大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA、ED融合蛋白的表达

大肠杆菌β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)是由四个相同亚基组成的四聚体,相对分子质量(Mr)为540000,通过溴化氰裂解或基因重组技术可得到一系列无酶活性的突变肽段,其中有些突变体在体外能重新聚合成全酶活性的四聚体,这一现象被称为α-互补[1].β-半乳糖苷酶的这种α-互补性已被用于分子生物学、蛋白质与蛋白质相互作用的监控、克隆酶供体免疫分析技术(CEDIA)、表达免疫分析等[2,3].通常具有α-互补活性缺失大部分C端氨基酸的小片段突变体如CNBr2被称为α-供体或酶供体(ED);而缺失N端约40个氨基酸的大片段突变体如M15蛋白被称为α-受体或酶受体(EA).为了进一步研究β-半乳糖苷酶的α-互补特性并促进其应用,我们通过DNA重组技术构建了一对编码β-半乳糖苷酶突变体EA、ED的质粒,并以融合蛋白的方式进行表达制备.     

β-D-半乳糖苷酶的研制

<正> 半乳糖苷酶用于酶免疫测定具有无内源性干扰、底物稳定且无致癌性、与荧光底物结合可作超微量荧光酶联分析等特点。本研究目的是从大肠杆菌菌体中抽提纯化β-D-半乳糖苷酶及建立其均相与非均相酶免疫测定方法。     

TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究

为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法，本研究构建了pET28a-TAT-LacZ重组表达子，纯化得到TAT－β－Gal融合蛋白，通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT－β－Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT－β－Gal在短时间内可到达各组织。该研究证明在生物大分子的N－末端加上TAT具有穿透力的蛋白转导区肽段形成的融合蛋白可穿过生物膜到达各组织，这一发现为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

肾上腺-脑白质营养不良与β-半乳糖苷酶缺陷:患者与携带者

肾上腺-脑白质营养不良(ALD)为X连锁隐性遗传性疾病,常累及神经系统白质及肾上腺。本文目的是对ALD患儿及其双亲和其它ALD变型患者的溶酶体酶活性进行研究。     

正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化

目的　研究正常人成纤维细胞老化过程中 β 半乳糖苷酶的变化规律。 方法　取正常人二倍体成纤维细胞进行传代培养 ,以不同代龄的细胞为实验对象 ,通过细胞生长曲线、群体倍增时间和β 半乳糖苷酶染色等一系列检测方法 ,对成纤维细胞老化过程进行了观察。结果　随着成纤维细胞的连续传代培养 ,SA Gal表达呈现从弱 (在年轻细胞中占 4 % )到强 (在老化细胞中占 6 0 % )的趋势。结论　本实验结果为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据     

4型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建缺失Ｅ３区７８．９－８６ｍｕ的４型腺病毒疫苗株载体。方法从４型腺病毒疫苗株（Ａｄ４）感染的人胚肺二倍体细胞２ＢＳ中提取病毒ＤＮＡ,经过多步亚克隆构建成功缺失７８．９－８６ｍｕ的载体。将含有ＣＭＶ早期启动子的β－半乳糖苷酶基因插入缺失部位,将这一重组质粒与Ａｄ４ＢｃｌⅠ大片段共转染２９３细胞,铺含有Ｘ－Ｇａｌ的营养琼脂,经蓝色蚀斑纯化三代,ＯＮＰＧ法测定β－半乳糖苷酶基因的表达量。结果所构建的载体能稳定地表达β－半乳糖苷酶基因。结论４型腺病毒疫苗株载体的构建为利用该病毒做为基因工程疫苗载体打下了基础。     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β半乳糖苷酶基因。方法从人二倍体细胞Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８８８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲⅠ酶切Ａｄ７ｖＤＮＡ共转染２９３细胞，获得表达β半乳糖苷酶重组病毒。结果构建了缺失部分Ｅ３区Ａｄ７ｖ载体，在ＣＭＶ启动子的作用下该载体能有效地表达外源基因。结论Ａｄ７ｖ载体的构建并成功表达外源基因为开发和应用这一载体打下了重要的基础     

β-半乳糖苷酶/抗β半乳糖苷酶单抗复合体(GAG)制备及其在CELISA和免疫组化中应用

本工作继PAP和APAAP之后国内首次制备了GAG(β-Galactosidase/anti-β-Galac-tosidas。Complex),并将GAG应用于CELISA (Celluler Enzyme-Linked Immunosor-bent Assay)和免疫组化之中。通过用国产从E.coli来源的β-半乳糖苷酶免疫BALB/c小     

β-半乳糖苷酶在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞中的表达变化

目的观察β-半乳糖苷酶(β-gal)在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞(NSCs)中的表达变化。方法体外培养NSCs,并应用X-Gal组织化学和免疫细胞化学染色技术研究NSCs中β-gal的表达变化。结果原代克隆球和亚克隆球的NSCs均稳定表达β-gal;在NSCs分化过程中,NeuN阳性的神经元、GalC阳性的少突胶质细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞均表达β-gal,但表达水平有所下降。结论ROSAβgeo26小鼠衍生的NSCs能稳定的表达β-gal,可用作NSCs研究的细胞来源。但在干细胞分化的相关研究中,值得注意存在β-gal不同程度的表达下调现象,并应进一步关注出现该现象的潜在机制。     

合成β-半乳糖苷酶所需的一种蛋白质——L因子的进一步鉴定

多年来作者的实验室在体外系统中对DNA指导的β-半乳糖苷酸的合成进行了研究。其最终目的是在完全确定的系统中,获致细菌基因表达所需的各种因子。当对大肠杆菌可溶性提取物进行初步分级分离时,从DEAE柱的1.0M盐洗脱液中纯化出β-半乳糖苷酶合成所需的一个因子,被命名为     

pWX146-β-半乳糖苷酶融合蛋白表达载体的构建及对疟原虫基因的表达

本文根据抗原分子特性，用限制性内切酶ＨｐａⅠ和ＥｃｏＲⅠ及三对ＸｈｏⅠ－ＥｃｏＲⅠ接头，对β－半乳糖苷酶融合蛋白表达载体ｐＷＲ４５０进行了改建，截去其β－半乳糖苷酶Ｃ端约３００个氨基酸的编码序列，构建了一组含β－半乳糖苷酶Ｎ端１４６个氨基酸编码序列的ｐＷＸ１４６融合蛋白表达载体，以ｐＷＸ１４６－Ⅰ作为载体，３０６ｂｐｐｆＨＲＰⅡ基因片段在大肠杆菌中得到了高效表达     

衰老相关-β-半乳糖苷酶和P16在老年大鼠脾内的表达及意义

目的:研究衰老相关-β-半乳糖苷酶和P16在老年大鼠脾内的表达及意义.方法:采用组织化学及SABC免疫组织化学检测成年及老年Wistar大鼠脾组织内衰老相关-β-半乳糖甘酶及P16蛋白的表达.结果:衰老相关-β-半乳糖苷酶阳性细胞主要分布于脾内的边缘区及脾索,老年大鼠较成年大鼠阳性细胞数量显著增多.P16阳性细胞也主要分布于脾内的边缘区及脾索;与成年鼠相比,老年大鼠P16阳性细胞显著增多.结论:P16和衰老相关-β-半乳糖苷酶在大鼠脾内高表达,可能与脾的衰老相关.     

大肠杆菌β—半乳糖苷糖EA、ED融合蛋白的表达

大肠杆菌β 半乳糖苷酶 (Ｅ .Ｃ .3.2 .1.2 3)是由四个相同亚基组成的四聚体 ,相对分子质量 (Ｍｒ)为5 4 0 0 0 0 ,通过溴化氰裂解或基因重组技术可得到一系列无酶活性的突变肽段 ,其中有些突变体在体外能重新聚合成全酶活性的四聚体 ,这一现象被称为α 互补〔1〕。β 半乳糖苷酶的这种α 互补性已被用于分子生物学、蛋白质与蛋白质相互作用的监控、克隆酶供体免疫分析技术 (ＣＥＤＩＡ )、表达免疫分析等〔2 ,3〕。通常具有α 互补活性缺失大部分Ｃ端氨基酸的小片段突变体如ＣＮＢｒ2 被称为α 供体或酶供体(ＥＤ) ;而缺失Ｎ端约 4 0个氨基…     

用全长营养不良蛋白和β-半乳糖苷酶基因取代所有病毒序列得到一个新的腺病毒载体

腺病毒用于人类基因治疗有许多优点,亦有很高的潜在应用价值。但目前所用腺病毒有3方面的缺点:①插入容量小,限8kb以下;②载体病毒蛋白的表达可能引起被感染组织的炎症反应;③被转基因的表达时间短。为此作者发展了一种新的移去所有的病毒编码序列腺病毒载体,外源插入容量增大,同时不再表达病毒蛋白,从而消除了病毒蛋白引起的炎症反应,据作者介绍转染后表达时间也增长。     

短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶的纯化及性质

`目的研究短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)α-D-半乳糖苷酶的纯化及性质。方法采用硫酸铵分级沉淀及柱层析法纯化酶蛋白,垂直板状SDS-PAGE和nativegradientPAGE检查蛋白纯度。结果nativegradientPAGE电泳后活性染色确定无细胞粗酶液中含有一种α-D-半乳糖苷酶,纯化后的酶蛋白是一个相对分子质量（M     

用全长营养不良蛋白和β-半乳糖苷酶基因取代所有病毒序列得到一种新的腺病毒载体

腺病毒用于人类基因治疗有许多优点,亦有很高的潜在应用价值。但目前所用腺病毒有三方面的缺点:①插入容量小,限8kb以下;②载体病毒蛋白的表达可能引起被感染组织的炎性反应;③被转基因的表达时间短。为此作者发展了一种新的移去所有的病毒编码序列腺病毒载体,外源插入容量增     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察

目的：建立高表达β-葡萄糖醛酸苷酶(以下简称βG)基因的肾癌细胞模型，并观察转染细胞的生物学特性。方法：构建真核表达载体pcDNA3．1—βG，并利用阳离子脂质体介导将其转人人肾癌细胞株GRC—1中。用mRNA打点杂交和Westemblot，鉴定其转录与表达水平，并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法，观察转染细胞的生物学特性。结果：在mRNA与蛋白水平证实，转染细胞内有βG基因的高表达。透射电镜观察，转染细胞中的溶酶体、内质网丰富，细胞微绒毛及突起增多，但转染前后肾癌细胞GRC—1的周期及生长情况无显著性差别。结论：应用脂质体介导法，将βG基因导人人肾癌GRC—1细胞后，获得生物学特性稳定βG基因高表达的肾癌细胞模型，为进一步研究奠定了基础。     

N末端B型钠尿肽原的检测与临床应用

脑钠尿肽广泛分布于脑、脊髓、心肺等组织,其中以心脏含量最高。血循环中的脑钠尿肽主要来自心脏分泌,心房和心室的压力主要由多种钠尿肽调节。     

工程化人源性抗-HBs Fab片段抗原结合位点的研究

取自己制备的纯化人源性抗 HBs Fab 片段。用表达的PreS, PreS1, PreS2 蛋白及合成的PreS1 (21 47aa)27 肽检测其抗原结合位点。结果显示该Fab 片段在非还原状态下分子量约为54kD, 在还原状态下分解为大小两个片段, 大片段为Fab的Fd 链, 分子量约为28kD; 小片段为Fab 的κ链, 分子量约为26kD。该Fab 片段与PreS及PreS1 蛋白呈现结合反应, 说明其抗原结合位点位于HBsAg 的PreS1 区