胰蛋白酶的固定化研究进展

固定化胰蛋白酶比自由酶有更好的热稳定性和pH稳定性、易于分离、可重复利用,因此更适合于实际应用。此文对近年来发展比较快的制备固定化胰蛋白酶固定化载体和方法进行综述。     

壳聚糖固定化胰蛋白酶亲和层析抑肽酶的条件及影响因素

利用壳聚糖固定化胰蛋白酶作为亲和吸附剂从牛肺中直接分离纯化抑防酶。该方法在适当的温度（35℃）、pH值（pH1．5）、离子强度（1．0mol／LKCI）以及吸附条件（176FIP／g）下，纯化的抑肽酶活性回收率达83％，比活可达5000kIU／mg以上。     

胰蛋白酶的固定化及其在玻璃酸制备中的应用

纸纤维为载体,对β－硫酸酯乙砜基苯胺为活化剂,以共价介联法固定化胰蛋白酶。在偶联反应ｐＨ８．０、酶量７．２６ｍｇ／ｍｌ的最佳固定化条件下,固定化酶活力达９３．３Ｕ／ｇ（湿纸纤维）,酶活回收率为５７．５％。固定化酶具有较高热稳定性和抗氯仿能力。采用固定化胰蛋白酶酶解工艺,所得玻璃酸成品符合质量标准,其酶解反应半衰期为４８０ｈ。     

固定化胰蛋白酶的性质研究

目的　测定固定化胰蛋白酶的催化特性和部分稳定性。方法　在相同的条件下,测定固定化和可溶性胰蛋白酶的活力,得其最适作用pH值和最适作用温度,再测定活力,得到各自的米氏常数(Km)值;测得两种状态酶的热稳定性和酸碱稳定性。同时测定了固定化胰蛋白酶的低温稳定性。结果　固定化和可溶性胰蛋白酶的最适作用pH值分别为8 .0～9. 0和7. 0～9.0 ,最适作用温度分别为6 0℃和5 5℃,Km值分别为2 . 32 6、1 42. 9mg·ml-1 ;固定化胰蛋白酶在5 5℃条件下,保温5h ,仍有78 92 %的活性;在4℃条件下,8d后,活性才略微下降,两周活性保留达90 %以上;在pH 9.0的活性未下降,在pH 7.0～1 0 .0范围内也比较稳定(相对活性>80 %)。结论　胰蛋白酶经固定化后,最适作用pH值范围变窄,最适作用温度和Km值升高;热稳定性和酸碱稳定性均有所增强     

固定化超氧化物歧化酶的制备

目的 研究固定化超氧化物歧化酶(SOD)的制备方法。方法 分别以不同方法对铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)进行固定并比较其活力,对固定化方法进行相应的考察和优化。结果 以壳聚糖为载体,戊二醛交联法制备固定化SOD酶,酶活力和酶活回收率均较理想,固定化过程中的pH在6.0-8.2范围内,对固定化效果无明显影响;优化条件下制备的固定化铜锌超氧化物歧化酶,所得壳聚糖酶粉活力可达141 U·g-1,酶活回收率大于60％。结论 壳聚糖-戊二醛交联法可用于固定化超氧化物歧化酶粉的制备。     

单宁酶的固定化及性质研究

比较几种固定化载体，确定以壳聚糖为载体，用戊二醛作交联剂制得固定化单宁酶。壳聚糖用量0．1g，用3％戊二醛5ml交联4h，然后加入酶58．4u，于4℃反应4h，固定化酶活回收率可达73％。单宁酶经固定化后，热稳定性、pH稳定性及最适温度均有所提高，最适pH降低。     

超声波对胰蛋白酶活力影响的机理研究

目的探索超声波对胰蛋白酶催化的影响效果和作用方式。方法研究胰蛋白酶经不同频率、不同功率、不同时间的超声波处理后酶活力的变化;用动力学参数变化和光谱学探索其影响催化的机理。结果经超声波处理后酶活力普遍升高。用15 kHz5、0 W超声波处理胰蛋白酶3 min,酶活力可提高45.4%。将粗酶用SephadexG75凝胶色谱,分部液在聚丙烯酰胺凝胶电泳检验显示出一条带,说明酶被纯化到电泳纯程度。对纯酶进行动力学分析,结果表明经超声波处理后Km值变小,Vmax值也降低,说明超声波处理使酶对底物的亲和力增大。超声波处理不会改变胰蛋白酶分子的构型,但会改变酶分子的构象。结论超声波对胰蛋白酶催化活性的提高可能是由于改变酶分子的构象、增强酶分子对底物的亲和力的结果。     

化学改性与修饰壳聚糖固定化酶制备高比活抑肽酶新工艺

研究一步层析制备高比活抑肽酶新工艺。方法：将化学改性与修饰壳聚糖体,共价偶联配基牛胰蛋白酶,制成固定化酶为抑肽酶亲和吸附剂,直接对黄牛肺提取液一步层析纯化,再超滤脱盐、浓缩、去热原,冻干即抑肽酶。结果：抑肽酶比活５７００ｋｉｕ／ｍｇ,收率２２×１０~4ｋｉｕ／ｋｇ（牛肺）;固定化酶单位活力２５９５０ｋｉｕ／ｇ（干）,酶活性回收率５５％,非特异性吸附较小,机械强度高,可反复使用。结论：工艺过程简便,样品比活较高,质量稳定,成本低,适合工业化大生产。     

凝血酶的固定化及其稳定性研究

目的研制稳定性较高的固定化凝血酶。方法以壳聚糖 (0 .6g)为载体 ,0 .1%戊二醛 0 .3ml为交联剂 ,考察 0 .15g(10 0 0u)凝血酶的固定化条件及固定化凝血酶的稳定性。结果所制固定化凝血酶回收率达 87%以上 ,稳定性明显提高 ,制备工艺可行。结论固定化条件正确合理 ,固定化凝血酶在光照、高温、低温和室温留样观察条件下显示较好的稳定性。     

星点设计-效应面法优化壳聚糖微球对凝血酶的固定化作用研究

目的 考察壳聚糖微球对凝血酶的固定化作用。方法 本研究以壳聚糖微球为载体,以戊二醛为交联剂将凝血酶固定于空白微球上,以固定化凝血酶的活性回收率为指标,采用星点设计-效应面法优化固定凝血酶的条件。结果 试验结果表明,壳聚糖微球固定凝血酶的最优条件是：凝血酶浓度69.32 U·mL^-1、戊二醛浓度0.18%、固定化时间1.88 h、固定化pH 7.08,凝血酶的活性回收率为81.55 %。结论 壳聚糖微球对凝血酶的固定化效果良好。     

壳聚糖微球固定化重组TEM-116型ESBL的研究

目的 利用固定化酶技术,使重组TEM-116型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)在清除环境中残留抗生素的应用中可重复使用,并改善其稳定性.方法 以戊二醛为交联剂将重组TEM-116型ESBL固定于壳聚糖微球载体,并采用单因素轮换法和响应曲面法对固定化条件进行优化.结果 4℃条件下,当戊二醛浓度0.54%、交联pH5.4、给酶量0.58IU/g壳聚糖微球、固定化pH6.2时,同定化酶的酶活和回收率分别可达到0.49IU/g和84%(0.49IU/0.58IU).与游离酶相比,固定化酶的酸碱稳定性和可重复利用性得到显著提高,在pH5.8～7.4范围内酶活性保持在73%～100%的水平,经7次重复性使用,每次1h,酶活力保留高达80%.结论 通过固定化酶技术,以重组TEM-116型ESBL为代表的耐药酶能够开发为具有广泛应用前景的环保制剂,以消除外环境中残留的抗生素.     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离和纯化

目的研究1种高效分离纯化绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的方法。方法采用硫酸抽提,硫酸铵分级沉淀,缓冲液溶解沉淀,用相对分子质量(Mr)为30 000的超滤膜去除大分子蛋白质,Mr为5 000的超滤膜除盐及小分子蛋白质,亲和色谱纯化,得MBTI,高效液相色谱法(HPLC)和SDS-PAGE电泳法分别测定其纯度和Mr,以酪蛋白为底物测其活性。结果纯化的MBTI经HPLC和SDS-PAGE鉴定为2条蛋白质带,其Mr分别为12 000和8 000,其活性约为大豆蛋白酶抑制剂的3倍。结论超滤法与亲和色谱结合能快速高效地分离纯化MBTI。     

Interaction of gallic acid with trypsin analyzed by spectroscopy

The interactions between trypsin and gallic acid (GA) were investigated by means of fluorescence spectroscopy, UV-vis absorption spectroscopy, resonance light scattering (RLS) spectroscopy, synchronous fluorescence spectroscopy, and enzymatic inhibition assay. It was found that GA can cause the fluorescence quenching of trypsin during the process of formation of GA-trypsin complex, resulting in inhibition of trypsin activity (IC₅₀ = 3.9 × 10⁻⁶ mol/L). The fluorescence spectroscopic data showed that the quenching efficiency can reach about 80%. The binding constants were 1.9371 × 10⁴ L/mol, 1.8192 × 10⁴ L/mol, and 1.7465 × 10⁴ L/mol at three temperatures, respectively. The thermodynamic parameters revealed that hydrogen bonds, van der Waals, hydrophobic, and electrostatic interactions were involved in the binding process of GA to trypsin. Molecular modeling studies illustrated a specific display of binding information and explained most of the experiment phenomena. The microenvironments of tryptophan and tyrosine residue in trypsin were changed by the GA. Results indicated that GA was a strong quencher and inhibitor of trypsin.     

Photoreactive derivative of Kunitz's soybean trypsin inhibitor.

The photoreactive arylsulfenyl chloride 2-nitro-4-azidophenylsulfenyl chloride (2,4-NAPS-Cl) has been used for the selective modification of tryptophan in Kunitz's soybean trypsin inhibitor (SBTI). The ultraviolet absorption spectrum and amino acid analysis of 2,4-NAPS-SBTI indicated that only one of the two tryptophans (93 or 117) present in SBTI was modified. CNBr cleavage of 2,4-NAPS-SBTI resulted in two fragments 1–114 and 115–181.Amino acid analysis of the two separated fragments showed that only tryptophan 93 underwent modification. 2,4-NAPS-SBTI fully retained its inhibitory activity against trypsin. The photoaffinity labeling of trypsin with 2,4-NAPS-Cl was performed on tritiated trypsin prepared by reacting bovine trypsin with [³H]-succinimidyl propionate. The covalent attachment of 2,4-NAPS-SBTI to the tritiated trypsin after photolysis was demonstrated by exclusion chromatography on Sephadex G-50 in the presence of guanidine hydrochloride.     

Synthesis of somatostatin analogs resistant to the action of trypsin

The synthesis of a series of octapeptides based on the somatostatin analog cyclo(-Asn-Phe-Phe-d -Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba-) containing the substitutions [Aap⁹], [d -Lys⁹], [l -Trp⁸, d -Lys⁹], [l -Orn⁹] and [d -aThr¹⁰] is reported. The analogs were designed and have been shown to inhibit proteolysis at the proposed (1) primary cleavage site between Lys⁹-Thr¹⁰ and thereby increase their stability to enzymic attack.