重组RA538、反义c-myc腺病毒对不同细胞系转染效率与作用及其机制的研究

腺病毒载体研究的发展使基因治疗付诸于临床应用成为可能,它以遗传毒性低、致病性小、宿主范围广、滴度高、装载容量大等优势已广泛用于基因治疗。腺病毒载体能感染增生分裂细胞及非增生分裂细胞,相同的腺病毒载体对不同的靶细胞可能会产生不同的作用,阐明腺病毒载体转染效率及疗效之间存在的关系及其机制具有重要意义。我们的研究发现腺病毒（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ,Ａｄ）介导的ＲＡ５３８、反义（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ,ＡＳ）ｃ－ｍｙｃ具有抑制人胃癌细胞生长、诱导其凋亡及下调节ｃ－ｍｙｃ、ｂｃｌ－２基因表达的作用（另文发表）。…     

重组RA538、反义c-myc腺病毒对不同细胞系转染效率与作用及其机制的研究 *

目的：研究放射免疫治疗（ＲＴＴ）对肿瘤转移的预防和治疗作用,寻找一种抑制肿瘤转移的方法。方法：采用＾１３１Ｉ－Ｃ５０治疗ＬＡ７９５肺腺癌小鼠模型。观察治疗前后小鼠的体重减轻量、瘤重、生存期、肺转移数。比较一、小鼠接种后不同时期给药分次小剂量ＲＴＴ与化疗、手术及对照组之间疗效差别。三、接种后不同时间截肢后综合治疗对荷瘤小鼠作用。结果：一、种后后第７人药,各治疗组与对照组比较,体重减轻少、瘤重轻、肺转     

重组RA538,反义c—myc腺病毒对bcl—2高表达细胞系的作用及分子 …

目的 研究重组ＲＡ５３８（Ａｄ－ＲＡ５３８）、反义ｃ－ｍｙｃ腺病毒（Ａｄ－ＡＳｃ－ｍｙｃ）在ｂｃｌ－２高表达细胞系中的作用及其分析机制。方法 采用细胞形态学观察、ＭＴＴ、ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等方法,研究ＲＡ５３８,反义ｃ０ｍｙｃ重组腺病毒在ｂｃｌ－２高表达的人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ－ｂｃｌ２和ＳｉＨａ－ｂｃｌ２以及在其亲本细胞中的生物学作用及其分子机制。结果 以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ     

重组腺病毒介导反义c-myc基因对人肝癌细胞系的治疗作用

目的：探讨重组腺病毒介导反义ｃ－ｍｙｃ基因（Ａｄ－ＡＳｍｙｃ）治疗人肝癌细胞的作用。方法：观察Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系的转导效率,通过细胞生长曲线、克隆形成实验、ＤＮＡ片段化分析、ＲＴ－ＰＣＲ、裸鼠皮下移植瘤治疗实验,分析Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系Ｂｅｌ－７４０２、ＱＳＧ－７７０１、ＳＭＭＣ－７７２１和ＨＣＣ－９２０４细胞生长和ｃ－ｍｙｃ基因表达及裸鼠肿瘤生长的抑制作用。结果：Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可高效转导人肝癌细胞系,抑制细胞生长;转染细胞克隆形成能力降低,克隆成活率为对照组的５３．９％～６９．１％,ｃ－ｍｙｃ基因表达下降;Ａｄ－ＡＳｍｙｃ处理肝癌细胞,ＤＮＡ凝胶电泳出现明显的梯形条带,瘤内注射Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。结论：重组腺病毒介导的反义ｃ－ｍｙｃ基因转移,有可能成为肝癌基因治疗     

携带反义c-myc的重组腺病毒安全性研究

目的　研究携带反义c myc的重组腺病毒 (Ad ASmyc)潜在的副作用 ,评价其安全性 ,为其进一步进入临床试验提供依据。方法　用Ad ASmyc感染HeLa细胞 ,制备细胞提取液后反复两次感染HeLa细胞 ,观察Ad ASmyc的繁殖、扩增 ,以及对HeLa细胞的作用 ,RT PCR检测其DNA的转录 ;确定Ad ASmyc对作为正常细胞的人胚肺二倍体细胞 2BS的感染能力 ,绘制细胞生长曲线 ,观察Ad ASmyc对正常细胞的毒性 ;给Balb/c小鼠腹腔注射重组腺病毒后 ,每日观察一般状况 ,化验肝、肾功能 ,PCR检测Ad ASmyc在重要脏器中的分布 ,显微镜观察重要脏器的病理学变化。结果　Ad ASmyc是一复制缺陷型腺病毒 ,它能高效感染 2BS细胞 ,但并不影响其生长 ,小鼠体内应用后 ,无急性毒性症状发生 ,在肝、肾、胃、脾内可检测到腺病毒的分布。但在注射 10 9pfu第 6天、第 12天的小鼠肝组织内可观察到轻微炎症。结论　Ad ASmyc应用是安全的 ,可以进入临床试验。     

重组反义c-myc腺病毒抑制K562细胞生长、诱导凋亡的作用

目的：研究重组反义cmyc腺病毒（Ad—AS-c-myc）对人慢性粒细胞K562细胞系抑制生长，诱导凋亡作用及分子机制，探讨Ad-As-c—myc用于慢性粒细胞白血病基因治疗的可能性。方法：采用重组腺病毒Lac—Z（Ad—LacZ）及Ad—AS-c—myc联合多聚季胺转染K562细胞，Xgal染色判断转染效率。采用形态学、MTT试验、RT—PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法进行研究。结果：多聚阳离子可提高腺病毒载体对K562细胞的转染，Ad—LacZ＋多聚季胺转染率达86％。AdAS—c—myc能抑制K562细胞c—myc基因在转录水平的表达，K562细胞生长受抑（抑制率38％）；Ad—AS-c—myc可使K562细胞G2、G2期阻滞，增殖相关基因PCNA表达降低，Apo2．7蛋白阳性细胞率增高，DNA电泳出现DNA梯形条带。结论：Ad—AS-c-myc对K562细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用，其生物学作用与K562细胞c-myc及PCNA的表达降低有关。Ad-AS-c-myc在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的临床价值。     

反义c-myc重组腺病毒的构建及其抗骨肉瘤细胞的作用

背景与目的:c-myc原癌基因在细胞的增殖调节中发挥重要作用,研究表明c-myc在骨肉瘤中常常扩增和过表达,而且具有促进细胞转化和诱导转移的特性。本文构建表达反义c-myc的重组腺病毒,并探讨其对不同p53基因型的骨肉瘤细胞系MG-63(P53缺失型)、U2OS(p53野生型)的影响。方法:应用基因重组技术构建表达反义c-myc的重组腺病毒(Ad-As-c-myc),并在体外转染MG-63、U2OS细胞,采用蛋白免疫印迹(Westernblot)、吖啶橙染色、RT-PCR、流式细胞仪(FCM)等方法检测或观察其对细胞c-mycmRNA表达、瘤细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果:成功构建Ad-As-c-myc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG-63、U2OS细胞后可明显抑制细胞的体外增殖,而且对携带野生型p53的U2OS更敏感。Ad-As-c-myc转染48h后可降低c-mycmRNA表达。吖啶橙染色及FCM检测证实,转染Ad-As-c-myc可诱导骨肉瘤细胞凋亡,细胞周期分析显示转染Ad-As-c-myc的MG-63细胞出现G2/M期阻滞,而U2OS细胞出现G1期阻滞。结论:腺病毒介导反义的c-myc能以p53依赖或非依赖性途径诱导骨肉瘤细胞凋亡,并抑制骨肉瘤细胞的增殖。     

重组反义c-myc腺病毒对HL-60细胞PCNA表达及其生长影响的研究

目的:研究重组反义c-myc腺病毒(Ad-AS-c-myc)对人急性早幼粒HL-60细胞系的c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及细胞生长抑制。方法:采用重组腺病毒Lac-Z(Ad-LacZ)及Ad-AS-c-myc联合多聚阳离子转染HL-60细胞,X-gal染色判断转染效率。采用MTT、RT-PCR及免疫细胞化学等方法进行研究。结果:多聚阳离子可提高腺病毒对HL-60细胞的转染,Ad-LacZ加入鱼精蛋白硫酸盐转染率达79.8%。Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞c-myc基因在转录及蛋白水平的表达。Ad-AS-c-myc抑制HL-60细胞生长及活力(抑制率51%),细胞生长停滞后PCNA蛋白表达降低。结论:Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有使生长减缓、增殖能力降低作用,其生物学作用与HL-60细胞c-myc和PCNA的表达受抑有关。Ad-AS-c-myc在急性早幼粒白血病基因治疗中具有潜在的临床价值,其生物学活性与HL-60细胞c-myc和PCNA表达受抑有关。     

腺病毒介导RA538基因转移及其对肿瘤的抑制作用

目的:RA538是从维甲酸诱导终末分化的人食管癌细胞系中分离出的一个与分化相关的基因,本研究探讨了其抗癌作用.方法:利用腺病毒介导基因转移观察对肿瘤细胞的抑制效应.结果:通过重组体腺病毒将RA538基因转导到人肺腺癌细胞系(GLC-82)和人结肠癌细胞系(HCY)中,获得较高的转导效率,显示出较明显的抑制肿瘤生长作用,抑制率分别为77.2%和77.9%,并能降低两细胞系体内肿瘤形成能力.流式细胞计数、DNA片段化分析及TUNEL检测证实RA538可诱导肿瘤细胞发生凋亡.Westem blot分析表明,RA538具有明显下调c-myc基因表达的作用,结论:研究结果提示,RA538是一个较广谱的抑癌基因,可以作为肿瘤基因治疗的一个新目的基因,具有良好的应用前景.     

bcl-2反义寡核苷酸对肾癌细胞Bcl-2蛋白表达抑制及诱导凋亡作用

目的:经Beagle犬肝脏血管注射重组腺病毒介导反义c-myc基因(Ad-ASmyc)载体,观测其体内分布及毒副作用,以评价Ad-ASmyc治疗肝癌的临床前期安全性.方法:选择4只体重8～10kg健康Beagle犬,全麻后开腹,经肝动脉或门静脉注射Ad-ASmyc,注射Ad-ASmyc前及注射后第3,7,14,21天取肝组织及抽取静脉血化验,PCR检测Ad-ASmyc在各器官组织中的分布,常规切片观察各器官病理变化,ELISA方法检测血中抗腺病毒抗体的产生.结果:经Beagle犬肝脏血管注射后,Ad-ASmyc可持续转导正常肝细胞达3周,实验犬一般情况好,血、肝、肾功能无明显异常,在肝脏、脾脏、肾脏、胃、心脏、皮肤中可检测到重组腺病毒的分布,镜下可见Ad-ASmyc剂量依赖性的肝组织轻微的炎症反应,注射后7d血中有抗腺病毒载体的抗体产生,14d达高峰,21d开始下降.结论:经Beagle犬肝动脉或门静脉途径注射Ad-ASmyc均可转导至肝细胞,Ad-ASmyc对实验犬的毒副作用较轻.     

经犬肝动/静脉输入反义c-myc重组腺病毒的安全性研究

NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞,具有广泛的生物学功能,位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线;不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞,同时又能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫应答,因此,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[1-2].CTL的识别与杀伤功能具有高度的特异性,即只杀伤表面带有特异性抗原和相应组织相容性复合体的靶细胞,而NK细胞的杀伤不受MHC的限制,在T细胞免疫启动之前,就与Mφ一起构成了细胞免疫系统的第一道防线.     

腺病毒介导的RA538基因转移及其对人结肠癌细胞

目的 进上步研究ＲＡ５３８对人结肠癌细胞生物学效应，选用介导ＲＡ５３８重组体腺病毒，观察其对人结肠癌细胞系ＨＣＴ的作用。方法 通过重组体腺病毒将ＰＡ５３８基因转导到人结肠癌细胞系ＨＣＴ中，观察转染ＲＡ５３８基因后的肿瘤细胞生长情况。经流式细胞仪、ＤＮＡ片段化分析及ＴＵＮＥＬ检测分析抑瘤机制。结果 由重组体腺病毒Ａｄ－ＲＡ５３８介导基因ＲＡ５３８转导在ＨＣＴ获得较主的转导效率，ＭＯＩ为１００时使８０     

去甲斑蝥素对人乳腺癌细胞系的凋亡诱导作用及bcl-2基因的表达

目的：探讨去甲斑蝥素抗肿瘤作用的分子机制。方法：用１０μｇ／ｍｌ去甲斑蝥素处理体外培养的人乳腺癌细胞素ＭＣＦ－７。处理后,在不同时间点,采用普通光镜、电子显微观察去甲斑蝥素对乳腺癌细胞的诱导凋亡现象。利用流式细胞仪分析凋亡细胞百分比,用蛋白印迹杂交方法对凋亡抑制基因ｂｃｌ－２的表达情况进行检测。结果：经１０μｇ／ｍｌ去甲斑蝥素处理１２ｈ后,可观察到ＭＣＦ－７细胞变形、出泡,从培养瓶底脱离。细胞染色和电子显微镜可观察到染色质浓聚、边集,且随着药物作用时间的延长,凋亡细胞百分比逐渐增加。与对照组相比,凋亡抑制基因ｂｃｌ－２的表达降低。结论：诱导肿瘤细胞凋亡可能是去甲斑蝥素抗肿瘤作用的分子机制之一。     

高表达bcl-2卵巢癌细胞系参与药物抵抗和细胞凋亡作用的研究 *

目的：探讨化疗的敏感性与细胞凋亡的关系,观察细胞凋亡抑制分子ｂｃｌ－２在卵巢癌化疗抵抗中的作用。方法：构建了逆转录病毒ｂｃｌ－２表达载体ｐＬＸＳＮ／ｂｃｌ－２,应用ｌｉｐｏｆａｃｔｉｎ法建立转染ｂｃｌ－２基因和转染空载体ｐＬＸＳＮ的卵巢癌细胞系。ＭＴＴ法观察细胞系抵抗药物的细胞毒作用。ＦＡＣＳ和ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳观察ｂｃｌ－２高表达细胞系在阿霉素诱导细胞凋亡中的变化。结果：转染 ｂｃｌ－２的卵巢癌细胞系ＯＣ３／ｂｃｌ－２稳定表达ｂｃｌ－２分子并抵抗药物介导的细胞毒作用,明显提高细胞的存活率,与此同时也抑制细胞凋亡的发生。结论：化疗的敏感性与细胞凋亡的调节密切相关,凋亡抑制基因ｂｃｌ－２在肿瘤耐药中起重要作用。     

bcl-2、p53、c-myc 蛋白在胃癌中表达的研究

 目的　研究胃癌组织中 bcl- 2、p5 3、c- myc表达与其临床病理的相关性。方法　对有随访的不同分化的胃癌 5 0例、癌旁不典型增生粘膜病变 47例 ,及 2 0例正常胃粘膜进行免疫组化ABC法标记。结果　 bcl- 2蛋白在癌旁轻、中、重度不典型增生的阳性率分别为 5 %、1 7.6 %、2 0 .0 % ,它们间无显著差异 P>0 .0 5 % ) ,在高分化胃癌中阳性率为 80 .0 %。与低分化的 5 0 .0 %相比 ,有显著差异 (P<0 .0 5 )。p5 3在高分化胃癌中阳性率为 5 0 .0 %。明显低于低分化的 84.6 % (P<0 .0 5 )。结论　bcl- 2和 p5 3可作为肿瘤分化和估计预后的主要参考指标之一。     

腺病毒介导的RA538基因转移及其对人结肠癌细胞HCT的抑瘤作用

目的　进一步研究ＲＡ５３８ 对人结肠癌细胞系的生物学效应,选用介导ＲＡ５３８ 重组体腺病毒,观察其对人结肠癌细胞系ＨＣＴ 的作用。方法　通过重组体腺病毒将ＲＡ５３８ 基因转导到人结肠癌细胞系ＨＣＴ 中,观察转染ＲＡ５３８ 基因后的肿瘤细胞生长情况。经流式细胞仪、ＤＮＡ 片段化分析及ＴＵＮＥＬ 检测分析抑瘤机制。结果　由重组体腺病毒ＡｄＲＡ５３８ 介导基因ＲＡ５３８ 转导在ＨＣＴ 获得较高的转导效率, ＭＯＩ 为１００ 时可使８０ ％ 细胞转染,并显示对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用,抑制率为７４ ％ 。裸鼠皮下注射ＲＡ５３８ 处理的ＨＣＴ 细胞肿瘤形成能力为２０ ％ 。ＤＮＡ 片段化分析、ＴＵＮＥＬ 和流式细胞仪检测,结果证明ＲＡ５３８诱导肿瘤细胞发生凋亡。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明,ＲＡ５３８ 具有明显下调ｃｍ ｙｃ 基因表达的作用。结论　ＲＡ５３８ 对人结肠肿瘤细胞有抑制生长和诱导凋亡的作用,可以作为结肠肿瘤基因治疗的１ 种新的治疗基因。     

c-myc反义寡核苷酸对表达FHIT基因的结肠癌细胞增殖及凋亡作用的影响

目的：观察脂质体介导的c—myc反义寡核苷酸对表达FHIT基因的结肠癌细胞增殖及凋亡作用的影响。方法：用脂质体法将重组FHIT基因的PRC／CMV质粒和空载体质转染到人结肠细胞株SW480，随后分别转染c—myc反义寡核苷酸。Western blot法检测细胞FHIT和c—myc的表达；MTF法检测细胞的增殖；AO／EB染色法和流式细胞分析技术检测细胞的凋亡。结果：转染FHIT基因后，SW480细胞有明显的FHIT蛋白表达而转染空载体的细胞未检测到FHIT蛋白表达。C—myc反义寡核苷酸转染后，对SW480细胞c—myc的表达有明显的抑制作用（P〈0．01）；对FHIT＋／-SW480细胞的增殖均有明显的抑制作用（P〈0．01），且对FHIT＋SW480细胞的抑制作用明显强于FHIT—SW480细胞（P〈0．05）。同时，c-myc反义寡核苷酸对FHIT＋／-SW480细胞的凋亡均有明显的促进作用，对FHIT＋SW480细胞凋亡的促进作用明显强于FHIT—SW480细胞（P〈0．05）。结论：FHIT基因的表达和癌基因c—myc的表达抑制共同作用可以发挥较强的抗肿瘤细胞的效果，为多基因联合干预治疗肿瘤奠定了理论基础。     

介导RA538、p53和p16基因转移的重组体腺病毒的构建及抑制肿瘤活性的研究

我们构建了分化相关基因RA538和抑癌基因p53、p16的重组体腺病毒,并转导了卵巢癌细胞系SK-OV-3和黑色素瘤细胞系WM-983A细胞,对它们体外和体内抗瘤效应及机制进行了检测与分析,结果如下:     

EG-1、Her-2、p53、c-myc、bcl-2在乳腺癌中表达的研究进展

新近发现的基因EG-1在乳腺癌中有高表达,其与内皮细胞及上皮细胞的增生激活状态相关.Her-2、p53、c-myc、bcl-2在乳腺癌中的研究较多,其在细胞信号转导通路中的作用已有一定认识.全文就5个基因的研究概况作一综述.