PTEN基因联合奥沙利铂对胆管癌细胞生长抑制的研究

目的探讨脂质体介导PTEN基因转染人胆管癌细胞（QBC939）,联合化疗药物奥沙利铂（L-OHP）,分别进行人胆管癌细胞体外培养和体内接种生长,观察分析该基因对胆管癌细胞生长的抑制情况,探索人类胆管癌的生物治疗的可行性和方法.方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体.转胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性筛选克隆、扩增培养.绘制细胞生长曲线及MTT细胞活性观察;利用免疫组化检测转染前后PTEN阳性表达率;透射电镜扫描观察转染前后及联合奥沙利铂后细胞的超微结构变化;流式细胞分析细胞的周期变化和细胞凋亡情况;体外细胞侵袭力抑制试验;裸鼠体内肿瘤生长,病理学及电镜扫描的观测.结果PTEN基因转染后QBC939细胞稳定表达,阳性表达率升高（P＜0.05）;肿瘤细胞活性下降（P＜0.05）,细胞周期G1～S期抑制,细胞凋亡率增加（P＜0.01）;透射电镜细胞较成熟、分化好;细胞侵袭力明显抑制（P＜0.05）;裸鼠体内肿瘤未转染组生长早,加入奥沙利铂后生长受抑制（P＜0.05）,病理证实为腺癌.结论1.脂质体成功将PTEN基因转染人胆管癌QBC939细胞,并稳定表达.2.PTEN基因转染后细胞生长速度无明显变化;MTT实验活性细胞数有所下降.3.转PTEN基因后的胆管癌细胞超微结构变化显示线粒体增多,细胞较成熟、分化好;流式细胞议分析,细胞周期G1期被抑制,细胞凋亡多,侵袭力受到抑制;4.接种转PTEN基因裸鼠的体内成瘤显著抑制;6.转基因的生物治疗联合奥沙利铂（L-OHP）对人胆管癌细胞生长具有显著的抑制作用.     

谷氨酰胺酶反义基因对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制作用

目的研究反义核酸技术封闭谷氨酰胺酶(GA)基因对裸鼠体内胃癌生长的抑制作用。方法将携带GA反义基因的质粒转染胃癌细胞SGC-7901,并将转染的胃癌细胞接种于裸鼠皮下,观察其在裸鼠体内的生长情况,通过病理学检查和免疫组化方法评价细胞增殖活性的改变;RT-PCR技术检测移植瘤内GA mRNA的含量。结果GA反义基因质粒载体成功转染胃癌细胞后,癌细胞成瘤能力下降,肿瘤生长速度减慢,肿瘤血管生成减少,肿瘤组织GA mRNA的含量减少。结论GA反义基因有效抑制GA基因的表达并抑制胃癌细胞在裸鼠体内的生长。     

逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因对人肝癌细胞体内生长的抑制作用

目的：探讨宿主细胞表达的人血管内皮抑制素（endostatin)对人肝癌细胞在体内生长的影响。方法：利用逆转录病毒载体pLncx,将endostatin基因导入人肝癌细胞SMMC7721内建立转基因肝癌细胞株。应用PCR、免疫组化及Western blot检测人endostatin的转染、表达和分泌。血管内皮细胞增殖试验检测表达的endostatin生物学活性。同时对转染细胞株在体外及在裸鼠体内的生长情况进行观察。结果：PCR证实,转endostatin基因的肝癌细胞 基因组中存在有550bp人特异性endostatin片段,免疫组化及Western blot印迹分析示人endostatin在转染肝癌细胞株中获得稳定表达和分泌。转染细胞表达的endostatin能显著抑制人血管内皮生长,抑制率达48％（P＜0．01）。与对照组相比,转染人endostatin基因的肝癌细胞在体外的生长速度无明显改变,但在接种裸鼠皮下后,肿瘤生长明显受到抑制,在22d时,肿瘤缩小率达94．5％（P＜0．01）。结论：逆转录病毒介导的人endostatin基因疗法对人肝癌SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著抑制作用。     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染和CD/5-FC对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用重组腺病毒介导外源CD基因转移到人直肠癌细胞株HR-8348,通过检测腺病毒的转导效率,CD基因表达,以及集落形成实验,细胞存活率测定,裸鼠移植癌治疗实验,观察分析CD/5-FC对癌细胞的杀伤作用,结果 重组腺病毒介导CD基因转染,在癌细胞中得到高效表达。CD/5-FC系统对转染含CD重组腺病毒HR-8348细胞的集落形成,细胞生长均有明显的抑制作用,而对无CD基因转染癌细胞无影响,在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,CD/5-FC除了杀伤转染CD基因的癌细胞外,对周围的无CD转染癌细胞也有明显的杀伤作用。表现出很强的“旁观者效应”。裸鼠皮下移植癌治疗实验结果表明,CD/5-FC对HR-8348实体癌生长抑制率为71.5%。结论 CD/5-FC对腺病毒介导CD基因转染的直肠癌细胞有很强的杀伤作用和显著的“旁观者效应”。     

肺癌抑癌基因-1对人骨肉瘤细胞株MG63的侵袭和转移抑制效应研究

目的观察肺癌抑癌基因-1（TSLC1）稳定转染至骨肉瘤细胞株后对其侵袭、转移及裸鼠皮下成瘤能力的影响。方法采用稳定表达TSLC1基因的人骨肉瘤细胞株M8T为研究对象,转染空载体的细胞系M8P设为对照组,MG63细胞株为空白组;Transwell法检测三组细胞株的体外侵袭和迁移能力;将细胞制成1×107细胞悬液,于裸鼠尾静脉注射,第4周开始处死裸鼠,肉眼及镜下观察肺部转移灶形成情况,肺组织石蜡包埋切片HE染色检测。将0.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬2×107细胞皮下注射5周龄裸鼠,皮下肿瘤生长情况1周检测1次。结果 M8T细胞株体外侵袭细胞数目为（25.86±2.12）,迁移的细胞数目为（37.55±3.46）;其裸鼠皮下成瘤形成时间：于注射后第4周开始生长,较对照组和空白组细胞株成瘤时间晚,体积显著减小,体内肺转移形成时间为注射后第9周,肺部转移灶发生率为40%。结论 TSLC1基因可明显抑制人骨肉瘤细胞的侵袭和转移及皮下成瘤能力。     

干扰素-α对CCL13/HBx细胞生长及侵袭转移潜能的抑制作用

目的 观察干扰素-α对恶性转化的CCL13/HBx细胞的生长和侵袭转移潜能的抑制效应.方法 采脂质体法将pcDNA3.1-HBx质粒转入CCL13细胞,将CCL13/HBx细胞分别在普通条件下培养或与干扰素-α共培养,采用绘制生长曲线、平板集落形成实验、划痕愈合实验、体外侵袭力、体内裸鼠成瘤实验分别检测CCL13/HBx、INF-α-CCL13/HBx、CCL13/PcDNA3.1细胞在体内、体外的生长及运动迁移能力的差异.结果 pcDNA3.1-HBx质粒转染CCL13细胞后在该细胞中稳定表达,CCL13/HBx细胞生长明显快于INF-α-CCL13/HBx和CCL13/PcDNA3.1细胞,克隆生成率明显增高(31.2%比10.8%比12.4%,P<0.05),划痕愈合能力明显增强,穿过人工基底膜的细胞数明显增多[(41.6±3.1)/HP比(7.4±1.2)/HP比(9.2±1.6)/HP,P<0.05].干扰素-α治疗组CCL13/HBx细胞裸鼠皮下成瘤体积减小[(2.4±0.2)cm3比(4.2±0.3)cm3,P<0.05].结论 CCL13/HBx细胞较CCL13/pcDNA3.1细胞具有更强的生长和侵袭转移潜能,干扰素-α能明显抑制HBx蛋白所诱导的细胞恶性表型.     

槐耳清膏联合氟尿嘧啶抑制肝癌生长转移的实验研究

槐耳清膏的主要活性成分是多糖蛋白（polysaccharide of trametes robiniophila murr，PS—T），能诱导人直肠癌细胞株（HR8348细胞）发生凋亡，对血管内皮细胞体外构建新生血管有抑制作用。但槐耳清膏对肝癌在体内的生长和转移的干预作用尚无报道。本研究利用裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20进行了抑制肿瘤生长和转移的动物实验，现报道如下。     

MBD1 RNA干扰对胰腺癌细胞株BxPC-3生长影响的实验研究

目的 观察阻断MBD1表达后对胰腺癌细胞生长增殖的影响,探讨MBD1在胰腺癌发生发展中的作用.方法 采用RNA干扰技术,构建MBD1-siRNA重组质粒,脂质体介导转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,RT-PCR和Western印迹检测转染前后MBD1 mRNA与蛋白的表达变化,MTT法检测转染前后BxPC-3细胞的生长曲线,将细胞接种于裸鼠,观察转染前后胰腺癌细胞体内移植瘤的生长情况.结果 转染siRNA-MBD1质粒后胰腺癌细胞株BxPC-3 MBD1的mRNA与蛋白表达水平明显降低.MTT法检测细胞的生长曲线,发现转染组较转染空质粒组和未转染组生长明显缓慢(P<0.01);体内实验显示,将转染前后的细胞接种于裸鼠,转染组移植瘤生长速度明显较其他两组减慢(P<0.01),RT-PCR检测移植瘤MBD1mRNA表达的变化,转染组中未能测到明显的MBD1表达.而转染组中CDH1、Rb等抑癌基因mRNA的表达明显高于转染空质粒组和未转染组.结论 通过RNA干扰技术,可在转录和翻译水平降低MBD1在胰腺癌细胞株BxPC-3中的表达,并能抑制肿瘤细胞的生长,但其作用机制尚不清楚,MBD1介导的转录抑制作用可能在胰腺癌的发生发展过程中起到重要的作用.     

生长抑素类似物基因对胰腺癌的治疗作用

目的 利用携带SSTR2基因的重组腺病毒载体Adeno-X-SSTR2转染裸鼠胰腺癌皮下模型，使用SSTR2特异激动剂NC-8-12，观察其在体内实验中是否能取得抑制胰腺癌细胞增殖的效果。方法 构建重组携带SSTR2基因的肿瘤增殖缺陷型腺病毒载体Adeno-X-SSTR2。建立裸鼠胰腺癌皮下模型，分为转染和未转染SSTR2基因的两组，皮下分别给予不同剂量NC-8-12，观察肿瘤体积和重量的变化。结果 在裸鼠皮下模型实验中，NC-8-12对未转染SSTR2基因的胰腺癌细胞无抑制作用（P〉0．05）；在转染了SSTR2基因的胰腺癌细胞中，NC-8—12在每日200μg／kg体重剂量下可以明显抑制肿瘤细胞增殖（P〈0．05）。结论（1）携带SSTR2基因的肿瘤增殖缺陷型腺病毒载体Adenc-X-SSTR2可以高效转染胰腺癌细胞株。（2）一定剂量的NC-8-12（每日200μg/kg体重）对裸鼠体内转染了SSTR2基因的胰腺癌细胞的生长有明显抑制作用。     

谷氨酰胺酶反义基因对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制作用

目的 研究反义核酸技术封闭谷氨酰胺酶（GA）基因对裸鼠体内胃癌生长的抑制作用。方法将携带GA反义基因的质粒转染胃癌细胞SGC-7901，并将转染的胃癌细胞接种于裸鼠皮下，观察其在裸鼠体内的生长情况，通过病理学检查和免疫组化方法评价细胞增殖活性的改变；RT-PCR技术检测移植瘤内GA mRNA的含量。结果GA反义基因质粒载体成功转染胃癌细胞后，癌细胞成瘤能力下降，肿瘤生长速度减慢，肿瘤血管生成减少，肿瘤组织GA mRNA的含量减少。结论GA反义基因有效抑制GA基因的表达并抑制胃癌细胞在裸鼠体内的生长。     

组织因子途径抑制物2基因对Panc-1细胞裸鼠成瘤及转移的影响

目的观察组织因子途径抑制物2（TFPI-2）对胰腺癌细胞系Pane-1细胞裸鼠成瘤及转移的影响。方法将Pane-1-TFPI-2细胞接种到裸鼠皮下作为实验组，观察肿瘤生长情况并测量其大小；取皮下新生肿瘤组织进行原位胰腺接种，观察其对周围组织浸润及远处转移能力的影响。同时以Pane-1-V和Pane-1-P细胞作为对照组。结果实验组和对照组裸鼠皮下均成瘤，但实验组肿瘤体积小于对照组，分别为（438．0±69．8）、（852．0±102．9）和（831．0±78．1）mm’，差异有统计学意义（P〈0．05）。原位胰腺接种，对照组移植瘤浸润胰腺组织，有肝、肺、淋巴结及腹膜转移灶形成，免疫染色显示转移灶CEA阳性，证实其为胰腺肿瘤转移而来。实验组移植瘤包膜完整，无明显浸润及转移现象。结论TFPI-2能抑制肿瘤细胞生长、周围组织浸润及远处转移，为胰腺癌的基因治疗奠定了实验基础。     

转移抑制基因nm23-H1在结直肠癌中的表达及其与临床病理因素的关系

目的 探讨人结直肠癌组织中nm23-H1表达及其与临床病理因素的关系。方法 应用逆转录PCR及免疫组织化学(免疫组化)方法,分别测定30例结直肠癌手术切除标本及癌旁2、5cm组织和远端正常对照组织的nm23-H1 mRNA以及蛋白表达水平,分析nm23-H1与结直肠癌临床病理因素的关系。结果 结直肠癌中nm23-H1 mRNA的低表达与淋巴结转移及Dukes分期明显相关(P<0.05)。nm23-H1蛋白表达水平与结直肠癌中淋巴结转移、分化程度、Dukes分期呈明显的负相关(P<0.05),并同基因转录水平一致。结论 nm23-H1的降表达是结直肠癌转移中的重要的分子生物学事件,检测结直肠癌中nm23-H1的表达情况对评估患者的预后可能具有意义。     

应用活体成像技术监测联合靶向基因治疗肝癌切除术后复发转移的动物实验研究

目的应用活体成像技术监测联合靶向基因治疗防止肝癌切除后肿瘤复发或转移的效果。方法采用荧光素酶基因标记的人原发性肝癌细胞株MHCC97-H制备裸鼠人肝癌切除术后肿瘤复发转移模型。20只裸鼠随机分为对照组、联合基因组;各组于肝断面、腹膜后组织内分别注射等体积的PBS、2种联合基因rAAV/AFP/IL-24。模型制作后10d、肿瘤切除与基因治疗后21d用活体生物发光法检测肿瘤复发转移的情况。结果建立了稳定高表达荧光素酶基因MHCC97-H的人肝癌细胞株。在原位移植模型的活体成像可检测到生物发光信号。活体生物发光成像法观察到肿瘤复发转移情况:对照组检测到较多的光子数,可见明显肿瘤复发转移;联合基因组的光子数明显少于对照组(P0.05),显著降低了肿瘤复发转移率。结论采用活体成像技术比其他示踪技术有较大优势,联合靶向基因rAAV/AFP/IL-24可以明显抑制裸鼠肝癌切除术后复发转移。     

组织因子对大肠癌细胞侵袭及血行转移的影响

目的分析组织因子（TF）表达对人类大肠癌细胞侵袭和血行转移能力的影响。方法利用构建有正义／反义组织因子cDNA（TFcDNA）的质粒pcDNA3．1／Zeo,以脂质体法转染人类大肠癌细胞HT-29细胞及LoVo细胞;转染成功的HT-29细胞及LoVo细胞采用Western Blot检测TF表达水平,通过裸鼠皮下成瘤观察细胞体内侵袭能力的变化;通过建立裸鼠体内肺转移及肝转移模型观察细胞体内血行转移能力的变化。结果转染了正义TFcDNA的HT-29细胞及LoVo细胞的TF表达水平较未转染的HT-29细胞及LoVo细胞升高,转染了反义TFcDNA的HT-29细胞及LoVo细胞的TF表达水平则降低;转染了正义TFcDNA的HT-29细胞的体内侵袭能力较未转染的HT-29细胞增强,转染了反义TFcDNA的HT-29细胞的体内侵袭能力则减弱;转染了正义TFcDNA的LoVo细胞的体内血行转移能力较未转染的LoVo细胞增强,转染了反义TFcDNA的LoVo细胞的体内血行转移能力能力则减弱。结论TF可以促进人类大肠癌细胞的侵袭和血行转移的能力。     

Over expression of inhibitor of caspase 3 activated deoxyribonuclease in human renal cell carcinoma cells enhances their resistance to cytotoxic chemotherapy in vivo.

PURPOSE: We determined whether inhibitor of caspase-3 activated deoxyribonuclease (ICAD) enhances resistance to apoptotic stimuli or inhibits DNA fragmentation by inactivating caspase-3 activated deoxyribonuclease. MATERIALS AND METHODS: The liposome mediated gene transfer method was used to introduce ICAD complementary DNA into ACHN cells and the expression of ICAD protein per clone was evaluated by Western blot analysis. Effects of cisplatin treatment on growth inhibition and apoptosis in the ACHN sublines were assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay, DNA fragmentation assay and Western blot analysis of poly(ADP-ribose) polymerase protein. The limiting dilution assay was also performed to examine the effect of cisplatin treatment under anchorage independent conditions. Furthermore, nude mice bearing the ACHN sublines were given intraperitoneal injection of 5 mg./kg. cisplatin 1 and 2 weeks after the implantation of tumor cells and changes in tumor volume was measured. RESULTS: ICAD transfected ACHN cells inhibited DNA degradation after cisplatin treatment but not control vector only transfected ACHN cells, whereas a similar degree of apoptotic cell death induced by cisplatin in ICAD and control vector only transfected ACHN cells was observed on 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay and Western blot analysis of poly(ADP-ribose) polymerase protein. However, the limiting dilution assay revealed that ICAD transfected ACHN cells had high resistance to pretreatment with cisplatin compared with control vector only transfected ACHN cells. Moreover, although there was no significant difference in the in vivo growth of ACHN sublines, cisplatin treatment induced the elimination of control vector only transfected ACHN cell tumors. In contrast, most ICAD transfected ACHN cell tumors continued to grow after cisplatin treatment. CONCLUSIONS: These findings suggest that when ICAD is over expressed in tumor cells, it renders them highly resistant to therapy induced apoptosis, resulting in enhanced tumor progression.     

前药热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的作用

目的 观察胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的作用.方法 45只裸鼠随机分为3组,分别给予不同的治疗方法,观察各组肝转移率、肝转移瘤数目、病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数,检测肿瘤组织中CD基因的表达情况.结果 对照组、5-FC治疗组、5-FC热疗组平均肝脏转移瘤数和肝脏转移率分别为4.6000±1.2649、2.2000±0.9189、0.5000±0.8498;100%、40%、20%;肿瘤细胞凋亡指数平均为4.59%、9.87%和17.40%,5-FC热疗组可见较多的凋亡小体形成.结论 CD/5-FC系统热化疗对裸鼠转CD基因LoVo细胞结肠癌肝转移有明显的抑制作用.     

重组人生长激素对裸鼠肝癌移植瘤生长转移的实验研究

目的:研究重组人生长激素(recombinant hunman growth hormone,rhGH)对裸鼠肝癌移植瘤生长和转移能力的影响及相关信号转导通路的变化。方法:通过RNA干扰技术抑制MHCC-97H肝癌细胞中胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)的表达。建立裸鼠皮下和原位肝癌移植模型;研究IGF-1R基因沉默前后,rhGH对裸鼠肝癌移植瘤成瘤、生长和转移的影响,并用Western印迹法检测PI-3K信号转导通路中,信号分子AKT的蛋白表达和磷酸化水平。结果:注射rhGH可使荷瘤裸鼠体重明显增加,肝癌原位移植瘤体积显著增大(P0.05)。IGF-1R基因沉默后,裸鼠皮下移植瘤的成瘤率、原位肝癌接种模型中的肝癌移植瘤体积均显著减小(P0.05)。对PI-3K信号通路的研究显示,rhGH能显著促进MHCC-97H肝癌细胞信号分子AKT磷酸化,IGF-1R沉默后AKT磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结论:rhGH在体内具有显著促进荷瘤裸鼠体重增加及移植瘤生长的作用;但并不促进肝癌的转移。IGF-1R基因沉默后,rhGH对裸鼠移植瘤的成瘤和促生长作用明显减弱。而PI-3K信号通路在rhGH促肝癌生长中发挥重要的介导作用。     

RB1抑癌基因对人膀胱癌细胞抑癌作用的研究

采用电穿孔方法将组装于ＤＮＡ质粒载体ｐＣＭＶ－ｎｅｏ的ＲＢ１基因导入该基因功能丧失的膀胱癌细胞系ＨＴＢ９－５６３７。结果表明ＲＢ１抑癌基因对人类膀胱癌细胞具有明显抑癌作用。