神经营养因子-3对海马神经元缺氧损伤保护作用的研究

目的观察单纯缺氧损伤对体外培养海马神经元内源性神经营养因子-3(neurotrophin-3, NT-3)表达的影响及外源性NT-3转导对单纯缺氧所致神经元凋亡的保护作用。方法体外分散培养新生Wistar大鼠海马神经元,体外培养第7天通过充氮法建立单纯缺氧损伤模型;用重组腺病毒载体pAC- CMV-PLPA构建携带NT-3全长cDNA的重组腺病毒Ad-NT-3,并分别于损伤前后向体外培养的海马神经元转导外源性NT-3;采用Western Blot检测在缺氧损伤前后及有无外源性NT-3转导的情况下NT-3 及Bcl-2的表达水平;采用TUNEL法检测缺氧及外源性NT-3转导后神经元凋亡的情况。结果 (1)单纯缺氧损伤后海马神经元的凋亡细胞标记指数由15．2％上升至56．4％,内源性NT-3表达量下降至对照组水平的71％。(2)缺氧损伤前重组腺病毒转导可使损伤后NT-3表达量上升至对照组的1.88倍、损伤后重组腺病毒转导亦可使NT-3表达量上升至对照组的1．42倍,而Bcl-2的表达量相应地上升至对照组的 1．69倍和1．32倍,凋亡细胞标记指数降至32．8％和45．4％。(3)统计学分析显示,海马神经元NT-3与Bcl- 2表达量间呈显著性正相关,二者与凋亡细胞标记指数间均呈显著性负相关。结论单纯缺氧损伤可使体外培养的海马神经元内源性NT-3表达量下降;腺病毒转导的外源性NT-3可保护单纯缺氧损伤神经元免于凋亡;其保护作用部分可能是通过对Bcl-2表达的诱导实现的。     

NT-3基因过表达慢病毒载体的构建和包装及鉴定

目的构建神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因慢病毒载体,检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达。方法体外扩增NT-3,将NT-3全长载体GV287-GFP与扩增出的NT-3用AgeI进行酶切,将NT-3全长序列克隆入GV-287-GFP,转化大肠杆菌DHS a感受态细胞,筛选出阳性克隆进行基因测序。重组GV287-EGFP质粒、pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒三质粒共转染至包装细胞293T,培养48 h后收集细胞上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在MSCs的转染效率。荧光显微镜观察转染是否成功,RT-PCR和Western blot检测MSCs细胞中NT-3蛋白的表达。结果测序结果和Western blot检测均证明NT-3慢病毒载体构建正确,且在细胞中正确表达。与辅助质粒共包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MSCs细胞。包装慢病毒、浓缩病毒悬液的滴度为2×109/ml慢病毒浓缩液。结论成功构建了稳定高效表达NT-3基因的慢病毒载体。     

人重组NT-3基因体外转染胚胎干细胞及其表达

目的 探讨神经营养素-3(NT-3)基因体外转染小鼠胚胎干细胞(ES)的可能性及其表达情况.方法 用脂质体介导的方法,将重组真核表达载体PCDNA-3.1(+).NT-3瞬时转染ES.用细胞免疫组化及RT-PCR检测转染细胞NT-3蛋白及mRNA表达.ELISA检测细胞分泌上清液中NT-3蛋白表达.结果 细胞免疫组化结果显示,转染NT-3基因的ES细胞胞浆呈红色染色;RT-PCR得到200 bp的基因片段;ELISA检测细胞分泌上清液中NT-3蛋白表达呈阳性,与对照组有显著差别(P＜0.05).结论 重组真核表达载体PCDNA-3.1(+).NT-3可成功转染ES,获得稳定表达NT-3的ES细胞株.     

以海马神经元为靶细胞Ad-Easy系统快速构建携带PTEN基因的重组腺病毒表达载体

摘要：目的：应用Ad-Easy腺病毒载体系统快速构建携带PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因的重组腺病毒表达载体,为应用基因技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定基础。方法：采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增获得目的基因PTEN, 克隆入pAdTrack-CMV穿梭质粒（含绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）基因）形成转移载体pAdTrack-CMV-PTEN,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组;重组子酶切鉴定正确后转染HEK293细胞,PCR分析鉴定扩增情况及Western blot检测受腺病毒感染的海马神经元内PTEN蛋白的表达。结果：荧光显微镜检测到受腺病毒感染的HEK293细胞表达GFP,出现明显的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）,经3轮扩增得到了病毒所需滴度。PTEN蛋白在受感染腺病毒神经元内表达显著增强。结论：利用Ad-Easy系统成功快速的构建了携带PTEN基因的腺病毒表达载体,为研究基因治疗缺血性脑损伤奠定了基础。     

力生长因子重组腺病毒载体构建及其在成骨细胞中的表达

背景：研究表明,力生长因子(mechano-growth factor,MGF)能激活卫星细胞,促进成肌细胞增殖,在治疗肌损失、预防心肌损伤和修复神经损伤等方面有重要的作用。机械拉伸可使成骨细胞表达MGF,但是MGF对骨组织生理生化行为的影响机制尚不清楚。 目的：应用携带MGF基因的重组腺病毒载体转染成骨细胞,观察MGF在成骨细胞中的表达。 方法：将MGF基因插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建pAdTrack-MGF重组体。pAdTrack-MGF与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组,生成重组腺病毒质粒pAdEasy-MGF。脂质体介导pAdEasy-MGF转染293A细胞,包装成整的重组腺病毒Ad/MGF。用Ad/MGF感染原代培养的大鼠成骨细胞,荧光示踪计数法测定感染效率,RT-PCR法对重组腺病毒感染结果进行鉴定。 结果与结论：实验构建的重组腺病毒载体Ad/MGF滴度可达8.5×108 pfu/mL。Ad/MGF能高效感染体外培养的Wistar大鼠成骨细胞并表达目的基因,当感染复数为100时,感染效率最高。说明实验构建的Ad/MGF重组腺病毒可在大鼠成骨细胞中有效表达。     

pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建大鼠神经营养因子3（NT-3）基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Li-pofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒。将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础。     

大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率☆

背景：重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法。同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点。体外连接法又不可避免非特异性的基因重组及基因突变。 目的：应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体，测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率。 设计、时间及地点：单一样本实验，于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：穿梭载体pShuttle-CMV（含绿色荧光报告基因）和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒；用KpnⅠ + XhoⅠ从质粒pCMV-Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1基因片段，亚克隆至pShuttle-CMV中，形成重组穿梭质粒。用I-CeuI + I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段，亚克隆至腺病毒基因组质粒中，得到重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1，转化体外培养的心肌成纤维细胞。 主要观察指标：用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒，并测定重组腺病毒的滴度和感染效率。 结果：①核苷酸序列分析表明，pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1 cDNA；黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上，以KpnⅠ + XhoⅠ双酶切可回收3 kb的克隆片段和5.1 kb的载体片段；重组腺病毒质粒用XhoⅠ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段。②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用；提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13 kb的特异性片段；用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后，病毒滴度检测达2.0×1011 PFU/mL。③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞，24 h后所有细胞均表达绿色荧光。 结论：成功构建了携带大鼠黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体，经纯化浓缩后具有较高的滴度，能有效转染心肌成纤维细胞。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒★

目的：AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒。 方法：实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成。①实验材料：清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，骨架质粒pAdeasy-1，大肠杆菌BJ5183和DH10B，人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠。②实验方法：从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA，应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10 cDNA，定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10，酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中，获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10，Lipofectamin包装转染293细胞，获得重组腺病毒vAd-IL-10，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。将293细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中，测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3 d后，以TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后，PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达。 结果：①重组腺病毒的包装及滴度测定：经限制性内切酶转染293细胞16 h后，荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光，可间接反映目的基因的表达。将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒，通常传至第4~5代于接种病毒后24~48 h，几乎可观察到所有细胞出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vAd-IL-10。vAd-IL-10滴度为5.5×108 pfu/mL，vAd-GFP滴度为9.0×108 pfu/mL。②目的基因RT-PCR产物的鉴定：提取重组腺病毒感染293细胞总RNA，RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580 bp预计大小的片段，表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录。 结论：利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体，并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10，可在293细胞中有效转录。     

人NT-3基因转染对雪旺细胞生物学行为的影响

目的观察神经营养素-3(NT-3)基因转染对雪旺细胞生物学行为的影响.方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,从人肝脏组织总RNA中克隆NT-3 cDNA,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT-3;应用混合酶消化法分离、纯化雪旺细胞;采用阳性脂质体介导法将重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3转染雪旺细胞,观察外源性NT-3对雪旺细胞生物学行为的影响.结果成功地从人肝脏组织中克隆了NT-3 cDNA,构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT-3;分离、纯化得到了高纯度的雪旺细胞;将重组质粒转染雪旺细胞,与对照组相比,转染NT-3基因的雪旺细胞形态正常;经NT-3抗体免疫组化染色见NT-3转染组雪旺细胞胞浆呈深棕色着色,轴突着色清晰可见,与对照组相比,明显变长;空载体转染组及空白对照组胞浆及轴突着色均较淡;对各组细胞胞浆着色进行半定量分析,结果表明NT-3基因转染组灰度值显著高于对照组(P<0.01).结论 NT-3基因转染后雪旺细胞NT-3含量明显增加,轴突变长,本实验结果有望为面神经损伤后的修复提供新的途径.     

腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP构建及其在神经干细胞中的表达

摘要 目的 研究腺病毒载体Ad-BDNF -EGFP的构建及在神经干细胞（NSCs）中的表达。方法 通过RT-PCR从在大鼠的海马中获得BDNF基因,通过基因克隆以及HEK293包装,获得了含增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP,将其感染原代培养的神经干细胞,观察EGFP及BDNF两种基因的表达,镜下测定转染率,并检测RT-PCR产物,证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选,抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果 荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光;通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力;用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF, 72h的含量达到最高值,为12.78ng/ml;证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力,且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论 腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达,为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞,介导基因治疗中枢神经系统疾病莫定了基础。     

重组腺病毒Ad5-mHes1的构建及其在小鼠海马组织中的表达

目的 构建含小鼠Hes1基因的重组腺病毒(rAd)并观察其在小鼠海马组织中的表达情况,为进一步研究Hes1基因在成年小鼠神经再生中的作用奠定基础。 方法 利用限制酶对pEGFP-mHes1质粒和pDC316质粒进行酶切,将获得的mHes1目的基因片段和pDC316质粒酶切产物回收,在T4 DNA连接酶作用下连接,形成pDC316-mHes1穿梭质粒,并用PCR法及EcoR Ⅰ+HindⅢ双酶切法对pDC316-mH-Hes1进行鉴定。利用AdMax包装系统,穿梭质粒pDC316-mHes1与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293细胞,同源重组产生复制缺陷型腺病毒Ad5-mHes1,其报告病毒是包含高强度绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒Ad5 -EGFP。向成年C57BL/6小鼠海马中立体定向注射Ad5 -mHes1及Ad5-EGFP,Western blotting检测注射后7 d Hes1蛋白在海马中的表达情况,荧光显微镜观察EGFP在海马中的表达情况。 结果 用PCR法及EcoR Ⅰ+HindⅢ双酶切法对pDC316-mHes1鉴定的实验结果与预期结果相符,经测序后其序列与mHes1 CDS序列一致。注射后7d,Hes1蛋白在PBS注射组和Ad5-mHes1注射组海马组织中均有表达,其Hes1蛋白与GAPDH的比值分别为0.363±0.053和0.705±0.128,差异有统计学意义(P＜.05)。荧光显微镜下在海马齿状回颗粒细胞层中观察到Ad5-EGFP表达的绿色荧光。 结论 本研究成功构建了Ad5-mHes1表达载体系统,并在C57BL/6成年小鼠海马组织中表达了Hes1基因。     

携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达*☆

目的：内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮细胞抑制因子，但内皮抑素蛋白极不稳定，难以制备及应用，故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用。实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒，并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白。 方法：实验于2006-03/10在中山大学生命科学院完成。以Pshuttle-Endostatin质粒为模板，应用特异引物，通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断，经测序鉴定后，酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中，再与骨架质粒AdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，重组质粒经筛选、提取、纯化后，经酶切及测序鉴定正确，再大量扩增为腺病毒载体，线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增，得到的病毒液纯化扩增后，感染人脐静脉内皮细胞，反转录-聚合酶链反应检测感染细胞中目的基因的表达，蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达。 结果：获得的Endostatin基因片段经酶切及测序鉴定正确，重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确，成功转染AAV293细胞，包装并扩增出病毒液，纯化后测滴度为2.06×1010 pfu/mL，进一步感染人脐静脉内皮细胞，在其中检测到目的基因及蛋白表达。 结论：人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功，且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的基因及蛋白。     

DMT1第四功能区腺病毒表达载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建携带DMT1第四功能区基因的重组腺病毒表达载体,并对其功能进行初步探讨。方法:采用AdEasy系统构建携带DMT1第四功能区基因的重组腺病毒载体pAd-DMT1-4,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAd-DMT1-4。vAd-DMT1-4感染C6胶质瘤细胞后,采用RT-PCR检测目的基因表达,用铁孵育感染重组腺病毒的靶细胞后,测定C6胶质瘤细胞内OH.和MDA含量。结果:PCR、序列测定以及限制性酶切证实vAd-DMT1-4基因正确插入穿梭质粒,并与病毒骨架质粒pAdEasy-1重组,重组腺病毒表达载体构建成功。经293细胞包装获得具有稳定感染性的重组腺病毒vAd-DMT1-4,感染重组腺病毒的C6胶质瘤细胞DMT1-4表达增加。用铁孵育感染重组腺病毒的靶细胞后,C6胶质瘤细胞内OH.和MDA含量有增高的趋势。结论:重组腺病毒vAd-DMT1-4可有效感染C6胶质瘤细胞。     

腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N的构建及表达

目的构建携带Son ic hedgehog氨基端(Shh-N)基因的腺病毒表达系统并在包装细胞中制备相关病毒颗粒,以用于中枢神经系统疾病的基因治疗。方法应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增Shh-N,然后克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pAdTrack-CMV,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdEasy-1进行重组,构建pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,然后转染包装细胞293细胞系。结果成功获得Shh-N片段并构建了缺陷型腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,经限制性酶切后证实该表达载体含Shh-N基因,在293细胞中小规模扩增病毒后,经PCR检测证实病毒颗粒中存在Shh-N基因。结论获得了携带Shh-N的腺病毒颗粒,可将之用于基因修饰神经细胞,进行促细胞存活和定向分化诱导研究,为自身干细胞和外源性细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临床应用提供理论和实验基础。     

腺病毒介导嗜铬瘤细胞中p75神经营养因子的RNA干扰

课题前期研究发现,在急性马尾神经受压模型大鼠中,马尾神经元华勒氏变性和腰骶脊髓前角运动神经元的凋亡及马尾相应阶段脊髓中有p75NTR的高表达存在正向变化关系。本文设想用腺病毒携带shRNA的方式,进行针对p75NTR基因沉默病毒的包装及体外验证重组腺病毒的基因沉默效果。实验按照Reynolds siRNA模板寡核苷酸的设计原则,设计合成3条p75 siRNA模板寡核苷酸片段（shRNA）,随后分别克隆进Shuttle vector 1.0 CMV,与表达加强绿色荧光蛋白的腺病毒载体骨架共转染HEK293细胞成功包装出具有p75shRNA的腺病毒,所得病毒分别命名为Ad.shRNA1、Ad.shRNA2、Ad.shRNA3,重组腺病毒分别感染体外培养的PC12细胞。48h后收集PC12细胞中p75NTRmRNA及总蛋白,发现相对于阴性对照,在mRNA水平,Ad.shRNA1,Ad.shRNA2,Ad.shRNA3组RNA干扰率为分别为（98.49±0.68）％,（95.08±1.79）％,（96.60±1.14）％;在蛋白水平,其RNA干扰率分别为（72.89±2.17）％,（58.83±1.15）％,（59.88±0.44）％。由此得出重组腺病毒成功的抑制了p75NTR的表达,其中以Ad.shRNA1基因沉默效果最为显著。     

慢病毒载体介导的截短肌营养不良蛋白cDNA的表达

目的 探讨慢病毒载体介导的截短肌营养不良蛋白cDNA表达的可行性。方法 将PCR克隆所构建的三个截短的肌营养不良蛋白cDNA插入到慢病毒载体，再将此载体转染至293Ad^3＋细胞中包装为重组病毒。用重组病毒感染培养的鼠成肌细胞，通过蛋白免疫印迹检测鼠成肌细胞中截短肌营养不良蛋白cDNA的表达。结果 用PCR克隆所构建的三个截短肌营养不良蛋白cDNA通过慢病毒载体导入鼠成肌细胞后均可表达出特异产物。结论 慢病毒载体可介导截短肌营养不良蛋白cDNA的表达，截短肌营养不良蛋白cDNA和慢病毒载体分别有望作为基因治疗Duchenne肌营养不良的目的基因和载体。     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建pcDNA3.1( )胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法：将GDNF逆转录聚合酶链 式反应（RT－PCR）产物克隆至pcDNA3.1( ）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以FuGene6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及春表达蛋白折生物学活性。结果：RT－PCR产物为640bp特异性片段,pcDNA3.1( )GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,可见pcDNA3.1( )GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核动物细胞中出具有活性的GDNF蛋白。结论以FuGene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒传染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础。     

硫脂致敏豚鼠血清诱导体外培养的施万细胞凋亡及其机制

目的进一步探讨硫脂在周围神经髓鞘损害过程中的作用机制。方法在植块式体外培养的施万细胞（Ｓｃｈｗａｎｎｃｅｌｓ，ＳＣｓ）培养液中，加１０％硫脂致敏的豚鼠血清１２小时后，利用末端标记程序性细胞死亡检测法和扫描、透射电镜观察凋亡的ＳＣｓ数及ＳＣｓ的形态变化，并通过免疫细胞化学和原位杂交的方法观察ＳＣｓ中凋亡基因Ｆａｓ蛋白及其ｍＲＮＡ的表达。结果加硫脂致敏豚鼠血清后，ＳＣｓ胞浆中Ｆａｓ蛋白及其ｍＲＮＡ的表达较对照组明显增强，凋亡的ＳＣｓ数显著增加，扫描、透射电镜检查显示，部分ＳＣｓ出现凋亡的早期病理改变。结论硫脂致敏豚鼠血清具有诱导体外培养的ＳＣｓ凋亡的作用。