用聚合酶链反应技术鉴别恶性疟原虫不同地理株的初步研究

目的　阐明 Fcc1/ HN株与云南株间的不同生物学特性。　方法　用 M2 6 - 32 作探针 ,筛选恶性疟原虫 c DNA基因表达文库 ,根据所获得的靶抗原决定簇表位的基因序列设计引物 ,分别进行 PCR扩增 ;地高辛酶促生物标记 Fcc1- HN株 DNA的 PCR扩增产物 ,分别与 Fcc1/ HN株 DNA、云南株 DNA和阳性克隆 5 11的扩增产物杂交。　结果　 PCR扩增后 Fcc1/ HN株 DNA在约 5 0 0 bp和 4 5 0 bp处有 2条特异性条带 ;云南株 DNA在约 5 0 0 bp处有 1条较淡的条带和 130 0bp处一较亮的特异性条带 ;阳性克隆 5 11仅在约 5 0 0 bp处有 1条特异性条带。标记探针能与克隆 DNA、恶性疟原虫Fcc1/ HN株和云南株的 PCR扩增产物杂交。　结论　恶性疟原虫 Fcc1/ HN株与云南株在基因组 DNA结构上可能存在差异。     

恶性疟原虫cDNA克隆(CO111)的序列测定和分析

目的: 测定和分析cDNA 克隆(CO111)与抗恶性疟原虫兔血清和1株单克隆抗体呈阳性反应的序列。方法:采用PCR扩增CO111 克隆的cDNA 片段,纯化后经Klenow 酶补平,与M13m p18 载体连接,转化到大肠杆菌(E.coli) JM109。PCR筛选和鉴定M13单链,PEABI373ADNA自动测序仪测序,PC/GENE和GenBank (EM-BL)等软件进行序列分析和比较。结果:CO111 cDNA克隆含有233对核苷酸对。与GenBank 数据库中恶性疟原虫DNA比较,未发现与该cDNA相同的序列。结论:分离出1 个新的与抗恶性疟原虫抗体呈阳性反应的抗原cDNA克隆     

重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备

目的 鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶（ALD），制备针对此酶的单克隆抗体。 方法 用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因，经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠，腹腔注射免疫3次,每次间隔2周，加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体。同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验（IFAT）和蛋白质印迹（Westernt blotting）分析。 结果 ELISA检测表明，小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1∶10⁵，IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原；Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量（Mr）约41 000；所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应。经ELISA检测 3次，筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫；抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型。 结论 本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶，并获得特异性的单克隆抗体。     

保护性免疫血清及单克隆抗体筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　为寻找有效的抗日本血吸虫感染疫苗候选抗原分子。方法　用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,再用同法免疫鼠脾细胞制备的单克隆抗体对所获阳性克隆进行再筛选 ,并对免疫筛选的阳性克隆的cDNA插入片段进行PCR扩增。结果　兔免疫血清确定 12个阳性克隆 ,其中 6个克隆与 2株以上的单抗呈阳性反应 :PCR扩增cDNA插入片段大小约 40 0bp～ 1 4kb左右。结论　已筛选到与致弱尾蚴免疫兔血清及同法免疫制备单抗产生特异反应的阳性克隆 ,获得一批编码可能具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。     

恶性疟原虫血期抗原表达和人免疫血清筛选克隆的研究

用细菌噬菌体λgtll表达系统建立恶性疟原虫血期基因组DNA库,并在大肠杆菌Y1090R~-M~ 变性株中进行抗原表达,用恶性疟病人免疫血清筛选出表达恶性疟抗原的克隆20株,共中有2株与48份病人血清均起反应。这两株克隆在细菌中的表达产物比野生型λgtll的多出1条分子量大于β一半乳糖苷酶的多肽,而且此蛋白多肽可与兔抗β一半乳糖苷酶血清和病人免疫血清出现反应。     

间日疟原虫特异性DNA片段的克隆和鉴定

本文从间日疟患者血液中分离出间日疟原虫,将其基因组 DNA 片段克隆到载体 pUC12质粒中,构建了间日疟原虫 DNA 文库。利用质粒的遗传标志初步筛选重组克隆;用~(32)P 标记的间日疟原虫DNA,人白细胞 DNA 和恶性疟原虫 DNA 为探针分别作菌落杂交,差异筛选出4株间日疟原虫特异的重组克隆,命名为 pVA1—4。然后酶切鉴定其插入片段,并用 Southern blot 分析,表明重组质粒 pVAl 含有间日疟原虫特异性 DNA 片段。     

抗恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

采用恶性疟原虫重组富组氨酸蛋白 (HRP- )融合表达蛋白免疫 BAL B/ c小鼠 ,取脾细胞与 SP2 / 0细胞融合 ,经 3次 EL ISA筛选 ,共获得 6株分泌抗恶性疟原虫重组 HRP- 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (1B11、1D10、2 E7、3A3、3F9、4G5 ) ,用有限稀释法进行克隆、亚克隆及扩大培养 ,并用杂交瘤细胞经腹腔接种 BAL B/ c小鼠制备腹水。 6株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 (Mc Ab)经琼脂双扩散鉴定均为 Ig G1亚类 ,Dot- EL ISA及 Western blot分析显示 6株 Mc Ab都能与重组 HRP- 抗原发生特异性反应 ,但其中只有 2 E7和 3A3在 Dipstick免疫胶体金反应中能与恶性疟原虫培养上清中的天然 HRP- 结合     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体。方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting)分析其特异性。结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在1∶6 400～1∶51 200特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2。所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应。结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体。     

恶性疟原虫（海南株）cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的 :构建恶性疟原虫 c DNA表达文库。方法 :采用“一步法”提取红内期恶性疟原虫12 2 4 μg RNA,经 Oligo( d T)纤维素柱纯化得到 35.84 μg poly ( A) m RNA。取 10 μg m RNA反转录得到 1.75μg平端双链 c DNA,与含 Eco RI,Not I,Sal I酶切位点的衔接头连接后 ,经分级分离柱纯化回收到 2 0 0 ng大小主要在 50 0 bp- 7kb左右的 c DNA片段。取 50 ng c DNA与λgt11噬菌体臂连接后体外包装 ,完成建库。并采用 PCR方法初步鉴定该文库。结果 :已构建一个含 10 6个重组子的 c DNA表达文库。结论 :文库容量及插入 c DNA片段的大小适合于进一步研究。     

PCR扩增环子孢子蛋白基因3’ 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。     

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 ^-7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 ^-5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。     

东方巴贝虫cDNA文库的构建与免疫学筛选

目的 构建东方巴贝虫（Babesia orientalis）cDNA文库, 从中筛选免疫学阳性的克隆。 方法 用东方巴贝虫感染牛, 提纯红细胞内虫体的总RNA, 反转录合成cDNA, PCR扩增后将其连接于噬菌体载体（λTriplEx2）, 通过体外包装, 建成东方巴贝虫cDNA文库, 并进行扩增。用兔抗东方巴贝虫的血清筛选cDNA文库, 阳性克隆经大肠埃希菌BM25.8自身环化酶将噬菌体重组子λTriplEx2转化为相应的质粒重组子pTriplEx2, PCR鉴定插入片段大小, 并测序, 用Blast对测序结果进行同源性分析, 并对序列编码的氨基酸序列进行结构和功能的预测。 结果 未扩增文库的滴度为2.0×10⁶ pfu/ml, 重组率为98.8%, 文库插入片段大小为500~3 000 bp, 扩增后的滴度为5.8×10⁸ pfu/ml。从东方巴贝虫cDNA文库中筛选得到3个阳性克隆B04、B05和B41, 插入片段大小分别约为1 300、1 000和2 400 bp, 3个片段均包含开放阅读框, 分别与多种原虫的核动蛋白、功能未知的假定蛋白和热激蛋白70具有较高的同源性。B04、B05和B41分别编码310、192和647个氨基酸, 相对分子质量(Mr)分别约为34 000、21 000和70 700。 结论 构建了较高质量的东方巴贝虫cDNA文库, 并发现3个东方巴贝虫阳性克隆。     

杜氏利什曼原虫cDNA文库的构建

目的 :建立杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,以获取个体基因表达产物和研究基因结构。方法 :以杜氏利什曼原虫四川人分离株 m RNA为模板 ,体外合成 cDNA,以噬菌体λgt11DNA为载体构建文库。结果 :共获 2× 10 6重组子 ,插入比例为 4 8%。文库经抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫兔抗血清筛选 ,共筛 2× 10 4重组子 ,获 3个阳性表达克隆 ,表达产物的分子量分别为 :136k Da、160 k Da和 148k Da。结论 :已构建成的表达型杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,其插入比例和表达效率均较高。     

恶性疟原虫红内期不同发育阶段PfRON4基因转录水平分析

目的 分析恶性疟原虫棒状体颈部蛋白4基因（PfRON4）在红内期不同发育阶段的转录水平。 方法 用山梨醇结合等渗细胞分离液（Percoll）对实验室体外培养的恶性疟原虫进行均一化处理, 收集间隔为6 h不同发育阶段的疟原虫, 提取RNA。根据PfRON4基因及相关基因(PfAMA1和PfRhopH2)的序列设计特异性引物, 构建标准质粒并制作标准曲线, 对PfRON4及相关基因的mRNA进行定量检测分析。 结果 纯化并同步后的疟原虫生长发育较为同步均一, 用于定量分析的标准曲线相关性较好, PfRON4、PfAMA1和PfRhopH2的相关系数（r值）分别为-1.00、-0.98和-0.98。产物熔解曲线分析结果均显示为单一波峰。定量分析结果显示, 在恶性疟原虫红内期发育过程中, PfRON4基因的转录水平在裂殖子入侵红细胞后36～40 h（即成熟裂殖体阶段）达到高峰。 结论 恶性疟原虫PfRON4基因在成熟裂殖体阶段高表达。     

恶性疟原虫裂殖子表面抗原MSA1第二区基因在大肠杆菌中的表达

目的 :在大肠杆菌中高效表达恶性疟原虫裂殖子表面抗原 MSA1- R2 ,进一步研究其生物学功能。方法 :将 MSA1- R2基因重组于 p WR4 50 I半乳糖苷酶融合蛋白表达载体中 ,转化大肠杆菌 ,酶切鉴定重组克隆。用 IPTG诱导 MSA1- R2融合蛋白的表达 ,对表达产物进行 SDS- PAGE、β-半乳糖苷酶活性、dot- ELISA和Western- blot鉴定。结果 :表达产物占菌体总蛋白的 35%— 4 0 % ,相对分子量为 70 k Da,与半乳糖苷酶 - MSA1R2融合蛋白的理论分子量相符。IPTG诱导 4 h后 ,β-半乳糖苷酶活性可增高 10倍— 14倍 ,用 dot- ELISA和 Western- blot均证实表达产物具有恶性疟原虫抗原表位。结论 :p WR4 50 -大肠杆菌表达系统可以高效表达具有免疫学活性的疟原虫蛋白。     

Synthesis and evaluation of monoclonal antibody against Plasmodium falciparum merozoite surface antigen 2

ObjectiveTo assess the quality of expressed MSP-2 and also to confirm the immune response against different domains of these proteins.MethodsMice were immunized with a schizont extract to stimulate the immune system to make antibodies against different antigens of the late stage parasite including production of antibodies against different domains of Plasmodium falciparum (P. falciparum) MSP-2. B lymphocytes of immunized mice were extracted from the spleen and the fusion was performed using NS-1 myeloma cells and the hybridoma cells were assayed by ELISA either with a schizont extract or different domains of MSP-2 and/or by IFAT with whole schizont preparation. Fusion of NS-1 and spleen cells was performed. The positive hybrids were cloned and ELISA was applied against different dilutions. The positive clones were transferred to a small tissue culture flask and after developing they were assayed against schizont extract and the different MSP-2 domains. The positive clones were expanded to large (75 cm²) flask and cultured under the same conditions, checking them using both ELISA and IFAT and the positive cells were frozen as soon as possible.ResultsA total number of 7 fusions including 26 plates (2 496 wells) were performed, of which 1 336 hybrids were produced and the overall efficiency (1 336/2496 × 100) was about 53%. ELISA was performed to detect the positive hybrids against crude schizont extract by which the highest frequency to crude schizont extract was found for the supernatant of the hybrids produced in fusion number 3 (66 out of 315 hybrids). The supernatant of both B5 and F1 hybridoma cells were more positive against domain 2 of the MSP-2 recombinant protein in Western blotting test. Western blotting results also showed that different domains of the MSP-2 recombinant protein and also the MSP-2 of the P. falciparum parasite were recognized by some of the positive clones and also immune sera.ConclusionsBringing together all the results of this study it has been confirmed that some clones have recognized both schizont extract and different domains of the MSP-2 recombinant protein and therefore confirming the quality of the MSP-2 domains.     

亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位

目的 表达亚洲带绦虫（Taenia asiatica,Ta）成虫烯醇化酶（enolase,ENO）基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。 方法 通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a（+）,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。 结果 PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a（+）-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量（Mr）为47 000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37 mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。 结论 纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。