日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达

目的　克隆和表达日本血吸虫大陆株原肌球蛋白 (tropomyosin ,TM)编码基因。方法　应用RT PCR方法体外扩增日本血吸虫原肌球蛋白编码基因 ,并采用T载体对该PCR产物直接进行克隆并用于核苷酸序列的测定。将目的基因亚克隆入原核表达载体pQE30 ,以IPTG诱导重组原肌球蛋白的表达。结果　PCR扩增产物约 82 3bp ,符合预计大小 ,并成功地克隆入T载体 ,对其中一克隆pGSjcTM12的插入片段的核苷酸序列分析表明 ,该序列和推测的氨基酸序列与曼氏血吸虫原肌球蛋白基因分别有 91 1%和 98 1%的同源性。该编码基因亚克隆入原核表达载体pQE30获得高效表达 ,分子量约 32kDa,并能被日本血吸虫天然原肌球蛋白免疫血清特异识别。结论　日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和原核表达成功。     

日本血吸虫中国大陆株21.7kDa分子(SjC21.7)的基因克隆及序列分析

目的克隆回本血吸虫中国大陆株２１．７ｋＤａ分子的编码基因。方法合成１对特异性引物,通过聚合酶链反应技术从日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ中对目的基因进行扩增和克隆,对扩增产物进行核苷酸序列分析。结果用聚合酶链反应,从日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ中扩增出１条单一的ＤＮＡ条带,大小约为 ５００～６００ ｂｐ。核苷酸序列分析表明日本血吸虫中国大陆株 ２１． ７ ｋＤａ分子的开放阅读框全长为５５８ ｂｐ,与日本血吸虫菲律宾株２１． ７ ｋＤａ分子基因完全同源。结论日本血吸虫中国大陆株 ２１．７ ｋＤａ膜蛋白基因克隆成功为进一步研究该分子用作疫苗的潜能奠定基础。     

日本血吸虫中国大陆株21.7kDA分子（SjC21.7）的基因克隆 …

目的 克隆日本血吸虫中国大陆株２１．７ｋＤａ分子的编码基因。方法 合成１对特异性引物,通过聚合酶链反应技术从日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ中对目的基因进行扩增和克隆,对扩增产物进行核苷酸序列分析。结果 用聚合酶链反应,从日本血吸虫中国大陆株ｃＮＤＡ中扩增出１条单一的ＤＮＡ条带、大小约为５００－６００ｂｐ。核苷酸序列分析表明日本血吸虫中国大陆株２１．７ｋＤａ分子了的开放阅读框全长为５５８ｂｐ,与日本血     

日本血吸虫副肌球蛋白的克隆和部分核苷酸序列:一种血吸虫病的候选疫苗抗原

副肌球蛋白是多数无脊椎动物肌肉中的主要结构蛋白,脊椎动物则无副肌球蛋白,若用作疫苗候选抗原将不会发生自身免疫反应。已证明曼氏血吸虫的副肌球蛋白(Sm97)有希望成为曼氏血吸虫病疫苗候选抗原,其部分及全部cDNA已得到。本文报告编码日本血吸虫副肌球蛋白的cDNA的克隆及测序。作者从日本血吸虫菲律宾株成虫     

自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库

目的　采用自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库并寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。　方法　用感染日本血吸虫后的自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,将阳性重组子克隆、测序,对核酸序列进行分析,确定目的基因。　结果　从大陆株日本血吸虫成虫λZAPIIcDNA文库筛到26个阳性克隆,经初步鉴定获3种编码蛋白分子的基因:副肌球蛋白,谷胱甘肽S转移酶,羟基类固醇脱氢酶。　结论　感染日本血吸虫后的自愈水牛血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,可用于寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫菲律宾株副肌球蛋白的基因克隆和全部核苷酸序列

血吸虫副肌球蛋白作为疫苗的潜力,在用天然的日本血吸虫副肌球蛋白和天然或重组的曼氏血吸虫副肌球蛋白免疫/攻击实验中得到证实。此外,通过被动免疫,一种小鼠抗副肌球蛋白的单克隆IgE抗体,可使小鼠在血吸虫幼虫自皮肤移行至肺的阶段获得保护。本文作者报道了副肌球蛋白的克隆和全部核苷酸序列。     

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因的表达

为了表达日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因，作者用PCR方法从日本血吸虫基因组DNA扩增出这一副肌球蛋白部分基因，然后将该基因重组于质粒体pBV220中，使其在大肠杆菌中表达。结果获得一32kDa的表达蛋白。免疫印迹分析表明感染兔血清可识别这一表达蛋白。该蛋白的纯化将有利于血吸虫病疫苗的进一步研究。     

日本血吸虫副肌球蛋白全基因克隆、测序及体内表达

目的： 将日本血吸虫大陆株副肌球蛋白（ Ｓｊｃ９７） 编码区全基因克隆及测序, 并研究 Ｓｊｃ９７ 全基因核酸疫苗在小鼠体内的表达。方法： 抽提日本血吸虫成虫总 Ｒ Ｎ Ａ, 逆转录 聚合酶链反应 （ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ） 扩增编码 Ｓｊｃ９７的全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 双脱氧链末端终止法测 Ｄ Ｎ Ａ 序列。构建含 Ｓｊｃ９７ 全基因的质粒表达载体 （ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７） , 并用免疫荧光染色法研究ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 在小鼠体内的表达特性。结果与结论： 用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增获得了 Ｓｊｃ９７ 的编码区全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 并测定了该基因编码区的全序列。与日本血吸虫菲律宾株、日本株及曼氏血吸虫副肌球蛋白编码区全基因比较, 核苷酸序列同源性分别为： ９９４ ％ 、９９２ ％ 和９１０ ％ ; 推导的氨基酸序列同源性分别为：９９７ ％ 、９９８ ％ 和９６０ ％ 。ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 核酸疫苗能在注射的小鼠局部肌肉组织表达 Ｓｊｃ９７ 。     

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析

根据已知日本血吸虫菲律宾株TPI序列，设计合成一对5’端分别带有BamH1，Sal1酶切位点的引物P1和P2，制备日本血吸虫成虫（中国大陆株）mRNA，采用反转录聚合酶链反应技术，从mRNA中扩增出日本血吸虫中国大陆株TPI基因片段，序列分析表明，日本血吸虫（中国大陆株）TPI基因开放阅读框架全长为759bp，与曼氏血吸虫TPI基因的同源性为84％。与日本血吸虫（菲律宾株）TPI基因的同源性为99.7％。     

日本血吸虫黏蛋白样蛋白部分基因的扩增及测序

目的　体外扩增日本血吸虫中国大陆株黏蛋白样蛋白(SjMLP)抗原的部分基因序列。　方法　利用PCGENE软件查找SmMLP的抗原决定簇;特定寡核苷酸引物的设计与合成;Trizol抽提日本血吸虫成虫总RNA,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增目的基因,测序后与SmMLP进行同源性分析。　结果　RT PCR特异性扩增出SjMLP编码区基因序列,其片段大小为756bp,测序结果与SmMLP具有高度同源性。　结论　RTPCR扩增的SjMLP抗原编码区基因序列与预期相符合。     

日本血吸虫卵壳蛋白前体基因Sj423的克隆表达及分析

据日本血吸虫菲律宾株编码卵壳前体蛋白的一段230bp的序列设计PCR引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出日本血吸虫中国大陆株相应的基因片段、然后根据测序结果设计一系列引物,用5’RACE和3’RACE法扩增出该基因cDNA的5’和3’端,再根据测序结果设计全长引物,用RT-PCR方法扩增出大小为423bp的片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株卵壳前体蛋白基因的完整阅读框,对相应基因组区段测序证实该基因没有内含子(GenBank登录号:AF519182)。将其克隆到表达载体pET28c(+)中,在大肠杆菌中获得表达,融合表达产物分子量约为20.9 kD。Real-ti me PCR结果显示该蛋白在尾蚴感染宿主后第23d即卵壳形成时高表达。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

Paramyosin: a candidate vaccine antigen against Schistosoma japonicum

Paramyosin, a 97 kDa myofibrillar protein, is a candidate vaccine antigen for prevention of infection with the human parasite Schistosoma mansoni . To determine if paramyosin would also induce protection against Schistosoma japonicum , paramyosin was biochemically purified from S. japonicum adult worms. SDS-PAGE demonstrated a single protein with a molecular weight of 97 kDa. In four separate experiments, vaccination of mice with S. japonicum paramyosin without adjuvant induced significant resistance (62%–86%, P < 0.001) against cercarial challenge as compared to controls. These data suggest that S. japonicum paramyosin may represent a candidate vaccine for immunization against schistosomiasis japonica.     

血吸虫种株间18S小亚基单位核糖体核酸基因的同源性及其PCR法检测单个尾蚴的敏感性

目的探索日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸基因（18S-rRNA）序列的同源性及采用该基因建立PCR法检测水体中低密度血吸虫尾蚴的可能性。方法提取日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫基因组DNA,采用PCR方法检测上述基因组中同一目的DNA片段,比较其同源性;分别以经沸水加热处理、氨水处理及NaOH、HCl、乙醇沉淀处理和未经处理的单个尾蚴标本为模板,采用PCR法扩增,比较对单个尾蚴的检出率。结果以日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株和曼氏血吸虫基因组DNA为模板,均能扩增出长度为469bp的DNA片段。经氨水处理和NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的单个尾蚴标本,PCR方法均能扩增到目的基因。在未经处理或沸水加热处理的单个尾蚴标本中,仅有50%标本能扩增到目的基因。结论血吸虫不同种株间18S-rRNA基因具有广泛同源性。经氨水处理或NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的标本,采用PCR法对低密度尾蚴的检出率高于未经处理或经沸水加热处理的标本。     

Investigation of recombinant Schistosoma japonicum paramyosin fragments for immunogenicity and vaccine efficacy in mice

Schistosoma japonicum paramyosin, a 97 kDa myofibrillar protein, is a recognized vaccine candidate against schistosomiasis. To improve its expression and to identify protective epitopic regions on paramyosin, the published Chinese Schistosoma japonicum paramyosin cDNA sequence was redesigned using Pichia codon usage and divided into four overlapping fragments (fragments 1, 2, 3, 4) of 747, 651, 669 and 678 bp, respectively. These gene fragments were synthesized and expressed in Pichia pastoris (fragments 2 and 3) or E. coli (fragments 1 and 4). The recombinant proteins were produced at high level and purified using a two-step process involving Ni-NTA affinity chromatography and gel filtration. BALB/c mice were immunized subcutaneously three times at 2-week-intervals with the purified proteins formulated in adjuvant Quil A. The protein fragments were highly immunogenic, inducing high, though variable, ELISA antibody titres, and each was shown to resemble native paramyosin in terms of its recognition by the anti-fragment antibodies in Western blotting. The immunized mice were subjected to cercarial challenge 2 weeks after the final injection and promising protective efficacy in terms of significant reductions in worm burdens, worm-pair numbers and liver eggs in the vaccinated mice resulted. There was no apparent correlation between the antibody titres generated and protective efficacy, as all fragments produced effective but similar levels of protection.     

中国大陆日本血吸虫微卫星DNA的初步研究

目的　研究中国大陆日本血吸虫 (Schistosoma japonicum)微卫星 DNA基因变异。方法　日本血吸虫种群取自中国大陆 7个流行省现场 :浙江省 (嘉善 ) ,安徽省 (贵池 ) ,江西省 (永修 ) ,湖北省 (武汉 ) ,湖南省 (岳阳 ) ,四川省 (茅山 ,天全 ) ,云南省 (大理 ) ,以及菲律宾 Sorsogon省。对每一种群2 0个样本的 DNA,用 6个日本血吸虫微卫星 :M5 A,J5 N,MF1,RRPS,2 AAA和 MPA分析。结果　中国大陆日本血吸虫不同的种群之间和种群内存在高水平的多态性 ,进一步证实中国株和菲律宾株分属不同虫株 ,在中国大陆不同种群间也存在明显遗传变异。结论　证明了用微卫星对日本血吸虫进行种群基因学研究的可行性 ,并提示中国大陆存在日本血吸虫不同的虫株