PCR法检测血液中白色念珠菌的敏感性研究

目的:探讨PCR法检测血液中白色念珠菌的敏感度.方法:采用 Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取白色念珠菌DNA,应用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,并采用有限稀释法推测PCR法可检测到的全血中最低白色念珠菌数目.结果:以白色念珠菌DNA为模版,用PCR法扩增得到约为500 bp左右的特异性条带;...     

白色念珠菌ITS2的实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及评价

目的 建立一种快速鉴定白色念珠菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法 在白色念珠菌核糖体RNA编码基因（rDNA）中的内转录间隔区2（ITS2）上设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过实时荧光定量PCR分析系统建立白色念珠菌的检测方法,对其敏感度、重复性和特异性进行方法学评价,并在模拟白色念珠菌血症的血标本中初步探讨其应用价值。结果 所建方法对白色念珠菌纯菌液的准确检测下限为10¹CFU/ml,相应的批内、批间变异系数（CV）分别为1.57%和2.20%。对135株白色念珠菌临床分离株、其他非白念菌株、细菌临床分离株和血液标本进行检测,结果显示该方法特异性为100%。另外,对于模拟白色念珠菌血症的血标本,该方法的最低检测下限为10²CFU/ml。结论 所建方法具有特异性和敏感度高、重复性好的特性,可适用于临床上白色念珠菌引起的血流感染的快速鉴定。     

实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立

目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.     

恶性肿瘤患者深部感染白色念珠菌的基因分型

目的对引起恶性肿瘤患者深部真菌感染的白色念珠菌进行基因分型。方法研究对象90例,CHROMagarCandida鉴定培养基分离鉴定白色念珠菌,PCR方法鉴定并进行ABC基因分型。结果引起恶性肿瘤患者深部真菌感染的白色念珠菌基因型分别为A型(36/90,40%)、B型(32/90,35.6%)、C型(22/90,24.4%),取自同一病人身体不同部位和相同部位的标本均分离出不同基因型白色念珠菌。结论恶性肿瘤患者深部白色念珠菌感染由不同基因型的白色念珠菌株引起。     

念珠菌显色培养基在呼吸道标本检测中的应用

目的：评价科玛嘉念珠菌显色培养基在呼吸道标本检测中的应用价值。方法：用念珠菌显色培养基和API 20 C AUX鉴定103株念珠茵。结果：在103株念珠菌中，显色培养基鉴定出57株白色念珠菌，14株光滑念珠菌，11株热带念珠菌，9株克柔念珠菌，12株其它念珠菌，API 20 C AUX鉴定出58株白色念珠菌、16株光滑念珠菌、12株热带念珠菌、9株克柔念珠菌，8株其它念珠菌。结论：念珠菌显色培养基完全可以简便、准确地分离呼吸道标本常见念珠菌。API 20 C AUX鉴定时间长，且费用高。     

足月孕产妇念珠菌感染的初步调查

目的初步了解足月孕产妇念珠菌感染的基本状况。方法采用念珠菌培养及革兰染色、芽管实验、45℃生长实验、API20CAUX念珠菌鉴定对232倒足月孕产妇阴道分泌物及口腔标本进行念珠茵分离及鉴定。结果阴道念珠茵检测阳性率为52．15％,口腔念珠菌检测阳性率为47．41％．其中20．26％阴道与口腔同时阳性．以白色念珠菌为主。结论足月孕产妇有较高的念珠菌感染阳性率．应得到足够重视。     

16SrRNA基因快速诊断败血症病原菌研究

目的通过合成所有细菌共有的16SrRNA基因高度保守区引物,进行PCR扩增,探讨败血症的快速诊断方法。方法用PCR技术扩增实验室保留株10株的16SrRNA基因,以人类基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌为对照,检测该方法的特异性;采用倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测。结果对所测细菌株均获得920bp扩增产物,而与人基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌无交叉反应;PCR最低能检测1.5×106/L大肠杆菌DNA。结论PCR检测方法是一种极有应用价值的用于败血症早期诊断方法。     

PCR与RFLP相结合对临床标本真菌鉴定的研究

探讨快速、准确检测临床常用标本真菌分离、鉴定方法。方法PCR与RFLP相结合,应用9种临床重要真菌的通用引物,对常用临床标本(痰、BALF、胸水、尿、血)224份进行分离、鉴定,并对19例进行痰与非痰标本结果一致性、敏感性比较。 结果224份标本共检出真菌83株,阳性率37.03％,其中白色念珠菌35株(42.3％),假热带念珠菌30株(36.1％),热带念珠菌10株(12％),光滑念珠菌8株(9.6％)。19例痰与非痰标本47次检测,一致性、敏感性良好。结论PCR结合RFLP对真菌检测具有敏感、快速的特点,值得临床推广应用。     

念珠菌显色培养基临床应用效果评价

目的:CHRO Magar念珠茵显色培养基对临床标本中念珠菌的快速检测作用进行评价。方法:临床标本中分离的念珠菌,接种显色培养基后,作芽管、厚膜抱子形成实验和酵母菌鉴定试剂条并进行鉴定比较。结果:显色培养基24 h内即可快速准确鉴别,88.3%为临床中常见的念珠菌,对白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念球菌鉴定的正确率为100%,光滑念杀菌鉴定的正确率为88.9%。结论:显色培养基是一种方便、快捷、有效的念珠菌分离鉴定培养基,值得临床实验室推广应用。     

浅部真菌病临床标本致病菌DNA提取方法的初步研究

目的初步建立直接从浅部真菌病临床标本中提取致病菌DNA的方法,为PCR技术快速诊断浅部真菌病及相关研究奠定基础。方法采用蛋白酶K消化法、煮沸法和冻融法处理直接镜检阳性的临床标本,以经典的酚-氯法抽提致病菌DNA,并用真菌通用引物ITS1进行PCR扩增检验。结果共收集标本61例,其中有44例PCR可扩增出特异性条带,甲屑的PCR检出率为81．0％,皮屑为69．2％;PER检测为阴性的17例中有7例标本量较少,有5例菌量较少。整个DNA提取过程约需3h。结论本研究初步建立的直接从浅部真菌病临床标本中提取致病菌DNA的方法能满足后续PCR反应的需要：DNA提取效率与标本量和菌量有关。     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

系统性红斑狼疮合并深部真菌感染多重荧光定量PCR检测研究

目的 建立系统性红斑狼疮(8LE)合并白念珠菌和黄曲霉感染的多重荧光定量PCR检测技术,为其诊断提供快速、敏感、特异的方法.方法 通过ATCC公布的白念珠菌及黄曲霉的基因序列,应用分子生物学软件设计两对引物和Taqman探针,通过检测狼疮患者合并白念珠菌及黄曲霉等深部真菌感染,怀疑深部真菌感染样品各20例,以及非白念珠菌及非黄曲霉微生物样品20例.以评价该法阳性率、敏感性、特异性.结果 多重荧光定量PCR检测SLE合并白念珠菌和黄曲霉感染的阳性率及特异性均为100%;而该法和真菌培养法敏感性分别为75.00%和40.00%,且有统计学差异(P<0.05).结论 基于Taqman探针技术的实时荧光PCR检测体系,可同时检测SLE患者合并白念珠菌和黄曲霉深部真菌感染.具有快速、灵敏度高、特异性强、可定量等优点.

Abstract：

Objective To establish a rapid, sensitive and specific method based on multiplex fluorescent quantitative PCR for detection of deep infections with Candida albicans and A spergillus flavus in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Two pairs of primers and Taqman probes were designed according to the gene sequences of Candida albicans and A spergillus flavus available in American Type Culture Collection. The positivity rate, sensitivity and specificity of the multiplex fluorescent quantitative PCR-based method for detecting the fungal infection was tested in 20 specimens from SLE patients with Candida albicans and A spergillus flavus infections, 20 specimens from SLE patients with suspected deep fungal infections, and 20 microbial samples other than Candida albicans or A spergillus flavus. Results The multiple fluorescence quantitative PCR-based method showed a positivity rate and specificity of both 100% for detecting Candida albicans and Aspergillus flavus infections in the SLE patients. This method resulted in a detection sensitivity of 75%, significantly higher than that of fugal culture method (40%, P<0.05). Conclusions The multiplex fluorescent real-time PCR-based method allows rapid, quantitative and simultaneous detection of deep Candida albicans and Aspergillus flavus infections with high sensitivity and specificity in SLE patients.     

检测弓形虫的PCR法和ELISA法的比较

目的:建立快速、敏感、特异的PCR方法,用于检测弓形虫感染。方法:选择弓形虫B1基因194bp片段作为扩增模板,优化反应条件,并测定其敏感性和特异性;以104弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,用PCR法检测感染动物全血DNA,并与ELISA法检测血清IgM进行比较。结果:本实验中,PCR方法的检测阈值为0.2pg弓形虫DNA,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。用PCR法检测感染动物全血DNA,感染后第2d即可测出阳性,总阳性数为1(313/15);而ELISA法检测血清IgM则到感染后第6d才测出阳性,总阳性数为2(2/15)。经统计学检验,二者存在显著差异(P<0.05)。结论:PCR是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于弓形虫病的早期诊断。     

应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真菌

目的:应用内转录间隔区(ITS)引物建立一种较为敏感、特异检测和鉴定条件致病性真菌的方法,为进一步鉴定不同真菌的种、型的亲缘关系提供分子生物学依据。方法:用常规的真菌检验方法对76份口腔标本做初步鉴定,采用通用引物ITS1、ITS4对可疑真菌菌悬液进行PCR扩增,PCR扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对分析。结果:ITS-PCR扩增出种特异的DNA条带,检测菌株76株,DNA测序鉴定出白假丝酵母菌53株(69.7%),其他真菌23株(30.3%)。结论:采用ITS引物测序法,可准确地检测出不同种的条件致病性真菌,并为进一步鉴定菌株的变异性,发现亚种提供基础。     

白念珠菌总蛋白质组二维电泳条件的建立和优化

目的:建立并优化白念珠菌总蛋白质组分析的二维电泳条件.方法:以白念珠菌国际标准菌株SC5314为材料,制备其总蛋白质组样品.以真菌细胞破碎方法、裂解液成分、上样量、固相pH梯度胶条的选择为侧重点,通过不同条件下电泳图谱的比较建立最佳二维电泳技术条件.结果:成功建立白念珠菌总蛋白质制备方法,优化了白念珠菌蛋白质组分析的二维凝胶电泳技术,获得重复性和分辨率都较理想的白念珠菌总蛋白质二维电泳图谱.结论:优化后的二维电泳条件符合白念珠菌的特点,为白念珠菌蛋白质组分析奠定基础.     

石蜡包埋淋巴瘤组织线粒体DNA的提取及PCR扩增

目的:探讨从石蜡包埋组织标本获取线粒体DNA (mtDNA)并进行PCR扩增的有效方法。方法:选取27例石蜡包埋的淋巴瘤组织,分别使用二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20进行脱蜡,改进裂解缓冲液的成分及浓度,酚/氯仿抽提以获取mtDNA并进行电泳和PCR分析。结果:0.5% Tween-20法获取mtDNA纯度及浓度含量明显高于二甲苯/乙醇法(P<0.01);二甲苯/乙醇法和0.5% Tween-20法获取的mtDNA PCR扩增成功率分别为11.1%和40.7%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20两种方法都可以扩增出mtDNA的目的片段,但0.5% Tween-20法操作简便,PCR扩增成功率高,不用接触二甲苯等有毒化学试剂,是一种较为理想的mtDNA提纯方法。     

应用M13引物PCR指纹法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性

目的 探讨M13微卫星引物PCR指纹法用于假丝酵母菌氟康唑耐药性基因分型的可行性。方法 采用纸片扩散法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性，并进一步对41株假丝酵母菌进行M13引物PCR指纹分析，采用RAPD200软件邻接法(neighbour joining，NJ)聚类分析电泳带型模式。结果 41例主要从痰液和阴道分泌物中分离的假丝酵母菌标本中中，氟康唑药物敏感11株(26.8％)，依赖8例(19.5％)，耐药22例(53．7％)，PCR指纹分析至少可检测到12种不同的条带，条带数目从2条到12条不等，电泳带型模式与感染部位和氟康唑药物反应性有关。结论 假丝酵母菌氟康唑耐药性菌珠所占比例较大，M13微卫星引物PCR指纹法可用于假丝酵母菌的分子流行病学调查和氟康唑耐药性基因分型。