restin及其位点缺失体的表达载体构建、表达及分析

目的 构建人restin及其核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)、酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ,CKⅡ)作用位点缺失体基因rt1、rt2的真核表达载体并检测其在非洲绿猴肾细胞COS-7中的表达.方法 应用RT-PCR方法从体外培养的人胚肾细胞HEK293的mRNA中扩增出restin及其缺失体基因的编码区,克隆至pMD18T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)3×flag,酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测restin、rt1、rt2的表达及其亚细胞定位情况,从而确定功能位点缺失是否影响了Restin的核定位.结果 测序证实PCR扩增得到的restin、rt1、rt2基因编码区序列正确;脂质体法转染COS-7细胞后检测到预期目的 蛋白的表达.截取NLS/CKII位点阻滞了Restin的细胞核定位.结论 成功构建了restin及其缺失体基因的真核表达载体并使其在COS-7细胞中表达并检测到功能结构域的缺失引起蛋白Restin的核定位变化.     

人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建含人cD81基因的真核表达载体，探讨CD81在COS-7细胞的表达，为研究丙型肝炎病毒(1-ICV)与cD81相互作用奠定基础．方法：从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81，应用双酶切回收基因片段，定向克隆入真核表达载体pVAX1；通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞；应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物．结果：重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确，并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白．结论：成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81，并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子，该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型．     

Nogo-66受体LRR功能区的真核分泌表达

目的: 构建含有人Nogo-66受体LRR功能区段cDNA序列的真核分泌型表达载体,并在COS-7细胞中表达. 方法: 采用定向克隆的策略,在保证阅读框正确的前提下,从原核表达载体pES-His/LRR上切下编码LRR的DNA片段,亚克隆入真核分泌型表达载体pSectag2B中,构建LRR与c-Myc表位、6His标签基因相融合的真核表达质粒pSectag2B/LRR,在Lipofectamine 2000介导下瞬时转染COS-7细胞. 结果: 利用针对c-Myc表位和6His标签的抗体分别作免疫荧光和Westernblot,证实胞内表达正确融合的目的蛋白;同时双抗体夹心ELISA也检测到转染细胞上清中存在融合蛋白. 结论: 真核表达质粒构建成功,转染后目的蛋白在COS-7细胞中实现分泌表达.     

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩...     

人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性.方法 全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性.脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达.结果 正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达.结论 采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达.     

IL-27亚基基因真核表达质粒的构建与表达

目的 克隆人白细胞介素27(interleukin 27,IL-27)蛋白亚基EB病毒诱导的基因3(Epstein-Barr vi-rus-induced gene 3,EBI3)与p28基因的cDNA,分别构建其真核表达质粒并在COS-7细胞表达.方法 人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增EBl3与p28基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建真核表达载体pcDNA-EBI3与pcDNA-p28.重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR检测目的 基因表达.结果 成功构建克隆人IL-27蛋白亚基真核表达质粒,重组质粒分别转染COS-7细胞后检测到相应基因表达.结论 人IL-27蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建,为构建表达有生物学活性的重组人单链IL-27蛋白奠定基础.     

人连接蛋白Connexin26基因的克隆、表达及初步鉴定

目的研究含人连接蛋白Connexin26（Cx26）基因的真核表达载体构建及其在非洲猴肾细胞（COS-7）中获得稳定、高效表达的方法。方法提取人外周血淋巴细胞RNA,经逆转录制备成cDNA,设计特异性引物,用PCR方法从cDNA中扩增Cx26基因,将其定向插入真核表达载体pCI-neo中获得pCI-Cx26重组子-采用酶切法和测序法鉴定。用脂质体将pCI-Cx26转染COS-7细胞,经G418筛选,获得阳性克隆。用RT-PCR和SDS-PAGE检测对表达产物进行检测。结果从人外周血RNA制备而成的cDNA中可扩增出预期大小的Cx26基因片段,pCI-Cx26经双酶切测序证实构建成功。RT-PCR和SDS-PAGE检测到pCI-Cx26在COS-7细胞中获得稳定、高效表达。结论本研究成功构建了人连接蛋白Cx26基因重组真核表达载体pCI-Cx26：pCI-Cx26脂质体转染COS-7细胞,可见Cx26基因在COS-7细胞中获得稳定、高效的表达。该结果为今后进行pCI-Cx26基因治疗Cx26基因突变引起的遗传性耳聋的研究奠定了实验基础。     

人穿孔素基因的克隆及其在HepG-2细胞中的表达

目的：观察克隆的人穿孔素(perforin,PFN)基因在HepG-2细胞中的表达及其对转染的HepG-2细胞的作用．方法：用RT-PCR方法获取人PFN cDNA．将所获基因克隆入真核表达载体pcDNA3．1^- A,转染HepG-2细胞．间接免疫荧光法检测目的蛋白表达,电镜观察转染细胞的形态和结构变化,细胞计数检测转染目的基因后细胞的增殖情况．结果：成功获得人PFN全长cDNA,并构建了真核表达载体．转染HepG-2细胞后,检测出目的蛋白的表达．细胞计数发现细胞增殖被明显抑制．电镜观察显示,崩解的细胞呈现坏死的典型特征．结论：人PFN全长cDNA可以在转染的HepG-2细胞中表达,并且可使转染细胞的形态发生变化,出现大量细胞坏死．     

小鼠GATA4基因真核表达载体的构建及其在P19细胞中的表达

目的:构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,检测其在P19细胞中的表达.方法:由于GATA4基因的全长编码区的GC含量很高,因此本实验采用分段克隆后PCR拼接的方法获得GATA4基因的全长编码序列,连接入pMD19-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pCDNA 3.1A,构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,测序验证无误后,采用脂质体介导法转染至P19细胞,Western blot检测其在P19细胞中的表达.结果:成功扩增小鼠GATA4基因全长编码区,测序证明重组真核表达载体pCDNA3.1A-GATA4构建成功,Western blot确认目的基因在P19细胞中过表达.结论:pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体构建成功,并在P19细胞内过表达,将为研究其在心肌分化、心脏发育中的功能奠定基础.     

Rab7真核表达载体的构建及其在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中的表达

目的 构建Rab7的真核表达载体,研究其在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达.方法 RT-PCR方法分析Rab7在组织和细胞中的表达.以RAW264.7细胞的cDNA为模板,根据GenBank公布的小鼠Rab7全长序列设计引物,扩增Rab7基因的开放阅读框.将其与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建pcDNA-Rab7重组质粒.用脂质体将Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞,RT-PCR和Western blot法鉴定Rab7的过表达.结果 Rab7重组载体测序结果与GenBank中报道的Rab7序列的同源性为100％.RT-PCR和Western blot结果显示Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞后,Rab7表达显著增高.结论 成功构建了Rab7真核表达载体.为今后研究Rab7在巨噬细胞中的功能奠定了基础.     

胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建胱抑素C（cystatin C,Cys-C）原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a（＋）-CysC,转化大肠埃希菌Rosetta,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside,IPTG）诱导表达、经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明,人Cys-C基因成熟肽编码区编码122个氨基酸;与GeneBank（NM-000099.2）中已报道的序列有100%的同源性。经IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和ELISA分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%,重组蛋白相对分子质量约为20000,经Ni2＋-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达,并经镍柱亲和层析得到较纯的胱抑素。     

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达

目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列,采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T,筛选正确的质粒后,再亚克隆至pcDNA3.1（＋）。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞,通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示,转染的重组质粒在相对分子质量92×103处有相应条带出现。结论成功构建了MLK3的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

PSD-95酪氨酸突变体真核表达载体的构建及其表达

目的构建突变型PSD-95的重组表达质粒(Y432F、Y439F、Y523F和Y533F,酪氨酸突变为苯丙氨酸),并在COS-7细胞中表达。方法以野生型PSD-95-pcDNA3.1为模板,采用重叠延伸PCR法获得突变型PSD-95的局部或全长cDNA片段,并克隆至PSD-95-pcDNA3.1或pcDNA3.1载体;以脂质体法将构建好的重组质粒转染COS-7细胞;通过免疫印迹法鉴定PSD-95及其突变体的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的突变型PSD-95基因完全正确。免疫印迹显示,转染的突变型重组质粒在相对分子质量9.5×104处均有相应条带出现。结论成功构建了4个PSD-95酪氨酸残基突变体的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

丙型肝炎病毒结构蛋白真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)结构蛋白的真核表达载体.方法:用RT-PCR方法扩增HCV结构基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3中,用磷酸钙转染法将其转入Sp2/0细胞,用免疫组化法检测细胞中瞬时表达的目的蛋白.结果:克隆的基因片段全长约1.9kb,包括C及E2的全长和E1的部分.免疫组化显示表达蛋白位于细胞浆中.结论:构建的丙型肝炎病毒结构蛋白的真核表达载体能够在哺乳动物细胞中得到表达,为进一步研究HCV结构蛋白的性质及各结构蛋白相互作用下的基因免疫效果奠定了基础.     

表达盒两侧不同核基质结合区序列介导表达载体的构建

目的构建表达盒两侧含有不同来源核基质结合区(MAR)序列的载体pCCF-βg,为进一步研究MAR的调控功能提供基础。方法用限制酶酶切质粒pCCM-in,将切下的interferon-MAR片段连接至表达盒一侧含有globin-MAR的表达载体上,构建表达盒两侧含异源MAR的表达载体pCCF-βg。结果酶切及琼脂糖凝胶电泳证实所构建的载体pCCF-βg正确,pCCF-βg表达盒两侧分别含有interferon-MAR和globin-MAR片段。结论成功构建了表达盒两侧含有不同来源的MAR片段的载体pCCF-βg。     

真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Asc12的构建及表达

目的 构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2,并在真核细胞HEK293T细胞中表达,为今后研究Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定实验基础.方法 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因,连接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中,构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒.通过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染.Realtime-PCR及Westernblot方法分析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达情况.结果 经Realtime-PCR及Westernblot方法,证实Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达.结论 成功建立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒,并能在HEK293T细胞中表达,为进一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了实验基础.