重组杆状病毒载体介导钠碘转运体基因在胰岛细胞中表达的研究

目的 探讨以杆状病毒为载体,钠碘同向转运体(NIS)基因作为报告基因监测胰岛细胞的可行性.方法 通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备绿色荧光蛋白(GFP)和NIS基因重组杆状病毒(Bac-GFP和Bac-NIS).分别以不同感染复数(MOI)的Bac-GFP感染大鼠胰岛细胞,荧光显微镜观察胰岛细胞的感染百分比和荧光表达强度;以MOI为40的Bac-GFP感染胰岛细胞,荧光显微镜下观察荧光表达时间及细胞生存状态.以不同MOI的Bac-NIS感染胰岛细胞,测定感染细胞的碘摄取情况;以MOI为40的Bac-NIS感染胰岛细胞,动态观察感染细胞摄碘能力的变化以及高氯酸钠(NaClO4)对细胞摄碘的影响.结果 Bac-GFP可高效感染SD大鼠胰岛细胞,对细胞无毒性作用;感染的胰岛细胞百分比和荧光强度随MOI的提高而上升,细胞感染百分比可高达95％以上(MOI =40),且荧光表达时间可持续2周左右.Bac-NIS感染的胰岛细胞表现出摄碘功能增强和NaClO4抑制摄碘的特性,且感染细胞摄碘的放射性计数随MOI的提高而增加;MOI为40时,Bac-NIS感染细胞摄碘的放射性计数是空白对照的12倍.结论 杆状病毒介导的NIS基因在胰岛细胞中高效表达,有效介导放射性碘摄取,可用对胰岛细胞移植情况的监测.     

重组杆状病毒载体介导报告基因在甲状腺癌细胞中的表达研究

目的 探讨杆状病毒作为甲状腺癌基因转移和治疗载体的可行性.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统制备携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组杆状病毒(Bac-GFP).分别以不同感染复数(MOI)的Bac-GFP感染滤泡状甲状腺癌细胞株FTC-133,流式细胞仪鉴定感染效率及GFP表达强度.以MOI为100的Bac-GFP感染FTC-133,荧光显微镜观察GFP表达持续时间;流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠干预对感染效率及GFP表达强度的影响.MTT比色法检测不同MOI的Bac-GFP感染对FTC-133细胞存活的影响.结果 成功制备重组杆状病毒载体Bac-GFP并感染FTC-133.感染效率随MOI的增加而提高;当MOI为100时,感染效率高达71.3%.丁酸钠可提高Bac-GFP对FTC-133的感染效率及GFP表达强度,但感染效率的提高无统计学意义.荧光显微镜观察显示,Bac-GFP感染FTC-133其GFP表达可持续2周.MTT检测显示,不同MOI的Bac-GFP感染FTC-133的细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 重组杆状病毒Bac-GFP对FTC-133细胞具有较高的感染效率.报告基因表达时间较长且无明显细胞毒性,有可能成为甲状腺癌基因治疗的良好载体.     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点.方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MO1的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系.通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度.结果发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2 d最高,至少可持续9 d.Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异.结论重组杆状病毒可以用于体外基因转导.     

重组杆状病毒载体介导报告基因在甲状腺癌细胞中的表达研究

目的探讨杆状病毒作为甲状腺癌基因转移和治疗载体的可行性。方法利用杆状病毒Bac—to—Bac表达系统制备携带绿色荧光蛋白（GFP）的重组杆状病毒（Bac—GFP）。分别以不同感染复数（MOI）的Bac—GFP感染滤泡状甲状腺癌细胞株FTC-133,流式细胞仪鉴定感染效率及GFP表达强度。以MOI为100的Bac—GFP感染FTC-133,荧光显微镜观察GFP表达持续时间;流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠干预对感染效率及GFP表达强度的影响。MTT比色法检测不同MOI的Bac—GFP感染对FTC-133细胞存活的影响。结果成功制备重组杆状病毒载体Bac—GFP并感染FTC-133。感染效率随MOI的增加而提高;当MOI为100时,感染效率高达71．3％。丁酸钠可提高Bac—GFP对FTC-133的感染效率及GFP表达强度,但感染效率的提高无统计学意义。荧光显微镜观察显示,Bac—GFP感染FTC-133其GFP表达可持续2周。MTT检测显示,不同MOI的Bac—GFP感染FTC-133的细胞存活率比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论重组杆状病毒Bac—GFP对FTC-133细胞具有较高的感染效率,报告基因表达时间较长且无明显细胞毒性,有可能成为甲状腺癌基因治疗的良好载体。     

人钠/碘同向转运体基因转染肺癌A549细胞介导放射性碘摄取实验研究

目的:研究重组人钠/碘同向转运体基因(hNIS)腺病毒介导肺癌A549细胞的碘摄取、外流和杀伤情况,为放射性碘治疗肺癌提供理论和实验依据。方法:用重组hNIS腺病毒(AdNIS)感染肺癌A549细胞,检测感染细胞内hNIS蛋白的表达;在体外培养的条件下研究其125I的摄取、外流情况以及131I的杀伤情况。结果:hNIS蛋白在实验组肺癌A549细胞中表达阳性且主要分布于细胞膜上;实验组细胞摄碘能力较对照组高;细胞摄碘后碘外流过程十分迅速;实验组细胞可被131I有效杀伤。结论:应用腺病毒为载体,可以有效的将hNIS基因转染至体外培养的肺癌A549细胞中,并介导肺癌细胞对放射性碘的摄取及选择性杀伤作用。     

维甲酸对乳腺癌细胞MDA-MB453钠碘转运体调控

目的本实验通过维甲酸对乳腺癌细胞的钠碘转运体(NIS)基因及蛋白表达和摄碘功能的影响,探讨乳腺癌细胞NIS的表达特点和调控因素.方法我们采用乳腺癌细胞MDA-MB453进行培养,分别给予不同浓度的维甲酸(RA)进行刺激72 h.采用RT-PCR方法检测细胞中NIS的mRNA表达;用WesternBloot方法检测NIS蛋白水平;采用125I测定乳腺癌细胞摄碘功能的变化.结果乳腺癌细胞MDA-MB453在经过RA刺激后,细胞中NIS的mRNA表达比对照组有明显增加,并且与RA浓度成正比.细胞中NIS的蛋白表达比对照组也有明显增加,并且与RA浓度相关.经过RA刺激的乳腺癌细胞摄碘能力明显增加.结论维甲酸对乳腺癌细胞MDA-MB453的NIS基因和蛋白表达均有促进作用,而且促进乳腺癌细胞的摄碘,这提示维甲酸可能通过调节乳腺癌NIS基因和蛋白的表达,从而影响乳腺癌细胞对放射性碘治疗的敏感性.     

分化型甲状腺癌细胞株FTC-133失分化现象与131I辐射的关系

目的 研究体外培养的分化型甲状腺癌细胞株FTC-133失分化现象与放射性碘(131Ⅰ)辐射的关系.方法 体外培养的甲状腺癌细胞株FTC-133分为实验组(以经筛选不造成细胞增殖抑制剂量的Na131Ⅰ辐射细胞48 h,长期传代培养)、对照组(不加入Na131Ⅰ,长期传代培养)和空白组(细胞冻存,实验时复苏).测定各组细胞摄碘率;分别采用RT-PCR、Western blotting和放射免疫分析法(RIA)检测各组细胞甲状腺球蛋白(Tg)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、钠碘转运体(NIS)、促甲状腺激素受体(TSHR)mRNA和蛋白表达.结果 细胞摄碘率为空白组>对照组>实验组,组间比较差异均有统计学意义(P<0.01).与空白组比较,实验组和对照组细胞Tg、TPO、NIS、TSHR蛋白表达均明显下降,且以实验组下降尤为显著.组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);三组Tg、TPO、NIS和TSHR mRNA与蛋白表达变化一致.结论 分化型甲状腺癌细胞FTC-133长期体外培养自动经历失分化过程,131Ⅰ辐射促进这一过程的发展,可能与甲状腺特异蛋白表达下降有关.     

分化型甲状腺癌细胞株FTC-133失分化现象与131Ⅰ辐射

目的 研究体外培养的分化型甲状腺癌细胞株FTC-133失分化现象与放射性碘(131Ⅰ)辐射的关系.方法 体外培养的甲状腺癌细胞株FTC-133分为实验组(以经筛选不造成细胞增殖抑制剂量的Na131Ⅰ辐射细胞48 h,长期传代培养)、对照组(不加入Na131Ⅰ,长期传代培养)和空白组(细胞冻存,实验时复苏).测定各组细胞摄碘率;分别采用RT-PCR、Western blotting和放射免疫分析法(RIA)检测各组细胞甲状腺球蛋白(Tg)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、钠碘转运体(NIS)、促甲状腺激素受体(TSHR)mRNA和蛋白表达.结果 细胞摄碘率为空白组>对照组>实验组,组间比较差异均有统计学意义(P<0.01).与空白组比较,实验组和对照组细胞Tg、TPO、NIS、TSHR蛋白表达均明显下降,且以实验组下降尤为显著.组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);三组Tg、TPO、NIS和TSHR mRNA与蛋白表达变化一致.结论 分化型甲状腺癌细胞FTC-133长期体外培养自动经历失分化过程,131Ⅰ辐射促进这一过程的发展,可能与甲状腺特异蛋白表达下降有关.     

人抗黏液病毒A基因重组腺病毒体外抗乙型肝炎病毒的作用

目的:研究人抗黏液病毒A(MxA)基因重组腺病毒AdMxA体外抗乙型病毒性肝炎病毒(HBV)的作用效果.方法:以1倍感染复数(MOI)(1倍MOI感染组)及5倍MOI(5倍MOI感染组)的重组腺病毒AdMxA分别转染HepG2.2.15细胞,以未感染HepG2.2.15细胞为对照(未感染组).利用RT-PCR检测3组H...     

杆状病毒介导内耳基因治疗的实验研究

目的探讨重组杆状病毒作为内耳基因治疗载体的可行性及其转染特点。方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,建立新生大鼠耳蜗Corti器体外模型,加入携带报告基因的病毒悬液,观察外源基因表达情况,并将其通过圆窗直接显微注射进入豚鼠内耳,观察杆状病毒在体内的转染特点。结果Bac-GFP联合丁酸钠可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞,但并没有改变Corti器的正常结构。体内试验显示杆状病毒可以忠实和长效转染螺旋神经节细胞,而未被补体系统灭活。结论实验证实杆状病毒有希望成为内耳基因治疗的新型载体。     

重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌细胞增值的影响

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人胃癌细胞SCG7901增值的影响.方法 重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和对照组不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对SCG7901细胞生长增值的影响.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞同未转染的各自细胞在细胞生长方面无显著性差异(P＞0.05).在前药应用下,已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感(P＜0.01).融合基因的疗效优于单一自杀基因(P＜0.01).结论 KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,抑制其增值.     

基于hNIS基因的辐射正反馈重组杆状病毒体系制备

目的构建含早期生长应答因子1（Egrl）辐射敏感启动子调控的人钠碘同向转运体（hNIS）基因重组杆状病毒，为进一步延长核素在细胞中的滞留时间，提高hNIS介导的恶性肿瘤放射性核素基因靶向治疗疗效提供理论基础。方法空载体pFB取自质粒pFB—CMV—EGFP，Egrl启动子取自质粒PGL3一Egrl—luc，hNIS取自质粒pcDNA3．1一CMV—hNIS，构建重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—Hnis；同时构建含CMV启动子的质粒pFB—CMV—hNIS作为阳性对照，并将杆状病毒空载体质粒pFB-0作为阴性对照。随后制备各组杆状病毒，扩增收集重组杆状病毒并进行滴度测定。为进一步鉴定病毒功能，一方面通过体外感染U87脑胶质瘤细胞并采用131I刺激，通过免疫荧光检测131I刺激后的hNIS蛋白表达；另一方面通过摄碘实验进一步验证所表达的hNIS蛋白的摄碘功能和特性。结果成功构建重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—hNIS和pFB—CMV—hNIS；转座成功并提取了重组Bacmid；重组Bacmid转染Sf9细胞后扩增收集的重组杆状病毒滴度可以达到1×1010pfu／mL。体外感染U87细胞后，免疫荧光检测表明131I刺激后可增加hNIS的表达，感染细胞表达的hNIS蛋白位于细胞膜上，且具有摄碘的功能。结论成功构建了重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—hNIS及pFB—CMV—hNIS，获得高滴度的重组杆状病毒Bac—Egrl—hNIS、Bac．CMV—hNIS和Bac-0并得到验证；建立了基于hNIS基因的辐射正反馈重组杆状病毒体系，为进一步提高核素靶向治疗疗效奠定了重的理论基础。     

心肌特异性启动子引导的rNIS基因的摄碘动力学研究

目的构建肌凝蛋白轻链蛋白-2（myosinlightchain-2,MLC-2p）启动子调控的钠／碘转运体（sodium／iodidesym—porter,NIS）的腺相关病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中特异性表达的可行性。方法构建rAAV9-rMLC-2p—rNIS及rAAV9-CMV—rNIS重组腺相关病毒,经酶切鉴定及效价测定。rAAV9-rMLC-2p—rNIS及rAAV9-CMV—rNIS体外感染心肌细胞和非心肌细胞,行动态摄碘及NaCl0。抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性。结果成功构建rAAV9-rMLC-2p—rNIS及rAAV9-CMV—rNIS,测得效价为rAAV9-rMLC-2p—rNIS2．46×1012μg／ml,rAAV9-CMV—rNIS4．21×1012μg／ml。动态摄碘实验表明感染rAAV9-rMLC-2p—rNIS的心肌细胞的Na125I摄取明显高于非心肌细胞,且能被NaCIO。特异性抑制,证实了rMLC-2p启动子的心肌特异性及转染细胞表达的rNIS蛋白有功能。结论成功构建了MLC-2p启动子调控NIS的腺相关病毒载体,证实了外源基因在心肌细胞中的特异性表达,为进一步以该报告基因系统的体内动物实验打下基础。     

分化型甲状腺癌细胞株FTC-133失分化现象与^131I辐射的关系

目的研究体外培养的分化型甲状腺癌细胞株FTC-133失分化现象与放射性碘（^131I）辐射的关系。方法体外培养的甲状腺癌细胞株FTC-133分为实验组（以经筛选不造成细胞增殖抑制剂量的Na^131I辐射细胞48h,长期传代培养）、对照组（不加入Na^131I,长期传代培养）和空白组（细胞冻存,实验时复苏）。测定各组细胞摄碘率;分别采用RT—PCR、Western blotting和放射免疫分析法（RIA）检测各组细胞甲状腺球蛋白（Tg）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、钠碘转运体（NIS）、促甲状腺激素受体（TSHR）mRNA和蛋白表达。结果细胞摄碘率为空白组〉对照组〉实验组,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。与空白组比较,实验组和对照组细胞Tg、TPO、NIS、TSHR蛋白表达均明显下降,且以实验组下降尤为显著,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）;三组Tg、TPO、NIS和TSHRmRNA与蛋白表达变化一致。结论分化型甲状腺癌细胞FTC-133长期体外培养自动经历失分化过程,^131I辐射促进这一过程的发展,可能与甲状腺特异蛋白表达下降有关。