PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的　评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。　方法　采集海南省疟疾混合感染流行区 3 0 4份滤纸干血滴样本 ,根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列 ,设计合成 3条引物 ,采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段 ,检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA ;同时与镜检法进行比较。　结果　在 3 0 4份样本中 ,PCR法阳性 15份 ,其中间日疟 7份 ,恶性疟 8份 ;镜检法阳性11份 ,其中间日疟 6份 ,恶性疟 5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性 ;镜检阴性而PCR阳性的 4份样本 ,其扩增产物经限制性酶切鉴定 ,证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。　结论　此PCR检测体系灵敏、特异 ,对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

逆转录聚合酶链反应检测和鉴定疟原虫的研究

在同一反应体系中建立能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟及混合感染的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于现场采集血样检测。先以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计1对针对恶性疟原虫的特异性引物,建立RT-PCR检测恶性疟原虫方法,在此基础上,增加1条针对间日疟原虫的种特异性引物,使在同一反应体系中,能够同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段。恶性疟原虫和间日疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小为359bp和449bp特定扩增带,健康人血样和空白对照均未见扩增带。用建立的RT-PCR检测方法对现场采集128份血样进行检测,与镜检的阳性符合率为9609%,14份镜检为阴性的发热病人全血标本中2份RT-PCR检测为间日疟阳性。RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

复式PCR检测间日疟原虫和恶性疟原虫的现场应用

目的探讨复式PCR方法在疟疾诊断中的现场应用价值。方法根据疟原虫18 S rRNA基因序列,合成疟原虫属特异性上游引物和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物,优化PCR反应体系,建立在同一PCR反应体系中同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫基因组特异性DNA片段的疟疾诊断方法,并评价其现场应用价值。结果间日疟原虫和恶性疟原虫基因组DNA经过复式PCR后,分别扩增出1 451 bp和833 bp的特异性条带,而伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及健康人血样均无扩增带出现,用该反应体系可检出原虫血症为1.1×10-6和5.6×10-7的间日疟原虫和恶性疟原虫感染。与镜检法相比,复式PCR检测119份现场样本,112份与镜检结果相同,阳性率为54%,漏诊率为0.8%,误诊率为0,而镜检法依次分别为53%、1.7%和3.4%。结论复式PCR方法检测疟原虫具有简便、快速、特异、敏感等优点,在疑似病例的鉴别诊断和分子流行病学调查中具有良好的应用价值。     

疟疾复合PCR检测系统的建立

目的：建立简易、快速的复合ＰＣＲ系统,用于检测间日疟、恶性疟及混合感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计疟原虫属特异性上游引物Ｓ１和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物Ｓ２和Ｓ３,建立双温度点复合ＰＣＲ扩增系统并用于临床血样的检测。结果：从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出７０５ｂｐ和５７５ｂｐ特定扩增带,而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及健康人血样均未见扩增带。检测原虫水平达２－１０虫／μｌ全血。限制性内切酶酶切分析证实扩增产物为目的片段。检测１０４份镜检确诊疟疾患者血样,其中８１份与镜检结果相符,并查出镜检未发现的１７份混合感染和２份虫种鉴别失误的恶性疟。结论：本系统敏感性高,特异性强,操作简便,可在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。     

聚合酶链反应技术与镜检法诊断间日疟的对比研究

目的　评价聚合酶链反应技术在间日疟诊断中的应用价值。　方法　根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,扩增检测“四热”病人血样中间日疟原虫 DNA;同时作厚血膜镜检疟原虫。　结果　从间日疟患者血样中扩增出 341bp的 DNA片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ,而正常人血样及空白对照无特异性条带 ;对于 2 34份“四热”病人血样 ,PCR法检出 16份阳性 ,阳性率为 6 .8% ;厚血膜镜检 13份阳性 ,阳性率为 5 .6 % ;两种方法相比差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对于 3份 PCR阳性而镜检法阴性的血样 ,重新作 PCR,结果仍然为阳性。以镜检法为标准 ,PCR法的灵敏度为 10 0 % ,特异度为 98.6 %。　结论　PCR技术灵敏特异 ,可替代镜检法用于间日疟感染的临床及现场检测。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究

目的 建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应（PCR）系统。 方法 应用标签引物扩增技术、Primer Premier 5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR，检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较。 结果 新建立的标签引物套式/多重PCR，检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血，间日疟原虫5～10个虫/μl血。检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样（恶性疟24份和间日疟47份）的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%。 结论 通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统，适用于检测现场采集的滤纸血样，其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法，是很有潜力的疟疾诊断技术。     

套式PCR扩增特定SSUrDNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的：用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrDNA）基因为靶基因,选用1对疟原属特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果：从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp,102bp和115bp预测大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％,并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.F.和P.m.的混合感染病例,结论本系统特异、灵敏,稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断,大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增应用于诊断间日疟感染的研究

根据间日疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）基因序列，设计并合成间日疟原虫特异性引物一对，采用聚合酶链反应技术，进行间日疟原虫感染的检测。结果：（１）从间日疟原虫患者的全血ＤＮＡ中扩增出约７７２ｂｐ的基因片段，经限制性内切酶切，证实为间日疟原虫ＣＳＰ基因片段；（２）与间日疟原虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、弓形虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；（３）该检测体系可检测出间日疟原虫感染血样中２．８虫／μｌ血的水平；（４）将该检测体系用于深圳地区及湖北随州地区间日疟感染患者血样的检测，１４７份患者的血样中１４４份检出阳性，可见一条特异性扩增带，与镜检的符合率达９８％，而２０正常人血样均为阴性。上述结果表明该法灵敏、特异且稳定性好，适用于间日疟感染的检测。     

PCR扩增环子孢子蛋白基因3’ 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。     

套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因为靶基因,选用1对疟原虫属特异性引物和4对种特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％。并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.f.和P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

IFN-γ激活巨噬细胞产生一氧化氮杀伤疟原虫的作用

目的 :观察 IFN- γ激活的巨噬细胞 ( MΦ)合成的一氧化氮 ( NO)及其在疟疾保护性免疫中杀伤疟原虫的作用。方法 :体外分离培养小鼠腹腔 MΦ,与不同浓度的 γ干扰素 ( IFN- γ)共育 4 8h后 ,加入分离的寄生疟原虫的红细胞 ,观察激活的 MΦ NO产生水平及其对疟原虫的杀伤作用。结果 :IFN-γ能激活 MΦ产生 NO,其产生的量与IFN-γ的浓度有关 ;MΦ对疟原虫的杀伤作用与 NO的释放量呈显著相关关系 ( r=0 .898,n=13,P<0 .0 1) ;N-硝基 - L -精氨酸 ( N- nitro-L- arginine,L- NNA)能抑制 NO合成 ,同时也降低 MΦ 的杀伤活性 ;感染约氏疟原虫的 BAL B/c小鼠注射 L- NNA,导致原虫血症上升 ,小鼠死亡率升高。结论 :IFN- γ激活 MΦ产生 NO可能是杀伤疟原虫的重要作用机制。     

东方巴贝虫cDNA文库的构建与免疫学筛选

目的 构建东方巴贝虫（Babesia orientalis）cDNA文库, 从中筛选免疫学阳性的克隆。 方法 用东方巴贝虫感染牛, 提纯红细胞内虫体的总RNA, 反转录合成cDNA, PCR扩增后将其连接于噬菌体载体（λTriplEx2）, 通过体外包装, 建成东方巴贝虫cDNA文库, 并进行扩增。用兔抗东方巴贝虫的血清筛选cDNA文库, 阳性克隆经大肠埃希菌BM25.8自身环化酶将噬菌体重组子λTriplEx2转化为相应的质粒重组子pTriplEx2, PCR鉴定插入片段大小, 并测序, 用Blast对测序结果进行同源性分析, 并对序列编码的氨基酸序列进行结构和功能的预测。 结果 未扩增文库的滴度为2.0×10⁶ pfu/ml, 重组率为98.8%, 文库插入片段大小为500~3 000 bp, 扩增后的滴度为5.8×10⁸ pfu/ml。从东方巴贝虫cDNA文库中筛选得到3个阳性克隆B04、B05和B41, 插入片段大小分别约为1 300、1 000和2 400 bp, 3个片段均包含开放阅读框, 分别与多种原虫的核动蛋白、功能未知的假定蛋白和热激蛋白70具有较高的同源性。B04、B05和B41分别编码310、192和647个氨基酸, 相对分子质量(Mr)分别约为34 000、21 000和70 700。 结论 构建了较高质量的东方巴贝虫cDNA文库, 并发现3个东方巴贝虫阳性克隆。     

杜氏利什曼原虫cDNA文库的构建

目的 :建立杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,以获取个体基因表达产物和研究基因结构。方法 :以杜氏利什曼原虫四川人分离株 m RNA为模板 ,体外合成 cDNA,以噬菌体λgt11DNA为载体构建文库。结果 :共获 2× 10 6重组子 ,插入比例为 4 8%。文库经抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫兔抗血清筛选 ,共筛 2× 10 4重组子 ,获 3个阳性表达克隆 ,表达产物的分子量分别为 :136k Da、160 k Da和 148k Da。结论 :已构建成的表达型杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,其插入比例和表达效率均较高。     

鼠尿液中弓形虫B1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中弓形虫B1基因序列,设计1对引物和1条TaqMan探针。从感染弓形虫小鼠尿液提取弓形虫总DNA,先用普通PCR扩增获得目的基因产物,将纯化的回收产物与pMD18-T载体连接,测序证实为目的片段后,制备系列浓度参照品。再优化实时荧光定量PCR反应体系,并对体系的灵敏度、重复性、线性、特异性和参照品稳定性进行评价。其灵敏度为104拷贝/ml;批内变异系数为2.42%,批间变异系数为4.18%,线性为103～107拷贝/ml,特异性为100%,参照品稳定。该法检测鼠尿样弓形虫DNA具有方便、灵敏、特异和重复性好等优点。     

复式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫的研究

目的： 建立在同一次扩增中即可鉴别患者感染的疟原虫虫种的复式ＰＣＲ检测方法。方法： 根据恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）中度重复基因序列ｐＢＲＫ１－１４ 和间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）线粒体细胞色素Ｃ氧化酶基因ＣＯＩＩＩ合成引物,采用经优化的ＰＣＲ反应体系, 对疟原虫ＤＮＡ模板进行扩增。结果： Ｐ．ｆ．与Ｐ．ｖ．分别被扩增出２０６ 和３７０ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段,与人白细胞ＤＮＡ 无交叉;用该反应体系至少可检测出原虫血症为５×１０－ ７的Ｐ．ｆ．感染和１．０２×１０－ ６ Ｐ．ｖ．感染; 自云南疟疾流行区采集的７８３份滤纸干血滴样本中, 复式ＰＣＲ法阳性检出率为８５．８％ , 误诊率为０, 漏诊率为０．１％ , 而镜检法依次分别为８４．９％ 、３．１％ 和１．０％ , 两者符合率为９５．８％ 。结论： 本复式ＰＣＲ检测疟原虫较镜检敏感、特异, 适用于我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断、流行病学调查、药物的疗效考核和献血员的筛选等。