前列腺素E2对人肝细胞癌HepG2细胞E-cadherin表达的影响及其分子机制

目的:研究前列腺素E2(PGE2)对人肝细胞癌HepG2细胞E-cadherin表达的调节作用及其分子机制,探讨其与肝癌侵袭转移的关系,为肝癌的治疗提供新的研究思路.方法:COX-2瞬时转染人肝细胞癌HepG2细胞,Western blot实验检测其E-cadherin表达的变化;PGE2及PI-3K抑制剂LY294002处理人肝细胞癌HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR分别测定肝癌细胞内E-cadherin蛋白水平和mRNA水平的变化,并观察60 min内Akt磷酸化水平的变化.结果:COX-2过表达转染HepG2细胞后,E-cadherin的表达明显降低;5、10、20μmol/L PGE2处理HepG2细胞24 h后,E-cadherin表达水平与对照组比较分别下降了 22.31%、36.3%、47.83%(P<0.05);20 μmol/L PGE2处理HepG2细胞24、48、72 h,E-cadherin蛋白和mRNA的表达与对照组比均明显降低(P<0.01).PI-3K抑制剂LY294002能部分阻断PGE2对E-cadherin表达的调节作用;经PGE2处理的HepG2细胞Akt磷酸化水平显著升高,并且在15 min时达到最高.结论:PGE2可以抑制人肝细胞癌HepG2细胞中E-cadherin的表达,并很可能通过激活Akt信号转导通路而发挥作用.     

PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤中的调控作用及重组人红细胞生成素预保护效应

目的 探讨PI3K/Akt/GSK-3β通路对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺血再灌注损伤过程中细胞凋亡的调控及重组人红细胞生成素(rHuEPO)的预保护作用.方法 正常培养的HK-2细胞,分为7组,正常对照组、缺血再灌注(I/R)组、LY294002干预组(PI3K/Akt阻断剂 10 μmol/L)、LiCl干预组(GSK-3β阻断剂 20 μmol/L)、rHuEPO干预组(20 U/L)、rHuEPO+LY294002双干预组、rHuEPO +LiCl双干预组.Western blot法检测蛋白激酶B(Akt)、Akt Ser473、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、GSK-3β Ser9及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3活性;MTT法检测细胞活力;AnnexinⅤ/PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡. 结果缺血再灌注损伤诱导HK-2细胞凋亡率上调[(15.2±1.4)%]、Akt活性水平下降、GSK-3β及Caspase 3酶活性水平上调,与正常对照组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.05).与I/R组相比,LY294002干预使细胞凋亡率进一步上调[(18.2±2.1)%]、Akt活性水平下调、GSK-3β及Caspase 3酶活性上调;LiCl干预使细胞凋亡率下调[(12.3±0.8)%]、Akt活性水平上调、GSK-3β及Caspase 3酶活性下调,差异均有统计学意义(均P＜0.05).rHuEPO干预与I/R组相比,细胞凋亡率下降[(11.1±1.6)%]、Akt活性水平升高而GSK-3β及Caspase 3酶活性下调,差异均有统计学意义(均P＜0.05).与rHuEPO干预组比较,rHuEPO+LY294002双干预组细胞凋亡率升高[(13.4±1.9)%]、Akt活性水平下降而GSK-3β及Caspase 3酶活性上调;rHuEPO+LiCl双干预组细胞凋亡率下调[(7.5±1.3)%]、Akt活性水平上升而GSK-3β及Caspase 3酶活性下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 缺血再灌注损伤可引起肾小管上皮细胞凋亡,Akt活性降低及GSK-3β活性升高,影响Caspase 3依赖的外源性凋亡途径可能是其凋亡机制之一.rHuEPO可通过增强Akt活性,降低GSK-3β及Caspase 3酶活性,减少细胞凋亡,对HK-2缺血再灌注损伤有一定的保护作用.     

糖原合酶激酶3—β对胃癌细胞生长周期和转移的影响

目的:探讨GSK-3β功能改变对胃癌细胞生长周期和转移的影响.方法:LY294002单独或联合LiC1影响胃癌细胞株SCG-7901 GSK-3β活性,Western blotting检测总GSK-3β、p-GSK-3βser9表达,MTT和FCM检测细胞增殖及周期分布,细胞免疫化学检测E-cadhefin、β-eatenin表达,细胞粘附实验观察细胞与基质的粘附力.结果:LY294002干预细胞72 h后,总GSK-3β表达无改变,P-GSK-3βser9表达下降;增殖受抑制;细胞周期阻滞于G0/G1期;E-cadherin表达增高,β-catenin表达下降;细胞与基质粘附力降低.LiC1部分拈抗LY294002对细胞的生长抑制、周期阻滞及对E-cadherin、β-catenin表达的改变和细胞与基质粘附力的影响.结论:GSK-3β可促进胃癌细胞G1-S期周期阻滞、抑制细胞生长并可上调E-eadherin表达抑制细胞转移.     

重组人红细胞生成素对肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)通路对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺血再灌注(IR)损伤过程中细胞凋亡的调控以及重组人红细胞生成素(rHuEPO)对其保护作用.方法 正常培养的HK-2细胞,分为7组:正常对照组、IR组、LY294002干预组(P13K-Akt阻断剂,10 μmol/L)、LiCl干预组(GSK-3β阻断剂,20 μmol/L)、rHuEPO干预组(20 U/L)、rHuE-PO+LY294002干预组、rHuEPO+LiCl干预组.Western印迹法检测Akt(Ser473)、GSK-3β(Set9)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)活性;MTT法检测细胞活力;Annexin V和PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡.结果 IR损伤诱导HK-2细胞凋亡率上调(15.20%±1.43%)、Akt活性水平下降、GSK-3β及caspase-3酶活性水平上调,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);与IR组相比,LY294002干预使细胞凋亡率进一一步上调(18.20%±2.06%)、Akt活性水平下调、GSK-3β及caspase-3酶活性上调,LiCl干预使细胞凋亡率下调(12.30%±0.85%)、Akt活性水平上调、GSK-3β及caspase-3酶活性下调,差异均有统计学意义(P＜0.05).rHuEPO干预组与IR组相比,细胞凋亡率下降(11.10%±1.62%)、Akt活性水平升高,GSK-3β及caspase-3酶活性下调,差异有统计学意义(P＜0.05).与rHuEPO干预组相比,rHuEPO+LY294002干预组细胞凋亡率升高(13.40%±1.94%)、Akt活性水平下降,GSK-3β及caspase-3酶活性上调,rHuEPO+LiCl双干预细胞凋亡率下调(7.50%±1.31%)、Akt活性水平上升,GSK-3β及caspase-3酶活性下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 IR损伤可引起肾小管上皮细胞凋亡,Akt活性降低,GSK-3B活性升高影响caspase-3依赖的外源性凋亡途径可能是其凋亡机制之一.rHuEPO可通过增强Akt活性,降低GSK-3β及caspase-3酶活性,减轻细胞凋亡,对HK-2IR损伤有一定的保护作用.     

蛋白激酶B信号通路对新生大鼠缺氧缺血后轴突密度影响的实验研究

目的 探讨新生鼠在体内脑缺氧缺血(hypoxia-ischemia,HI)条件下,脑组织蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和下游糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)活性变化,及其与组织损伤和轴突密度的关系.方法 以10日龄新生SD大鼠为研究对象,行右侧颈总动脉结扎手术,8％氧氮混合气缺氧2.5h制作HI模型.Western blot法检测HI后大鼠脑皮层和海马区Akt、GSK-3β总蛋白和磷酸化蛋白表达变化;使用Akt抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)和LY294002后,Western blot法检测Akt、GSK-3β在HI后4h,24 h改变;HE染色检测渥曼青霉素对HI后脑组织损伤影响,银染法检测轴突密度改变.结果 HI后新生大鼠脑组织中Akt、GSK-3β总蛋白表达无明显变化;p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达在0.5h短暂下降,此后2h、4h内呈现逐步上升,8h时恢复到基线水平,24～48 h显著下降,72 h表达恢复基线水平.渥曼青霉素或LY294002干预未改变Akt、GSK-3β总蛋白表达量,但p-Akt和p-GSK-3β的表达量均降低.HI引起组织损伤和轴突密度降低,渥曼青霉素加重HI后组织损伤和轴突密度降低.结论 Akt信号通路参与调控新生大鼠HI后脑组织损伤和轴突密度.     

PI3K/Akt信号通路抑制剂对胃癌细胞SGC7901中Skp2和NAG-1表达的影响及其效应

目的 研究PI3K/Akt信号转导通路靶向抑制剂LY294002对胃癌细胞SGC7901中S期激酶相关蛋白2(Skp2)和非甾体抗炎药诱导基因-1(NAG-1)表达的影响.方法 将LY294002作用于胃癌细胞株SGC7901,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术AnnexinV2FITC/PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR检测NAG-1、Skp2 mRNA的表达情况,Western blot检测p-Akt(Ser473)和总Akt(t-Akt)的表达情况.结果 LY294002可明显抑制SGC7901的生长,呈时间-剂量依赖性,并出现典型的细胞形态学改变;10、30、50 μmol/L的LY294002作用12 h后细胞凋亡率分别为(12.7±0.42)%、(36.5±0.45)%和(64.1±0.79)%,显著高于空白对照组的(2.3±0.36)%,差异均有统计学意义(P<0.01);LY294002可下调p-Akt的蛋白表达,而t-Akt的表达未发生改变;LY294002可上调NAG-1 mRNA的表达,并下调Skp2 mRNA的表达.结论 阻断PI3K/Akt信号转导通路可改变胃癌细胞株SGC7901中Skp2和NAG-1的表达,并能明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与其抑制Akt磷酸化及调控NAG-1、Skp2 mRNA表达水平有关.     

LY294002增强5-氟尿嘧啶对大肠癌细胞侵袭和转移的抑制作用

目的:探讨PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002及5-氟尿嘧啶(5-Fu)对大肠癌细胞转移和侵袭的影响.方法:LY294002及5-Fu体外作用于大肠癌细胞株SW480,Western blot检测总Akt和Akt-ser473蛋白表达,细胞黏附实验观察细胞与基质的黏附力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell法观察细胞侵袭能力,免疫细胞化学法测定β-catenin及MMP-7蛋白表达.结果:经LY294002及5-Fu处理的SW480细胞总Akt表达无改变,Akt-ser473蛋白表达下降.LY294002及5-Fu分别、并协同使细胞与基质的黏附力、细胞迁移能力及侵袭能力减弱,β-catenin及MMP-7蛋白表达水平降低.结论:LY294002可增强5-Fu对大肠癌细胞侵袭和转移的抑制作用.     

P13K/Akt通路在药物放射增敏中作用的机制

目的 进一步探讨PI3K/Akt信号转导途径在药物放射增敏中作用的分子机制.方法 体外培养HeLa细胞,多西紫杉醇(docetaxel)和顺铂(cisplatin)单独及分别联合P13K抑制剂LY294002作用24 h,X线6 Gy剂量照射;Western blot检测Akt、磷酸化Akt(pAkt)、Bad、磷酸化Bad(pBad)蛋白的表达变化;RT-PCR检测Bad、Ku70、Ku80 mR-NA的表达变化;中性彗星电泳检测不同处理组细胞DNA的损伤.结果 ①docetaxel+LY294002联合照射组、cispla-tin+LY294002联合照射组Bad mRNA表达增高,Ku70 mRNA表达减低,Ku80 mRNA表达无明显变化;②docetaxel+LY294002联合照射组、cisplatin+LY294002联合照射组Bad蛋白表达增高,pAkt、pBad蛋白表达减低,Akt蛋白表达无明显变化;③docetaxel+LY294002联合照射组、cisplatin+LY294002联合照射组细胞彗星电泳尾距明显长于单纯药物增敏照射组.结论 ①docetaxel和cisplatin药物增敏照射能够明显活化PI3K/Akt信号转导途径;②抑制PI3K/Akt信号转导途径能够抑制Ku70表达,减少细胞DNA损伤后的再修复,提高促凋亡因子Bad的表达,促进细胞的凋亡.     

糖原合酶激酶-3β磷酸化抑制顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

目的 探讨增加糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的磷酸化状态对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用.方法 体外培养人卵巢癌细胞株OV2008细胞,运用GSK-3β特异性抑制剂LiCl增加磷酸化GSK-3β的表达,应用流式细胞仪检测不同浓度顺铂诱导的细胞凋亡,Western blot检测GSK-3β及磷酸化GSK-3β蛋白的表达.结果 流式细胞仪检测结果显示,梯度增加的顺铂(40、80、120 μmol/L)作用于OV2008细胞24 h,其凋亡率不断增加,分别为(4.55±1.64)%、(25.50±0.94)%和(53.80±1.62)%;而应用抑制剂预孵育的细胞,不同浓度顺铂作用24 h后凋亡率分别为(2.10±0.80)%、(15.75±0.97)%和(20.45±0.87)%;Western blot显示,抑制剂LiCl作用后,细胞的磷酸化GSK-3β表达明显增加,并且顺铂作用亦可引起磷酸化GSK-36表达上调;流式结果还显示,P13K的特异性抑制剂LY294002作用后使顺铂诱导的细胞凋亡率从(18.75±0.70)%增加至(28.40±1.50)%.结论 磷酸化GSK-3β表达增加可抑制顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡.     

LY294002对套细胞淋巴瘤增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响

目的观察磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)特异性抑制剂LY294002对人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡变化;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及信号通路相关蛋白pAkt、Notch1、HES1的变化。结果 LY294002能明显抑制Jeko-1细胞的增殖;经0、5、10和20μmol/L的LY294002作用24h后,Jeko-1细胞的凋亡率分别为(3.25±1.27)%、(11.34±2.35)%、(22.81±2.74)%、(43.61±3.48)%,差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测发现凋亡相关蛋白Bcl-2表达下降,Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达上升,PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt磷酸化水平下降,Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下降。结论LY294002可以特异性抑制PI3K/Akt信号通路,也可下调Notch1信号通路的活性,抑制Jeko-1细胞增殖,促进细胞凋亡。     

红景天苷对大鼠缺血再灌注损伤心肌Akt/GSK-3β作用的研究

目的缺血预处理和后处理能够产生一定的心肌保护效应。观察红景天苷对大鼠心肌缺血-再灌损伤的保护作用,并探讨其保护作用的机制。方法将SD大鼠按随机数字表法分为6组,每组6只:假手术组、心肌缺血-再灌注模型组、红景天苷预防组、红景天苷治疗组、红景天苷预防组+磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002组(LY294002预防组)、红景天苷治疗组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(简称LY294002治疗组)。红景天苷预防组和LY294002预防组于造模前给予红景天苷12 mg/kg腹腔注射1次/d,连续3 d;LY294002治疗组于再灌注即刻给予红景天苷12 mg/kg腹腔注射;假手术组和心肌缺血-再灌注模型组均给予等量等渗盐水腹腔注射;LY294002预防组和LY294002治疗组于冠状动脉左前降支结扎前35 min腹腔注射0.3 mg/kg体重的PI3K特异性抑制剂LY294002。采用免疫细胞化学法检测细胞内Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的分布与变化,Western blot测定细胞内Akt、GSK-3β蛋白表达水平变化及磷酸化状态。结果假手术组、心肌缺血-再灌注模型组、LY294002预防组、LY294002治疗组p Akt/Akt值(0.246±0.002、0.457±0.012、0.303±0.005、0.361±0.019)较红景天苷预防组(0.857±0.014)、红景天苷治疗组(0.683±0.009)均明显降低(P<0.05)。假手术组、心肌缺血-再灌注模型组、LY294002预防组、LY294002治疗组p GSK-3β/GSK-3β值(0.137±0.004、0.380±0.026、0.148±0.013、0.267±0.050)较红景天苷预防组(0.944±0.045)、红景天苷治疗组(0.895±0.043)亦明显降低(P<0.05),而红景天苷预防组与红景天苷治疗组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论红景天苷可增加缺血-再灌注心肌中Akt/GSK-3β的蛋白表达及磷酸化,增强对缺血-再灌注损伤心肌保护作用。     

芹菜素通过上调PTEN蛋白表达诱导人肝癌细胞凋亡

目的 观察芹菜素(apigenin,API)诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用,研究其作用机制是否涉及PTEN蛋白表达的调控.方法 体外培养HepG2细胞,PI染色流式细胞术分析凋亡率;琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带;Western Blot分析细胞PTEN、p-Akt和p-Bad蛋白表达.结果 API诱导HepG2细胞的凋亡,呈浓度依赖性.40μmol/L的API处理HepG2细胞48 h,琼脂糖凝胶电泳呈现典型DNA梯形条带.40μmol/L的API处理HepG2细胞12 h和24 h,PTEN蛋白表达分别上调达132.6%和158.9%;同时磷酸化Akt蛋白水平下降至86.3%和75.6%.磷酸化Bad蛋白水平降低到73.4%和69.3%.结论 API诱导HepG2细胞凋亡作用与上调PTEN蛋白表达、降低磷酸化Akt蛋白和磷酸化Bad蛋白水平相关.     

紫花牡荆素对 H446细胞系肺癌干样细胞球形成能力和 p-Akt蛋白表达的影响

目的：研究紫花牡荆素（canstin,CAS）抑制人小细胞肺癌 H446细胞系肺癌干细胞样细胞球形成作用,探讨其作用机制是否涉及降低 Akt 磷酸化蛋白表达水平。方法：肿瘤球形成法获得 H446细胞系第2代球形成细胞,并检定 CAS、及与 LY294002合用对肿瘤球形成率的影响。Western blot 分析 p-Akt、Akt 蛋白表达。结果：CAS以浓度依赖方式降低 H446细胞系第2代球形成细胞肿瘤球形成率和 Akt 蛋白磷酸化水平。LY294002（5.0μmol/L）增强 CAS 抑制球形成以及下调 p-Akt 蛋白表达作用。结论：CAS 具有抑制 H446细胞系干细胞样细胞球形成作用;Akt 特异性抑制剂有效增强 CAS 抑制肺癌干细胞样细胞球形成与 Akt 蛋白磷酸化。     

高表达PTEN抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

目的 研究PTEN高表达对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的抑制及其信号传导机制.方法 脂质体介导含人全长PTEN基因或空载体转染人肾小管上皮细胞(HKC细胞)48 h,倒置荧光显微镜检测PTEN转染组及空载体转染组绿色荧光蛋白表达;Western blot检测正常组、PTEN转染组、空载体转染组中PTEN蛋白表达;RT-PCR检测3组中PTEN mRNA表达.然后将实验分为正常组、TGF-β1刺激组(给予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1组(PTEN基因转染后给予TGF-β1刺激)、空载体+TGF-β1组(空载体转染后给予TGF-β1刺激),Western blot检测各组细胞E-cad-herin、α-SMA、Akt、p-Akt表达水平.结果 FTEN基因及空载体转染HKC细胞48 h后可见明显绿色荧光蛋白表达;PTEN转染组PTEN蛋白及PTEN mRNA表达较正常组及空载体转染组细胞均显著上升(均P<0.05).在正常组、TGF-β1刺激组、PTEN+TGF-β1组、空载体+TGF-β1组中,TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组较正常组E-cadherin表达明显下降(均P<0.05),而a-SMA及p-Akt表达显著上升(均P<0.05);PTEN+TGF-β1组较TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组a-SMA及p-Akt表达明显下降(均P<0.05).而E-cadherin表达上升(均P<0.05);各组细胞Akt表达水平差异不明显(P>0.05).结论 PTEN通过阻止PI3K/Akt通路活化而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化.     

PI3K／Akt／GSK-3β介导心肌营养素-1对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的探讨心肌营养-1(CT-1)对心肌缺氧复氧损伤的保护作用及信号通路。方法用改良法培养出生1-3 d的乳鼠心肌细胞,分为5组:对照组、缺氧复氧组、缺氧复氧组 CT-1 LY294002组(PIK3／Akt阻断剂)、缺氧复氧组 CT-1组、缺氧复氧组 CT-1 助溶剂DMSO组。CT-1的浓度为10 ng／ml,缺氧3 h,复氧3 h。MTS法测定心肌细胞的存活率,四氯四乙基苯丙咪唑基羰化青碘化物(JC1)以流式细胞仪和免疫荧光检测心肌细胞线粒体膜电位(△(?)m),二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH CA)检测细胞活性氧(ROS),心肌细胞凋亡率用流式细胞仪检测。蛋白免疫印迹(Western blot)检测PI3-K磷酸化蛋白水平和磷酸化糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)。缺氧复氧培养后心肌细胞凋亡率及细胞内ROS较对照组明显增加,分别是(19．72％±1．45％比2．2％±0．14％,14．28％±1．42比3．54±0．46, P<0．05),而心肌细胞存活率显著降低,心肌细胞△(?)m下降,磷酸化GSK-3β蛋白表达明显下调。而CT-1处理的心肌细胞,心肌细胞存活率(87％±3．4％)明显高于缺氧复氧组,而心肌细胞凋亡率及细胞内ROS显著减少,mPTP水平更高,PI3-K磷酸化蛋白和磷酸化GSK-3β蛋白水平增加,eNOS表达上调。CT-1的这些作用能被PIK3／Akt阻断剂LY294002抑制。结论心肌营养素-1能减轻缺氧复氧引起的心肌细胞损伤,其作用依赖PIK3／Akt／eNOS信号通路的激活。     

PI3K/AKT通路与TRPC6通道在AngⅡ诱导足细胞损伤中的相互作用

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路与瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小球足细胞损伤过程中的作用及其可能机制。方法体外培养小鼠肾小球足细胞,分别利用AngⅡ、氯沙坦、PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)、TRPC6通道阻滞剂(SKF96365)进行处理,将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+氯沙坦组、氯沙坦组、AngⅡ+LY294002组、LY294002组、AngⅡ+SKF96365组、SKF96365组,采用qRT-PCR检测各分组细胞TRPC6 mRNA的变化。采用Western blot检测各分组细胞AKT、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、TRPC6蛋白质表达的变化。采用Hoechst 33258染色法检测各组足细胞凋亡情况。结果与空白对照组相比,AngⅡ组AKT磷酸化水平降低,TRPC6的表达升高,足细胞凋亡增加(P<0.05)。与AngⅡ组相比:AngⅡ+SKF96365组AKT磷酸化水平升高,TRPC6的表达下降,足细胞凋亡减少(P<0.05);AngⅡ+LY294002...     

抵抗素通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导H9c2心肌细胞肥大机制研究

目的探讨抵抗素激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路诱导H9c2心肌细胞肥大的分子机制。方法取生长状态良好的H9c2心肌细胞,使用含1 g·L~(-1)胎牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)处理24 h使其细胞同步化后进行不同干预。随机将H9c2心肌细胞分为Con组、R50组、LY294002+R50组和LY294002组,Con组为空白对照;R50组细胞应用50μg·L~(-1)抵抗素处理48 h组;LY294002+R50组细胞预先应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002干预2 h后再用50μg·L~(-1)抵抗素处理46 h;LY294002组细胞应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理2 h组。4组心肌细胞加含药物DMEM培养48 h后进行细胞面积、单细胞蛋白质合成量测定,Western blot检测心肌细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、原癌基因c-myc蛋白及PI3K/Akt非磷酸化及磷酸化水平表达。观察抵抗素(50μg·L~(-1))处理细胞不同时间(0、1、2、3 h)后运用Western blot测定磷酸化(p-Akt)的蛋白表达水平,检测抵抗素处理1 h后4组心肌细胞PI3K/Akt信号通路磷酸化表达水平。结果抵抗素处理H9c2心肌细胞0、1、2、3 h组p-Akt蛋白表达水平分别为0.60±0.26、0.71±0.67、0.52±0.32、0.51±0.32;与0 h组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞1 h组p-Akt蛋白表达水平显著增高(P<0.01);与1 h组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞2、3 h组pAkt蛋白表达水平显著降低(P<0.01);抵抗素处理H9c2心肌细胞2 h与处理3 h后H9c2心肌细胞中p-Akt蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。抵抗素处理H9c2心肌细胞48 h后,与Con组比较,R50组、LY294002+R50组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而LY294002组其心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与R50组比较,LY294002+R50组、LY294002组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与LY294002+R50组比较,LY294002组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。Con组、R50组、LY294002+R50组、LY294002组c-myc蛋白表达水平分别为0.45±0.30、0.68±0.32、0.56±0.33、0.16±0.20,4组间比较差异有统计学意义(F=178.91,P<0.05);与Con组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞48 h后,R50组c-myc蛋白表达水平显著增高(P<0.05);而LY294002+R50组c-myc蛋白表达水平较Con组、LY294002组升高但低于R50组(P<0.05)。经抵抗素处理H9c2心肌细胞3 h后,R50组PI3K/Akt信号通路磷酸化水平较Con组、LY294002+R50组、LY294002组显著升高(P<0.05),其余各组PI3K/Akt信号通路磷酸化水平表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论抵抗素通过激活PI3K/Akt通路,提高Akt磷酸化水平来诱导H9c2心肌细胞肥大。     

吴茱萸碱抑制PI3K/AKT通路诱导小细胞肺癌H1688和H446细胞凋亡

目的 探讨PI3 K/AKT通路在吴茱萸碱(evodiamine,EVO)诱导小细胞肺癌H1688和H446细胞凋亡中的作用.方法 分别以不同浓度(1、5、20 μmol/L)和不同作用时间(3、6、12、24、48 h)的EVO处理H1688和H446细胞,Western blot检测p-AKT的表达水平.以EVO分别作用于经过PI3 K/AKT通路激活剂IGF-1或抑制剂LY294002预处理后的H1688和H446细胞,Western blot检测p-AKT蛋白的表达.将EVO作用于IGF-1预处理的H1688细胞后,Annexin-V/PI染色检测细胞凋亡率,Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达水平.以不同浓度的EVO处理H1688细胞,Western blot检测t-AKT、PTEN蛋白表达,RT-PCR检测AKT mRNA表达.结果 与对照组相比,不同浓度和不同作用时间的EVO处理后H1688和H446细胞中p-AKT表达水平下降(P＜0.05).而IGF-1可减弱EVO下调H1688和H446细胞p-AKT的作用(P＜0.05),并降低EVO在H1688中的增殖抑制和凋亡诱导作用.EVO与LY294002下调p-AKT蛋白的效果差异无统计学意义(P＞0.05).EVO对H1688细胞t-AKT蛋白和AKT mRNA的表达无影响,EVO可明显上调PTEN的表达(P＜0.05).结论 抑制PI3 K/AKT通路活性是EVO诱导H1688和H446细胞凋亡的重要机制之一.     

PI3K/Akt信号通路在转录水平调控VCAM-1表达

目的 探讨PI3K/Akt信号通路是否调控脂多糖诱导的人内皮细胞VCAM-1表达及机制.方法 脂多糖(LPS) 10μg/mL刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)0、6、12、24 h,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VCAM-1蛋白表达,刺激0、4、8、12 h行RT-PCR检测VCAM-1 mRNA;LPS(10μg/mL,后同)刺激HUVEC 0、30、60、120 min后,Western blot检测PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)、磷酸化PI3K (p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt (p-Akt)表达;PI3K抑制剂LY294002(10、50 μmol/L)、Akt抑制剂A6730(2、10 μmol/L)预处理细胞1h后LPS刺激12 h,Western blot检测VCAM-1蛋白表达,刺激8h行RT-PCR检测VCAM-1 mRNA;加或不加抑制剂,LPS刺激8h加入放线菌素D抑制转录,于0、1、2、3、4h收细胞行RT-PCR检测VCAM-1 mRNA,计算mRNA半衰期.结果 LPS刺激HUVEC(6、12、24 h)后VCAM-1蛋白表达增加(P＜0.05),12h达峰值,VCAM-1 mRNA在刺激后也增加(P＜0.05),8h达峰值;LPS刺激HUVEC后p-PI3K、p-Akt增加,p-PI3K在刺激30 min达峰值(P＜0.05),以后逐渐下降,120 min与0h接近(P＞0.05),p-Akt在刺激30 min明显增加,60 min达峰值,120 min仍高于0 h(P＜0.05);LY294002下调了p-Akt表达(P＜0.05),同时降低VCAM-1蛋白、mRNA合成(P＜0.05);Akt抑制剂也抑制VCAM-1蛋白、mRNA(P＜0.05);PI3K、Akt抑制剂均不影响VCAM-1 mRNA稳定性(P＞0.05).结论 PI3K/Akt信号途径在转录水平调控VCAM-1表达.     

PI3K-AKT信号通路对人肝癌Huh-7细胞乳酸和乙酰化修饰水平及细胞生长的影响

目的:探讨PI3K/Akt信号通路对人肝细胞癌Huh-7细胞乙酰化及糖酵解的影响及机制?方法:体外培养Huh-7细胞株,应用不同浓度的PI3K/Akt抑制剂LY294002与mTOR抑制剂雷帕霉素分别进行干预;乳酸试剂盒法检测乳酸水平;Western blot法检测肿瘤细胞中三磷酸腺苷柠檬酸盐裂解酶(adenosine triphosphate-citrate lyase,ACL)表达水平与乙酰化修饰水平;WST法检测细胞增殖水平?结果:①LY294002干预组的乳酸水平低于DMSO对照组,下降66.15%,细胞内ACL的表达水平下降20.84%,乙酰化水平在多位点表达水平下降(P < 0.01,n = 3);②雷帕霉素干预组的乳酸水平低于DMSO对照组,下降90.16%,细胞内ACL的表达水平下降64.16%,乙酰化水平在多个位点表现出不同水平的下降(P < 0.01,n = 3);③以DMSO干预作为对照,20 mmol/L的LY294002和20 μg/L的雷帕霉素分别作用24 h后,对Huh-7细胞的增殖抑制率分别为24.78%和20.67%(P < 0.01,n = 3)?结论:Huh-7细胞中活化的PI3K/Akt/mTOR信号通路能通过提高ACL的表达,上调细胞内乙酰化的修饰水平,从而增加肿瘤细胞的糖酵解,促进肿瘤细胞的生长?