs在常规培养或诱导培养时均可表现出成骨潜能,但诱导培养组的BMSCs的ALP活性更强,成骨能力更确切,可为骨组织工程远期实验研究提供理想的细胞模型.     

早期贴壁分离并机械刮除纯化法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系

①目的探讨早期（60-80分钟）贴壁分离法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系，对细胞贴壁分离的时机以及传代后的形态变化的影响。②方法采用早期贴壁分离方法及机械刮除纯化法纯化问充质细胞，并用钙钴法染色检测细胞的ALP表达情况、使用成骨诱导荆诱导间充质细胞。用茜素红染色观察矿化结节的形成。③结果第一代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性；经条件培养基定向培养5天的细胞呈集落生长，并形成钙结节，茜素红染色阳性。④结论采用早期贴壁分离法可以短期内得到大量较纯的免间充质干细胞。在诱导剂作用下可成功分化成为成骨细胞，是培养骨组织工程用途的种子细胞的理想方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定

[目的] 研究大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力.[方法] 取SPF级SD大鼠6只,采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定;应用含地塞米松、B-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化,检测碱性磷酸酶 (ALP) 的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定.[结果] 全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs 在含体积分数为10%胎牛血清的低糖 DMEM(L-DMEM) 养液中生长性状相对稳定,增殖速度快;诱导条件下,细胞ALP活性明显增高,并出现了矿化结节.[结论] 建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓 MSCs 的方法,成骨能力肯定,为中药蛋白质组学研究提供材料基础.     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．     

hBMP7瞬时转染对兔骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

[目的]运用人骨形成蛋白hBMP7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响.[方法]密度梯度离心法培养兔MSCs,在体外分别转染pcDNA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节和骨钙素等成骨细胞表型.[结果]hBMP-7基因存在于转染后的骨髓间充质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后细胞形态略有变化,生长曲线与未诱导组无明显变化,钙结节形成,碱性磷酸酶增加,骨钙素表达增强.电镜见胞质中有钙质成分.[结论]hBMP-7基因可促进兔MSCs向成骨细胞表型转化.hBMP-7基因转染的MSCs有望成为组织工程化骨理想的种子细胞.     

离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的 观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原;经成骨培养液诱导培养后,对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定.结果 分离的骨髓间充质干细胞2 h后贴壁,贴壁细胞平均10 d[]形成克隆,细胞表型稳定.诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,Von.ossa染色可见矿化结节.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

胎鼠皮肤间充质干细胞的体外培养及成骨分化研究

目的：分离、纯化胎鼠皮肤间充质干细胞(MSCs)，在体外培养、扩增并促其成骨分化，为骨组织工程学研究与骨质疏松症的细胞学治疗提供一种可能。方法：体外培养胎鼠皮肤MSCs，并在培养液中加入成骨诱导剂诱导培养，观察其成骨分化潜能。 结果：胎鼠皮肤MSCs传代培养第15代仍具有增殖能力,说明该细胞为干细胞源性;贴壁细胞在成骨诱导剂作用下,碱性磷酸酶(ALP)水平升高，ALP钙钴染色呈阳性反应，钙结节茜素红染色反应阳性。 结论：胎鼠皮肤MSCs具有很强的自我增殖能力，成骨诱导剂可促其向成骨分化。     

骨髓来源成骨细胞复合纳米晶羟基磷灰石胶原构建组织工程骨的实验研究

目的 :探讨纳米材料作为组织工程骨基质材料的可行性。方法 :分离培养兔骨髓间充质干细胞 ,诱导为成骨细胞后作为种子细胞 ,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养 ,复合物植入兔桡骨节段性缺损处 ,通过大体观察、HE染色及X线摄片了解成骨情况。结果 :兔骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增 ,能定向诱导为成骨细胞 ;复合物植入 16周后 ,X线摄片中可见桡骨缺损处连接良好。结论 :纳米晶羟基磷灰石胶原材料是组织工程骨的较好的支架材料。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 明确大鼠骨髓间充质干细胞(bone mensenchymal stem cells,BMSCs)在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其向成骨细胞分化的能力,探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法.方法 提取大鼠原代BMSCs,用酠EM完全培养基和成骨诱导条件培养基体外培养,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态;台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线;ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和von Kossa染色检测细胞矿化结节,以判断细胞是否向成骨细胞分化.结果 全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长,呈梭形或多角形;使用Dex-SaMEM向成骨诱导后的BMSCs具有与成骨细胞在体外培养时相似的特征,倍增时间延长;合成ALP能力显著增强(P<0.05),von Kossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节.结论 全骨髓培养法取材方便,经成骨诱导培养的BMSCs表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性,该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法 抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第2代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第2代MSC进行软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果 MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论 在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，为骨和软骨组织工程的修复和重建提供实验依据。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化

目的建立兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,检测细胞表面标志物,加入诱导剂诱导细胞向成骨、成脂方向分化,油红O染色,检测细胞内碱性磷酸酶(ALT)、甘油三酯(TG)含量。结果兔骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特性,形状以梭形、纺锤形为主,后期多数细胞呈长梭形;细胞生长较旺盛,可连续传7~10代,以第3代细胞状态最佳;第3代骨髓间充质干细胞CD29表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨、成脂诱导后,油红O染色出现明显脂滴,ALT、TG含量明显增高。结论全骨髓贴壁法可成功分离和培养出兔骨髓间充质干细胞,具有间充质干细胞的一般生物学特性,且生长状态良好,增殖力强,经诱导后具有向成骨和成脂分化的潜能,该方法获得的骨髓间充质干细胞可能成为组织工程的优良种子细胞。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。