人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库的构建和初步筛选

背景与目的 筛选肺癌转移相关基因有助于阐明肺癌侵袭转移的分子机理.为了筛选不同转移潜能肺癌的转移相关差异表达基因,本研究构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库,并对消减文库进行初步筛选.方法 应用抑制消减杂交技术构建人大细胞肺癌高低转移株NL9980与L9981间差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库,利用α互补原理,经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆,应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选.结果 成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选和斑点杂交,正向消减文库获得了307个阳性克隆,反向消减文库获得了78个阳性克隆.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,利用此方法可以成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库.不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中存在可能与转移相关的差异表达基因.     

用cDNA消减杂交法克隆白血病细胞K562分化相关基因

目的：复制hexamethylene bisacetamide(HMBA)诱导白血病细胞K562向巨噬细胞样分化的模型并克隆在这一过程中特异表达的基因。方法：利用cDNA消减杂交的方法构建HMBA诱导K562细胞分化相关基因的cDNA消减文库，挑选部分克隆测序，并用Reverse Dot Blot和Northern Blot证实其差异表达。结果：得到2个在HMBA诱导K562细胞分化过程中表达增强的基因difl3和difl4，以及一些新的EST克隆片段和已知基因，并证实difl3和difl4在K562细胞分化前后有差异表达，其中difl4基因在骨骼肌、肝和肾组织中有强表达。结论：difl3和difl4基因与HMBA诱导K562细胞向巨噬细胞样分化的过程有关，并在细胞基本生命活动中发挥重要作用。     

高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异表达基因的筛选

目的 筛选高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株Hca-F及其同源低转移细胞系Hca-P的cDNA消减杂交文库,筛选阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行同源性比较。结果 成功克隆10个差异基因片段,其中2个为新基因。结论 SSH技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

应用抑制性消减杂交技术克隆人肺鳞癌差异性表达基因

目的 克隆人肺鳞癌肿瘤差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH)构建人肺鳞癌cDNA消减杂交文库，筛选后挑选阳性克隆进行测序，并在Gen Bank数据库中进行同源性比较，最后经RT－PCR验证。结果 成功克隆10个差异基因片段，其中2个为新基因（GenBank登录号分别为：C20：AF363068；C34：AY032661）。结论 抑制性消减杂交技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究

目的:分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因,探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制。方法:采用抑制性消减杂交技术(SSH),构建人胃印戒细胞癌组织cDNA 消减文库;随机挑选部分阳性克隆测序,与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析,并进一步探讨基因功能。结果:成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库,并分离出多个差异表达基因片段:其中1 条与染色体序列相似,可能代表未知的新基因序列,已被GenBank 接收(注册号:CN446913);其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段。结论: 1 )SSH技术是分离差异表达基因的有效方法;2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关;     

肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因的克隆与鉴定

目的：克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因,方法：将肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）作为实验方,肺腺癌细胞（SPC－A－1）作为对照方,应用抑制消减杂交技术,构建实验方特异表达cDNA消减文库;用斑点杂交法初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析（Genbank),对新的cDNA序列进行Northern blot杂交验证。结果：建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交法初步筛选显示23个个克隆中有SPC－A－1／CDDP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片段与已知基因有93％－100％的同源性,Northern blot杂交结果表明2个新的cDNA片断来自SPC－A－1／CDDP细胞。结论：2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交法是克隆特异表达基因的有效方法。     

甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的 :应用抑制性消减杂交技术 ,构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法 :分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA ,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术 ,构建成功cDNA消减文库 ,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果 :构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库 ,文库扩增得到了 4 0 0个克隆 ,随机挑取 5 0个制备质粒 ,酶切分析均得到 5 0～ 4 0 0bp大小插入片段 ,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段 ,结论 :人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

在肝母细胞瘤中筛选XTP6的反式调节基因及其意义

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建XTP6反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选XTP6蛋白反式激活相关基因.方法: 构建XTP6真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6,并将其转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;48h后收获细胞后提取mRNA并逆转录成cDNA,tester cDNA经RsaI酶切消化后分成两组,分别与两种不同接头衔接,再与过量的driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应,第二次PCR产物与pGEM-Teasy克降载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果: 成功构建人XTP6蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库.扩增后得到70个200-1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得11种已知功能编码基因.结论: 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期调节、生物代谢和炎症修复密切相关的蛋白编码基因.     

甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的：应用抑制性消减杂交技术，构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法：分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA，应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术，构建成功cDNA消减文库，再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果：构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库，文库扩增得到了400个克隆，随机挑取50个制备质粒，酶切分析均得到50～400bp大小插入片段，这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段，结论：人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术筛选人肾癌差异表达新基因

背景与目的：认识肾癌差异表达基因有助于阐明肾癌发生,发展的分子机制。但至今有关肾癌差异基因尤其肾癌特异相关基因的研究仍不令人满意,本实验应用抑制消减杂交技术筛选入肾癌组织与正常肾组织间差异表达的新基因,以期克隆出新的肾癌特异相关基因。方法：以肾癌组织mRNA为检测对象（Tester)。正常肾组织mRNA为驱赶者（Driver)。构建cDNA消减文库,随机挑取文库克隆进行酶切及测序,所得结果在GenBank中做同源性比对分析。对感兴趣的片段进行电子定位确定其在染色体的位置,用Northern blot,半定量RT-PCR方法检测新基因在肾癌组织与正常肾组织中的差异表达。结果：文库包含414个阳性克隆;随机挑取280个克隆提取质粒并酶切分析,其中265个有插入片段;将其中80个克隆进行测序,初步显示28、158、170、249号4个克隆为新基因片段,电子定位表明上述4个基因分别位于染色体21q^22,4q^15.3,9q^34,22q^11.2。已在GenBank中登录（BM181083,BI784487,BI863835,BI863386）,对其中28、170号克隆用Northern杂交,半定量RT-PCR检测,证实新基因在肾癌组织中表达较正常肾组织显著增高。结论：抑制消减杂交技术是筛选,克隆肾癌差异表达新基因的有效手段;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长,研究基因功能提供了实验基础。     

正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

应用混合探针文库筛选法克隆多个肿瘤差异表达基因

目的：进一步分离在鼻咽癌组织中表达下调／缺失的候选抑瘤基因。方法：采用PCR方法对有差异表达的cDNA序列（AF152605和AF091517）进行探针标记,Northern杂交确定其mRNA转录本大小,进而混合两种PCR探针对骨骼肌cDNA文库进行筛选,阳性克隆经PCR鉴定后直接测序。结果：克隆了转录本为2．2Kb、1．1Kb和1．4Kb三个基因,GenBank登录号分别为AF179285、AF170307和AF194971。结论：混合探针文库筛选法是同时、快速获得多个cDNA片段其全长序列的可借鉴实验手段。     

Screening and cloning of multi-drug resistant genes in HL-60/MDR cells

ObjectiveTo screen and clone multi-drug resistance (MDR) related genes in MDR acute myeloid leukemia cells (HL-60/MDR).MethodsHL-60/MDR was established using All-Trans Retinoic Acid. With the HL-60 cells as “tester” and HL60/MDR as “driver”, the cDNA library of HL-60/MDR was established by suppression subtractive hybridization. Then 12 of the resulting subtracted cDNA clones were selected for DNA sequencing and homology analysis. The obtained expressed sequence tags (ESTs) were analyzed with the GenBank BLASTN program to identify sequence homologies to known genes.ResultsThe HL-60/MDR cells had different multi-drug resistance to six kinds of chemotherapeutic drugs. The 211 positive gene clones in differential cDNA library of HL-60/MDR cells were amplified with PCR and 46 gene clones exhibited differential expression (ratio >3). Twelve gene clones with significant differential expression (ratio >5) were screened out to homology analysis. Of these, 11 matched known genes and the rest 1 showed no significant homology to human or non-human known sequences. It was named as gene clone HA117.ConclusionsThis effort provides the partial list of genes differential expressed in HL-60/MDR cells and a novel gene HA117 was found to be related to MDR. Identification of these genes contributes to our understanding of MDR development, and potentially provides candidate target genes to overcome MDR.     

人前列腺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的：筛选高低转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4间差异表达基因。方法：应用抑制性消减杂交（SSH）技术,对高转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8及其同源低转移细胞株PC3M-2B4进行2次消减杂交,第1次SSH实验,以PC3M-2B4细胞株为实验方,PC3M-1E8株为驱动方,构建正向消减文库。第2次实验则以PC3M-1E8株为实验方,PC3M-2B4为驱动方,构建反向消减文库。筛选出来的阳性克隆进行测序,并在GeneBank数据库中进行同源性比较后从中选取若干序列进行实时定量PCR验证。结果：2个消减文库共得到238个阳性克隆,从中各随机选取8个克隆测序并进行同源性分析,发现其中12条序列来自于11个已知基因,另外4条序列为新的未知功能的基因序列标签（EST）。结论：成功构建了高低转移力人前列腺癌细胞株的双向消减杂交文库。