靶向IGF-1基因的siRNA抑制胶质瘤生长的体内外实验研究

目的观察靶向IGF-1基因的小干扰RNA（siRNA）在体内和体外对胶质瘤生长的抑制作用。方法采用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹测定干扰后IGF-1的表达水平；采用Transwell体外侵袭试验进行细胞体外的侵袭力分析；用流式细胞仪检测细胞凋亡率；应用裸鼠成瘤实验测定IGF-1基因表达下调后胶质瘤C6细胞在体内致瘤能力的改变。结果靶向IGF-1基因的siRNA可以有效抑制IGF-1基因的表达，使IGF—1 mRNA表达减少50％～80％，蛋白表达减少60％，流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高（P〈0．01），降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论siRNA介导的IGF-1基因下调可明显抑制胶质瘤细胞的生长。IGF-1可以作为胶质瘤基因治疗的一个新的靶点。     

可溶性BTLA真核表达载体的构建及其抗肿瘤作用

目的初步研究确定体内表达可溶性B、T淋巴细胞衰减因子（BTLA）对肿瘤生长的抑制作用，探索新的肿瘤免疫治疗途径。方法采用RT—PCR及重组DNA技术构建可溶性BTLA真核表达质粒，体外细胞转染检测重组质粒的转录表达，小鼠实体瘤模型研究基因转染抑制肿瘤生长的作用。结果用RT—PCR从小鼠脾细胞中扩增出编码BTLA胞外段cDNA，克隆至真核表达载体pcDNA3．1．获得重组表达质粒pBTLA；体外转染BHK细胞可检测到重组质粒的转录表达；肌肉内注射转染质粒pBTLA可明显抑制H22小鼠肿瘤的生长。结论可溶性BTLA能够抑制肿瘤生长．提示B7x-BTLA途径参与肿瘤免疫耐受．封闭此途径有可能成为肿瘤免疫治疗的新靶点。     

sTRAIL真核表达载体的构建及其对裸鼠胶质瘤的治疗作用

目的构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其对裸鼠种植性胶质瘤生长的抑制作用。方法通过PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL。以阳离子脂质体介导转染裸鼠种植性胶质瘤细胞，同时设立未转染、空质粒转染及Lipofectin转染组，检测转染阳性率，并观察该基因载体对种植瘤生长的抑制作用。结果经过测序鉴定和蛋白表达检测证实，重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功。阳离子脂质体介导质粒转染种植瘤瘤细胞阳性率达50％。脂质体PcDNA-sTRAIL转染种植瘤细胞后，相比未转染、空质粒转染及Lipofectin转染组，种植瘤体积、重量增长明显受抑制（均P〈0.05），表现出一定的肿瘤细胞增殖抑制作用。结论本研究成功构建了sTRAIL基因的真核表达载体，并从体外实验中初步证实了其对裸鼠种植性胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。     

PCNA反义寡核苷酸抑制大鼠胶质瘤生长的实验研究

目的探讨增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对大鼠胶质瘤生长的抑制作用。方法所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区接种1．0×10^6胶质瘤细胞。治疗组接种C6胶质瘤细胞后24h内用PCNA反义寡核苷酸原位穿刺注射进行治疗，对照组只注射Hank’s液，每周1次，连续4周；观察两组大鼠肿瘤的一般情况与生存期。4周后断颈处死大鼠，完整地取下肿瘤，测量肿瘤体积，计算其抑瘤率。结果PCNA—ASODN治疗组大鼠胶质瘤的生长明显受到抑制，抑瘤率为64．5％。结论PCNA反义寡核苷酸对胶质瘤的生长具有抑制作用，通过反义技术可抑制靶基因的表达，从而抑制胶质瘤细胞的增殖。     

靶向胰岛素样生长因子受体的RNA干扰技术抑制胶质瘤生长

目的研究靶向胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的小干扰RNA(siRNA)对胶质瘤生长的抑制作用。方法逆转录-聚合酶链反应和W estern b lot测定RNA干扰后IGF-1R表达水平;采用Transwell体外侵袭实验进行细胞体外的侵袭力分析;流式细胞仪检测细胞凋亡率;裸鼠成瘤实验测定IGF-1R基因表达下调后胶质瘤C6细胞在体内致瘤能力的改变。结果靶向IGF-1R基因的siRNA可以有效抑制IGF-1R基因的表达,使IGF-1R mRNA表达减少60%,蛋白表达减少50%;流式细胞术检测到细胞凋亡率明显升高(P<0.01);裸鼠体内成瘤能力降低。结论siRNA介导的IGF-1R基因下调能明显抑制胶质瘤细胞生长。     

TMSG-1基因转染对肿瘤转移表型的影响

目的：研究肿瘤转移抑制基因TMSG-1对肿瘤转移表型的影响。方法：将含TMSG-1全长开放阅读框架的1.5kb cDNA克隆于pcDNA3，构建正义及反义TMSG-1 cDNA真核表达载体，以脂质体转染人肺巨细胞癌PG的高转移亚系BE1，挑选G418抗性克隆，RT-PCR检测正义或反义TMSG-1cDNA在转染细胞中的表达，进行转染细胞体外肿瘤生物学行为检测。结果：RT-PCR显示正义TMSG-1cDNA转染的BE1细胞（BE1-S）中TMSG-1表达明显高于BE1及空载体对照细胞，反义TMSG-1cDNA转染细胞（BE1-AS）中TMSG-1表达低于空载体对照细胞。与BE1及空载体对照细胞（BE1-V）相比，BE1-AS细胞体外生长较快，软琼脂克隆形成能力明显增强；而BE1-S细胞体外生长能力没有显著改变，但其穿越Matrigel的能力及软琼脂克隆形成能力明显减弱。流式细胞仪分析结果显示BE1-S的G0、G1期的细胞较BE1-V细胞比例增多，并且BE1-S出现了细胞凋亡峰。结论：实验结果表明反义TMSG-1基因转染可增强BE1细胞的体外生长、体外侵袭能力及克隆形成能力。而正义TMSG-1基因转染则使BE1细胞的侵袭能力及软琼脂克隆形成能力减弱，而对细胞体外生长能力无明显影响。结论支持TMSG-1是一个肿瘤转移抑制基因。     

靶向胰岛素样生长因子受体的RNA干扰技术抑制胶质瘤生长

目的研究靶向胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的小干扰RNA(siRNA)对胶质瘤生长的抑制作用.方法逆转录-聚合酶链反应和Western blot测定RNA干扰后IGF-1R表达水平;采用Transwell体外侵袭实验进行细胞体外的侵袭力分析;流式细胞仪检测细胞凋亡率;裸鼠成瘤实验测定IGF-1R基因表达下调后胶质瘤C6细胞在体内致瘤能力的改变.结果靶向IGF-1R基因的siRNA可以有效抑制IGF-1R基因的表达,使IGF-1R mRNA表达减少60%,蛋白表达减少50%;流式细胞术检测到细胞凋亡率明显升高(P＜0.01);裸鼠体内成瘤能力降低.结论siRNA介导的IGF-1R基因下调能明显抑制胶质瘤细胞生长.     

旁分泌形式作用的人AngiostatinK(1-3)抑制大鼠C6脑胶质瘤的研究

目的：研究人AK(1-3)[Angiostatin Kringle(1-3)]对大鼠C6脑胶质瘤的抑瘤效应．方法：利用基因转染的方法获得重组人AK(1-3)基因的C6胶质瘤细胞；以细胞增殖试验及免疫组化等方法检测转染细胞株是否表达了具有生物活性的人AK(1-3)．正常大鼠C6脑胶质瘤模型作对照，研究转染细胞株在大鼠脑内的致瘤性．脑组织切片进行Ⅷ因子染色．结果：大鼠C6胶质瘤细胞稳定表达的人AK(1-3)，在体外明显抑制牛主动脉内皮细胞的增殖；在体内明显抑制了大鼠C6脑胶质瘤的生长．试验组脑切片内仅见显微瘤灶，Ⅷ因子染色少见新生毛细血管．结论：旁分泌形式作用于大鼠C6脑胶质瘤内血管内皮细胞的人AK(1-3)可明显抑制肿瘤的血管生成，进而抑制肿瘤的生长和转移。     

反义人血管生成素的真核表达载体的构建及其体外功能的初步研究

目的构建含反义人血管生成素的真核表达载体,并转染人肺癌细胞株A549,使之特异性地封闭A549细胞中血管生成素的表达,以达到抑制肿瘤生长的目的.方法用RT-PCR的方法合成血管生成素的cDNA,将其反向克隆入逆转录病毒质粒载体中,通过PA317细胞包装为假病毒颗粒,体外转染肺癌细胞株A549.结果构建出含反义血管生成素的逆转录病毒载体,感染A549细胞后,能有效抑制A549细胞血管生成素蛋白的表达.结论利用反义血管生成素的逆转录病毒载体能够有效抑制培养细胞血管生成素的表达,为今后的体内应用奠定了基础.     

反义血管内皮生长因子原位表达抑制白血病细胞系K562在裸鼠体内生长并诱导其凋亡

目的观察反义血管内皮生长因子(anti-VEGF)原位表达对白血病细胞系K562在裸鼠体内生长的影响。方法选用白血病细胞系K562裸鼠体内接种成瘤后,肿瘤内注射重组反义VEGF真核表达质粒及空载体和PBS,检测反义VEGF体内转染情况及其对肿瘤生长的影响;免疫组化法比较实验组和对照组移植瘤微血管密度(MVD)及白血病细胞的凋亡情况。结果注射反义VEGF表达质粒能抑制肿瘤的生长,使肿瘤的MVD显著降低(25.6±5.77VS41±3.8,P<0.05),并且使肿瘤细胞凋亡增加。结论肿瘤内注射反义VEGF重组表达质粒在体内能有效转染肿瘤及其周围组织,反义VEGF体内的表达能抑制白血病细胞肿瘤的生长,降低肿瘤内MVD,促进白血病细胞的凋亡。反义VEGF基因治疗策略提供了一种新的白血病辅助治疗方案。     

The effects of antisense PTEN gene transfection on the growth and invasion of glioma cells

Objective:To study the effects of antisense PTEN gene on the growth and invasion of glioma cells. Methods: A pcDNA3. 1/Hygro(-) recombinant plasmid containing antisense PTEN gene fragment was constructed. Glioma cells of primary culture were transfected with antisense PTEN gene vector and stably transfected clones were selected. Then, the different growth and invasion abilities and the different MMP9 mRNA expressions of three kinds of cells were observed, including the transfected cells, untrans-fected cells and the cells transfected with empty vector. Results:The abilities of growth and invasion of the transfected cells and the expressions of MMP9 mRNA were obviously enhanced. Conclusion: Antisense PTEN gene could have a negative impact on the growth and invasion of primary culture glioma cells.     

反义寡聚脱氧核苷酸抑制脑胶质瘤多药耐药基因1的表达

目的研究多药耐药基因1(MDR1)反义寡聚脱氧核苷酸对胶质瘤耐药细胞系C6/adr中MDR1表达的抑制作用.方法以胶质瘤细胞株C6/adr作为胶质瘤体外耐药模型,针对MDR1基因mRNA的AUG起始区-9～ 6序列合成反义和相应的正义寡聚脱氧核苷酸,均经硫代磷酸化修饰.反义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-AS)序列为5'-CTCCATCACCACCTC-3',正义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-S)序列为5'-GAGGTGGTGATGGAG-3'.在脂质体介导下MDR1-AS、MDR1-S转染C6/adr细胞,48 h后利用形态学观察和噻唑蓝快速比色法检测MDR1-AS的细胞毒性作用;半定量RT-PCR检测MDR1-AS处理前后的MDR1 mRNA的差异表达;流式细胞术分析P糖蛋白(P-gp)的阳性细胞率.结果MDR1-AS对C6/adr细胞无毒性作用;MDR1-AS处理后MDR1 mRNA的差异表达由处理前的106%降至30.44%;P-gp阳性表达率亦由处理前的100%降至32.77%.结论MDR1反义寡聚脱氧核苷酸可有效抑制MDR1mRNA及P-gp的表达,从而为基因治疗耐药胶质瘤提供了实验依据,有望开发成为逆转胶质瘤耐药的反义药物.     

反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞生长抑制作用的动态研究

OBJECTIVE: To examine the therapeutic effect of oncogene c-myb antisense oligodeoxynucleotide (AON) on rat C6 glioma in vivo. METHODS: C6 glioma cells were implanted into the subcutis of nude mice, the animals were randomly divided into three groups (12 mice respectively) when the tumor grew about 10 mm in size, and the mice with subcutaneous tumor foci were treated with sense oligodeoxynucleotide (SON), AON and normal saline. Three animals of each group were killed after treatment at 4, 8, 12 and 16 days respectively. The dynamic growth manifestations, features, histopathological changes and apoptosis of the glioma in each group were observed. RESULTS: AON suppressed the growth of C6 glioma cells, the suppression rates being 66.7%, 71.4%, 72% and 73% at 4, 8, 12, 16 days respectively (P < 0.05). The changes in weight were concurrent with the variations of tumor volume, the tumor weight of AON groups was significantly decreased (P < 0.05). The immunohistochemical assay showed the expression of c-myb proto-oncogenes was significantly decreased in AON groups (P < 0.05). The flow cytometry analysis found the apoptosis cell percentage of AON groups to be 13.4%, 27.1%, 46.1% and 48.4% at 4, 8, 12 and 16 days respectively, and this percentage of AON groups was about 3.5 times the apoptosis cell percentage of SON and control groups at the corresponding time. In addition, noticeable inflammatory infiltration and calcification were observed after the treatment with AON. CONCLUSION: The above findings indicate that c-myb gene might be associated with the suppression of carcinogenesis in brain glioma, and oncogene c-myb might be chosen as a target for antisense gene therapy of gliomas.     

反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞生长抑制作用的动态研究

目的　探讨原癌基因 c- m yb反义寡核苷酸 (AON)对 C6脑胶质瘤细胞的体内生长抑制作用。方法　将 C6脑胶质瘤细胞接种于裸鼠皮下 ,当肿瘤长至 10 mm左右时随机分成 3组 (每组 12只 ) ,分别用 c- mybAON、正义寡核苷酸 (SON)和生理盐水瘤区原位注射 ,注药后 4、8、12和 16日各组处死动物 3只 ,动态观察肿瘤的体积、重量及病理学改变 ;用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡 ;以免疫组化方法分析各组的 c- m yb、bcl- 2蛋白阳性表达率。结果　 c- myb AON组的肿瘤体积抑制率分别为第 4天 6 6 .7% ,第 8天 71.4% ,第 12天 72 % ,第 16天73% ,与对照组相比 ,其生长抑制作用具有显著性 (P<0 .0 5 ) ;AON组凋亡细胞百分率为第 4天 3.4% ,第 8天 2 7.1% ,第 12天 46 .1% ,第 16天 48.4% ,是 SON组和对照组相应时段凋亡细胞的 3.5倍以上 (P<0 .0 5 ) ;AON组 c-myb和 bcl- 2蛋白阳性表达率较对照组有显著降低 (P<0 .0 5 ) ;且 AON治疗后的脑胶质瘤中见较多炎性细胞浸润和钙化灶。结论　 c- myb癌基因有可能成为反义基因治疗恶性脑胶质瘤的优选靶点之一     

端粒酶反义基因对恶性胶质瘤细胞生长的作用

目的研究端粒酶RNA的反义寡核苷酸(AODN)抗恶性胶质瘤细胞系的作用。方法采用脂质体包裹AODN转染恶性胶质瘤细胞系U251-MG细胞。用四唑盐MTT法测定细胞生长曲线,用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测细胞的端粒酶活性变化;用流式细胞术检测凋亡细胞。结果2~8μmol/L AODN转染恶性胶质瘤细胞系,培养1~4 d,恶性胶质瘤细胞系端粒酶活性下降,且有剂量依赖性和时间依赖性。AODN转染的恶性胶质瘤细胞培养后细胞增生速度减慢,发生了细胞凋亡。而无义寡核苷酸则无此效应。结论AODN能特异性抑制恶性胶质瘤细胞的端粒酶活性,诱导细胞凋亡。     

苯乙酸对大鼠胶质瘤C6细胞凋亡的影响

目的观察苯乙酸（Phenylacetate,PA）对大鼠胶质瘤C6细胞凋亡的影响。方法建立胶质瘤大鼠动物模型20个,其中治疗组10个给予腹腔注射PA治疗,对照组10个给予生理盐水注射,分别观察至濒死期获取标本,HE染色,TUNEL检测细胞凋亡。结果治疗组大鼠平均生存时间（31.3±3.1）d比对照组平均生存时间（23.4±3.8）d增加,TUNEL检测治疗组细胞凋亡率（27.1±2.6）%比对照组凋亡率（1.8±0.3）%增加。结论在体内PA能够抑制肿瘤生长,诱导胶质瘤C6细胞凋亡。     

脑胶质细胞瘤体内侵袭性的实验研究

目的 探讨胶质瘤的体内侵袭和转移特性。方法 利用体外转染有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的大鼠Ｃ６脑胶质瘤细胞移植模型,将携有增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）基因的pＥＧＦＰ－N３质粒体外转染Ｃ６细胞,筛选能稳定表达ＧＦＰ的瘤细胞克隆,并做流工细胞仪和电镜检测。将阳性转染和未转染瘤细胞以立体定向法植入ＳＤ大鼠脑实质仙,建立大鼠移植瘤模型。４周后处死大鼠并作脑连续石蜡切片,相邻切片分别行苏木素－伊红（ＨＥ）及免疫组织化学染色和荧光显微镜（激发光波长为４８８mm)检测。对移植瘤细胞行原代培养,以检测荧光基因在体内的保存情况。结果 阳性转染的Ｃ６瘤细胞的ＥＧＦＰ在大鼠脑内获得稳定表达,在荧光显微镜下较易于区分肿瘤与非肿瘤区,并能发现侵袭至远处的单个瘤细胞,其敏感性及特异性明显优于ＨＥ染色或免疫组化方法。结论 ＧＦＰ基因体外转染Ｃ6胶质瘤细胞并行大鼠脑内移植,是一种较好的研究脑胶质瘤侵袭性的体内实验模型。     

阳离子脂质体介导的反应c—myb寡核苷酸对脑胶质瘤生长的抑制作用研究

目的：观察阳离子脂质体lipofectAMINE介导的反义c-myb寡核苷酸（LipoAON)对肿瘤生长的影响。方法：取雄性Wistar大鼠48只，行脑内C6胶质瘤接种，术后6天，将携瘤大鼠随机分成LiPoAON组，反义c-myb寡核苷酸组（AON组），阳离子脂质体lipofectAMINE组（Lipo组）和生理盐水对照组（NS组），每组各12只，经大鼠右股静脉给药，间隔1天后，再次用同法经大鼠左股静脉等量给药，给药后严密观察各组大鼠饮食，四肢活动及体重变化情况，并于给药后第4天和第10天每组分别处死6只大鼠，进行肿瘤的生长情况的大体形态学观察。结果：LipoAON组在静脉给药期间及停药后的短期内其肿瘤生长被明显抑制,c-myb表达下调，而AON组，Lipo组与NS组相比，其肿瘤生长未见抑制现象，c-myb表达亦未见下调，但随着停药时间的延长，LipoAON对肿瘤的抑制作用下降，结论：（1）阳离子脂质体LipofectAMINE作为c-myb AON转移载体，使水溶性c-myb AON容易透过BBTB进入瘤内发挥治疗作用，且具有操作简单，安全，转染率高等特点；（2）LipoAON对C6胶质瘤生长有明显抑制作用，用反义技术抑制c-myb的表达在胶质瘤的治疗中具有研究前景，（3）LipoAON对胶质瘤生长的抑制作用随时间延长而下降，如何让c-myb AON在瘤内高效，持久，稳定地表达和发挥治疗作用，是值得进一步探讨的课题。     

血管抑制素治疗脑胶质瘤的实验研究

目的探讨Angiostatin(血管抑制素)抑制血管生成在治疗胶质瘤中的作用.方法应用Angiostatin分别作用于C6胶质瘤细胞系的体外培养细胞和动物肿瘤模型,计算细胞存活率及抑瘤率,SABC免疫组化技术检测体内胶质瘤中的微血管密度.结果Angiostatin不抑制体外培养胶质瘤细胞生长,细胞存活率为100%,对体内生长的胶质瘤则有显著抑制作用且呈剂量依赖关系,抑瘤率可达78.1%(P＜0.01).经Angiostatin处理的胶质瘤中微血管密度较对照组降低(P＜0.01).结论Angiostatin能抑制胶质瘤血管生成,在胶质瘤临床治疗中可能有应用价值.