RNA干扰技术抑制胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的实验研究

构建特异性针对胰腺癌细胞株PANC-1的重组质粒pcensil-1-P1(阴性对照pGensil-1-HK)并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用RT-PCR法和蛋白免疫印迹(westem bloning)法检测PANC-1细胞K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.结果测序证实质粒表达载体构建成功,PANC-1细胞突变型K-ras mRNA及蛋白表达较非特异性转染组以及未转染组、阴性对照组相比明显减少,细胞生长受到明显抑制(P＜0.05).认为RNA干扰技术对特异性转染的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞生长受到抑制;本研究为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法.     

短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响

目的:研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建特异性针对胰腺癌PANC-1细胞突变型K-ras基因的重组质粒pGensil-1-P1,阴性对照质粒pGensil-1-HK并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.并建立人胰腺癌细胞PANC-1裸鼠皮下移植瘤模型,分别注射Pgenesil-1-P1、Pgenesil-1-HK质粒,动态观察并处死裸鼠计算肿瘤体积.结果:测序证实质粒表达载体构建成功,短发夹RNA(shRNA)使胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因的mRNA较未治疗组、阴性对照组相比明显减少(P=0.01);未治疗组、阴性对照组及治疗组的K-ras蛋白表达率分别为100%,99.0%±0.73%,39.9%±2.1%,前两组K-ras蛋白表达差异无统计学意义,治疗组较未治疗组K-ras蛋白表达下调了约60.1%;细胞生长受到明显抑制(P=0.02);经重组质粒治疗14 d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小(P=0.03).结论:shRNA对特异性转染组的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞以及裸鼠移植瘤的生长受到抑制.     

RNA干扰抑制FAK基因表达对人胰腺癌细胞凋亡及吉西他滨敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制黏着斑激酶（FAK）基因表达增强人胰腺癌PANC-1细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的研究.方法 针对FAK mRNA序列设计合成短发夹状干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT-FAK重组表达载体,转染人胰腺癌PANC-1细胞;通过RT-PCR分析其对PANC-1细胞内源性FAK表达的影响;激光共聚焦显微镜检测PANC-1细胞凋亡的形态学改变;用四甲基偶氮唑蓝法观察PANC-1细胞对化疗药物吉西他滨敏感性的改变;采用分光光度计检测 Caspase 活性.结果 成功构建 pRNAT-FAK重组质粒,并成功转染PANC-1细胞;RT-PCR证实重组质粒在mRNA显著抑制FAK基因表达（P＜0.01）;吉西他滨组及吉西他滨加pRNAT-FAK组细胞则检测出明显的细胞凋亡;四甲基偶氮唑蓝结果证明在和吉西他滨联合作用下,pRNAT-FAK组PANC-1细胞的生长抑制率明显增高（P＜0.01）;Caspase 3活性明显高于空白对照绀和阴性对照组.结论 pRNAT-FAK可抑制FAK在人胰腺癌PANC-1细胞中的表达,并增强PANC-1细胞对吉西他滨敏感性.     

TFPI-2基因体外诱导胰腺癌Panc-1细胞的凋亡

目的: 将TFPI-2基因转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞, 研究其对胰腺癌细胞凋亡的影响.方法:将重组质粒pEGFP-C1-TFPI-2通过脂质体介导转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞, G418筛选获得阳性细胞克隆后, 用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术分别检测转染细胞中TFPI-2 mRNA及相应蛋白的表达, 同时测定转染细胞的生长曲线和凋亡情况. 结果: 同转染空载体及未转染细胞相比, 转染成功的Panc-1细胞可以检测到TFPI-2 mRNA和相应蛋白的表达, 细胞生长受到抑制(n = 9, P = 0.02), DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的"梯状"条带.结论:外源性TFPI-2基因能够抑制胰腺癌细胞生长增殖、诱导胰腺癌细胞凋亡.     

转录因子ETS1 RNA干扰质粒的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立

目的:构建针对人转录因子ETS1的RNA干扰质粒,鉴定并建立干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC-1细胞株.方法:分别构建3条针对ETS1基因的shRNA干扰质粒(shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3),并将其转染至人胰腺癌PANC-1细胞株,用药物G418筛选出稳定细胞株,Western blot鉴定稳转细胞株中ETS1表达量.结果:3条针对ETS1基因的shRNA干扰质粒转染胰腺癌PANC-1细胞株后,Western blot检测结果显示干扰质粒1(shRNA-1)具有最佳干扰效果.将具有最佳干扰效果的质粒稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞株后,经Western blot鉴定相较于对照组稳定细胞株其ETS1表达量明显降低.结论:成功构建了针对人转录因子ETS1的RNA干扰质粒,并建立其稳定转染的人胰腺癌PANC-1细胞株.     

小鼠TRAF6基因shRNA真核表达载体的构建与表达

目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6 -shRNA1,2,3,4,并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW 264.7细胞中,观察转染效果.结果:靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1,2,3,4,经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功.应用荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%,以2∶5为最佳比例.只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.结论:TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功,为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础.     

肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究

目的构建以大鼠CTGF和TIMP-1基因为靶点的双重RNA干扰表达载体质粒,以检测其转染肝星状细胞的效率.方法筛选出对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,各设计1对含有短发夹结构的RNA 干扰靶点序列,分别克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CT-GF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com（含有CTGF和TIMP-1）,进行酶切和测序鉴定.将构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染大鼠肝星状细胞,在荧光显微镜下观察质粒转染情况,用流式细胞仪检测转染效率.结果酶切与测序结果提示重组质粒 psiRNA-GFP-CTGF、psiR-NA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com成功构建;成功将重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染肝星状细胞,在24小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF ＋TIMP-1组转染效率分别为15±2%、13±1%、15±1%和14±2%,均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组（Com组,20±2%,P〈0.05）;在48小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF＋TIMP-1组转染效率分别为10±2%、9±1%、8±2%和10±1%,均低于Com组的15±2%（P〈0.05）.结论成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的双重RNA干扰表达质粒,能转染至肝星状细胞,并且psiRNA-GFP-Com转染效率最高.     

Survivin-siRNA真核重组质粒的构建和鉴定及其对前列腺癌DU145细胞的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA,并检测其对DU145细胞株内源性survivin基因和蛋白表达的影响.方法 构建重组质粒shRNA-sur1和-sur2并分别转染 DU145细胞株,通过半定量 RT-PCR和Western印迹检测survivin mRNA转录水平和蛋白表达的变化.结果 成功构建针对survivin干扰的两种真核表达质粒;两种重组质粒shRNA-sur1和-sur2均能明显抑制内源性survivin基因表达,其抑制率分别为72%±8%和77%±5%;两种质粒均能明显抑制survivin蛋白的表达,其抑制率分别为75%±8%和80%±6%.结论 重组质粒shRNA-sur1和-sur2均可明显抑制DU145细胞内源survivin 蛋白表达和mRNA转录,为survivin介导的肿瘤基因沉默提供良好的基础.     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3(STAT3)表达的抑制作用.方法 设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建STAT3 siRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染SW1990细胞,实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变.结果 PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功,分别转染SW1990细胞后,STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P＜0.05),其中,第二种STAT3 siRNA作用明显,可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63%和60%.结论 本研究构建的STAT3 siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达,为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础.     

PDECGF-siRNA诱导膀胱癌细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨RNA干扰技术沉默血小板源性内皮生长因子基因(platelet-derived endothelial cell growth factor, PDECGF)表达诱导人膀胱癌细胞凋亡的机制.方法 针对人PDECGF mRNA序列设计合成编码干扰RNA (siRNA) 的DNA模板, siRNA;构建含RNA聚合酶启动子Ⅲ转录载体pRNAT-U6/Neo并能形成发夹结构小干扰RNA(siRNA)的psiPDECGF质粒;用其转染人膀胱癌T24细胞株,采用RT-PCR、Western 印迹法观察转染前后PDECGF基因及相关基因表达变化,采用凋亡DNA琼脂糖凝胶电泳及吖啶橙/溴化乙啶染色法观察细胞凋亡.结果 显示PDECGF siRNA对膀胱癌T24细胞中PDECGF基因表达产生明显抑制作用;转染psiPDECGF-2细胞组PDECGF mRNA水平明显降低,上述重组质粒可诱导T24细胞凋亡,同时caspase-3、p53蛋白水平明显增高.结论 证实psiPDECGF-2可抑制PDECGF在T24细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.其机制与caspase-3、p53蛋白水平表达增高有关.     

转化生长因子βⅠ型受体基因的靶向小干扰RNA抑制肝星状细胞合成胶原的体外研究

目的 观察大鼠转化生长因子βⅠ型受体(TβR Ⅰ)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)表达质粒对肝星状细胞(HSC)合成胶原的影响.方法 根据大鼠Tβ R Ⅰ的基因序列,设计并构建3个大鼠TβR Ⅰ基因的靶向siRNA表达质粒,以脂质体作转染试剂,将siRNA表达质粒分别转染至HSC-T6细胞中,RT-PCR和Western印迹技术分析TβRⅠ mRNA及蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,放射免疫法测HA、PCⅢ含量.采用LSD法进行统计学处理.结果 酶切证实siRNA的目的 基因片段已成功克隆入载体中.与空白对照组比较,转染siRNA表达质粒后,3组HSC-T6细胞TβR Ⅰ mRNA表达水平均抑制,其中以psiRNA2组抑制作用最强(psiRNA1组:t=7.354,P＜0.01;psiRNA2组:t=9.214,P＜0.01;psiRNA3组:t=5.967,P＜0.01).3组TβRⅠ蛋白表达水平均降低,以psiRNA2组降低最明显(psiRNA1组:t=6.324,P＜0.01;psiRNA2组:t=8.741,P＜0.01;psiRNA3组:t=4.128,P＜0.01).3组HSC-T6细胞增殖活性均下降,合成胶原均减少,以psiRNA2组最明显;而转染无关siRNA组无明显变化.结论 构建的TβR Ⅰ siRNA表达质粒可抑制HSC-T6细胞合成胶原,为肝纤维化基因治疗提供新的靶点.     

肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞MMP-1和TIMP-1表达的作用研究

目的 构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因（NOV）的小干扰RNA（siRNA）的重组质粒，研究NOV对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达的影响。方法 以NOV为目的基因，以质粒psiRNA-hH1 neo为载体，构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA（psiRNA1、2、3）和阴性对照重组质粒pconsiRNA。限制性酶切和测序鉴定构建成功后，脂质体介导重组质粒转染HSC，依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组，并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组。半定量RT-PCR检测HSC的NOV、MMP-1、TIMP-1 mRNA表达情况，MTT法检测细胞增殖。结果限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOV siRNA表达质粒；与阴性对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV的mRNA表达水平下降（P〈0．05），MMP-1mRNA表达水平下降不明显（P〉0．05），而TIMP-1 mRNA表达水平明显下降（P〈0．05）。与空白对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC增殖活性显著降低（P〈0．05）。psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV、MMP-1和TIMP-1 mRNA的表达及HSC增殖活性均无明显下降（P均〉0．05）。结论NOV可促进HSC增殖及表达TIMP-1增加，而对MMP-1表达影响不大，提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点。     

靶向乙型肝炎病毒X蛋白小干扰RNA对稳定表达X基因的正常人肝细胞株线粒体功能的影响

目的 构建并鉴定靶向HBV X蛋白(HBx)小干扰RNA(siRNA)重组表达质粒,观察其对稳定表达HBx基因的正常人肝细胞株HL-7702/HBx线粒体功能的影响.方法 设计合成两条针对全长HBx基因具有短发夹结构的siRNA序列,克隆至载体psiRNA-Hh1GFPzeo中,构建重组表达质粒pX1和pX2,并以不针对任何序列的重组质粒pScr作为对照.通过脂质体介导转染人HL-7702/HBx肝细胞株,RT-PCR及Western印迹检测其对HBx的阻抑效应.流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△ m)水平的变化.采用方差分析对实验结果进行统计分析.结果酶切鉴定和测序结果证实pX1和pX2构建成功.pScr、pX1、pX2分别转染入HL-7702/HBx细胞48 h后,空白对照组HBx mRNA和蛋白表达水平分别为0.65±0.12和0.62±0.09,pX1组分别为0.33±0.10和0.19±0.08,明显低于空白对照组(t=4.73,P<0.05;t=7.53,P<0.05),pX2组分别为0.48±0.10和0.37±0.11,亦明显低于空白对照组(t=2.39,P<0.05;t=4.43,P<0.05),但pX1组抑制效果强于pX2组(t=2.28,P<0.05).RNA干扰后细胞内ROD水平为5.00±0.38,△ m水平为33.86±0.50;空白对照组ROS为72.10±0.55,△ m为3.57±0.26(t=276.22,P<0.05;t=107.15,P<0.05).结论 靶向HBx的siRNA能特异性抑制HBx在HL-7702/HBx细胞中的表达,并降低细胞内ROS水平,提高△ m水平,减轻细胞内氧化应激反应.     

小干扰RNA干扰高迁移率族蛋白1对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和凋亡的影响. 方法设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNAH1、siRNH2、siRNAH3),同时设未转染对照组(Lipo组)及转染阴性siRNA组(阴性siRNA对照组).脂质体法瞬时转染HepG2细胞,通过PCR法和Western blot检测细胞中HMGB1基因在mRNA水平和蛋白质水平的变化,利用四甲基偶氮唑盐法检测转染HMGB1-siRNA的HepG2细胞增殖情况,TdT酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.两组数据间比较用t检验,组内数据比较用方差分析,细胞增殖数据采用可重复双因素方差分析.结果 3对特异性HMGB1-siRNA转染后,HMGB1 mRNA相对表达量分别为1.147±0.024、1.014±0.042和0.435±0.055,较Lipo组的1.411±0.065明显减少(t值分别为7.187、9.018和20.689,P值均＜0.01);HMGB1蛋白相对表达量分别为0.369±0.035、0.340±0.028和0.097±0.020,较Lipo组的0.553±0.051明显减少(t值分别为6.678、7.919和17.287,P值均＜0.01),其中以siRNAH3抑制效果最好,抑制率可达到80%.转染siRNAH3后HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制,与Lipo组相比,72、96、120h时F值分别为34.651、540.550、3778.197,P值均＜0.01,HepG2细胞凋亡指数明显增高(F=130.696,P＜0.01).结论 靶向HMGB1基因的siRNA分子片段可以有效地抑制HepG2细胞生长,促进HepG2细胞凋亡,其作用与下调HMGB1的表达有关,HMGB1可能是肝癌治疗的一个潜在靶点.     

LXRα-shRNA真核表达质粒的构建及抑制LXRα表达的有效序列筛选

目的构建和筛选对肝X受体α(LXRα)mRNA和蛋白有抑制作用的LXRα质粒。方法从NCBI网站获得人的LXRαcDNA序列,根据RNA干扰设计原则,设计三条理论上最佳的siRNA序列,相应的双链DNA插入pGenesil-1.1载体中,经酶切和测序鉴定符合设计要求后,用转染试剂PolyJetTM将三条质粒转染至HepG2.2.15细胞中并观察转染效果。然后用RT-PCR和Western印迹方法分析各组LXRα的表达,筛选出干扰效率最佳的质粒。结果三个质粒经测序分析与设计的序列完全一致,酶切凝胶电泳证实质粒构建成功。三个质粒均能抑制LXRαmRNA和蛋白的表达,与shRNA-LXRα2和shRNA-LXRα3质粒比较shRNA-LXRα1质粒表达更低。结论成功构建了LXRαRNAi表达载体,且三条质粒均能高效抑制转染细胞中LXRα的表达,其中第一条质粒shRNA-LXRα1干扰效率最好,从而为脂肪肝的治疗提供了新的方法和材料。     

miRNA干扰质粒的构建及其对肝癌HepG2细胞IGF-Ⅱ表达的抑制作用

目的:研究miRNA干扰质粒对胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)在肝细胞癌表达的抑制作用,探讨IGF-Ⅱ在肝细胞癌治疗中的价值.方法:以人IGF-Ⅱ基因序列设计并合成4条miRNA,将miRNAA插入质粒构建pcDNA<'TA>6.2-GW/EmGFP miR 1-4干扰载体;筛选、转染HepG2细胞,以荧光定量PCR分...     

HCBP6模拟磷酸化重组质粒的构建与亚细胞定位

目的 构建HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的绿色荧光蛋白重组质粒,明确其亚细胞定位。方法 以构建含有570 bp的HCBP6外显子基因的绿色荧光蛋白重组质粒为基础,应用快速定点突变技术构建HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒。将重组质粒测序并进行序列比对。利用jetPRIME转染体系将HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒转染至细胞中,应用Real-Time PCR技术检测目的基因mRNA的表达,应用Western blot技术检测目的基因蛋白表达,应用荧光显微镜观察HCBP6不同位点磷酸化质粒的亚细胞定位。结果 将测序的重组序列与目的基因进行比对,发现重组序列与目的基因完全一致,说明HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒构建成功。RealTime PCR和Western blot表明,与对照组相比,实验组高表达HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的基因。免疫荧光显微镜可见10Ala主要在细胞质表达,WT、10Asp、151Ala、151Asp主要在细胞核表达。结论 构建的HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒可成功转染细胞并在细胞中高表达,HCB...     

J-HNP-1多肽的重组及体外抗菌作用研究

目的:将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行重组使其成为一种新的杀菌肽分子J-HNP-1,并将其构建于能有效表达和分泌活性J-HNP-1杀菌肽的哺乳动物细胞表达系统．方法:应用PCR技术从不同的质粒中获得J链基因和 HNP-1基因,然后应用重组PCR技术将这两个不同的基因连接在一起而成为J-HNP-1基因．将此基因克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1(-)／Myc-HisC中．用脂质体转染法将此重组子导入COS-7细胞,分别从 mRNA和蛋白质水平采用RT-PCR和Western blot分析 J-HNP-1的表达情况,并体外检测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性．结果:获得的J链基因和HNP-1基因大小分别为489和 297 bp．采用RT-PCR法从被转染的细胞中扩增出一条约786 bp的片段,其大小与预测相符;采用Western blot 印迹法．用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白及培养上清在约Mr 24 000处有强反应条带显示;抗菌活性检测显示,经rpcDNA3．1(-)／Myc-HisC／J-HNP-1转染的 COS-7细胞的可溶性蛋白和培养上清均有明显的抗菌活性,抑菌圈的直径分别为34和43 mm．结论:重组J-HNP-1基因构建到哺乳动物细胞表达系统,并体外表达,具有抑菌作用．