抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

 【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

IL-6干预对3T3-L1脂肪细胞SAA表达的影响

目的观察IL-6干预对3T3-L1脂肪细胞血清淀粉样蛋白A（SAA）表达的影响。方法用不同浓度IL-6（0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml）处理3T3-L1脂肪细胞24h、10ng/mlIL-6处理不同时间（6h、12h、24h）,用ELISA技术检测各组SAA的表达。结果TNF-a能显著促进3T3-L1脂肪细胞SAA的表达,并呈剂量和时间依赖方式。结论IL-6可以通过促进3T3-L1脂肪细胞SAA的表达和分泌,参与胰岛素抵抗及血管并发症的形成。     

JNK对胰岛素和葡萄糖刺激下脂肪细胞功能的影响

目的:探讨JNK对胰岛素和葡萄糖刺激下脂肪细胞表达脂联素(adiponectin)和抵抗素(resistin)的影响。方法:用不同浓度葡萄糖(5mmol/L,25mmol/L)和胰岛素(0.1nmol/L,100nmol/L)刺激分化成熟的脂肪细胞,各浓度均设立JNK抑制剂组(SP600125),采用荧光定量PCR检测adiponectin和resistin的mRNA表达。结果:高浓度胰岛素和葡萄糖均能使adiponectinmRNA表达降低(P<0.01),resistin表达升高(P<0.01),对应的抑制剂组adiponectin表达较高浓度组增加(P<0.05),resistin表达降低(P<0.05);两个低浓度组与对应抑制剂组及对照组相比均无明显差异。结论:高浓度葡萄糖和胰岛素影响了脂肪细胞脂联素和抵抗素的表达,JNK在其中起到了介导作用。     

LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化中表达量的变化

目的 LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达量的变化及胰岛素对脂肪细胞LRP16蛋白表达的调控。方法经典脂肪细胞诱导方案诱导前脂肪细胞为成熟脂肪细胞,每天（0-8d）均留取蛋白标本。不同浓度（0、1、10、100nmol/L）胰岛素刺激脂肪细胞24h,分别留取蛋白标本。Western-Blot方法检测样本中LRP16蛋白的表达量。结果 LRP16蛋白在前脂肪细胞无表达或极低表达,从诱导的第3、4天开始表达,迅速升至高峰,此后维持在高表达水平。LRP16蛋白在第6-8天之间表达水平无统计学差异（P〉0.05）,其余各时段间表达水平均有显著差异（P〈0.01）。不同浓度胰岛素刺激脂肪细胞24h,细胞中LRP16蛋白表达量与胰岛素浓度呈负相关（P〈0.01）。结论 LRP16蛋白随着前脂肪细胞分化的开启,表达量从无到有逐渐增加至高峰,并一直维持在高表达水平;胰岛素（INS）负调控脂肪细胞LRP16蛋白的表达。     

内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

3T3-L1脂肪细胞诱导分化与肿瘤抑制因子PTEN的表达研究

目的 优化3T3-L1脂肪细胞分化条件,研究信号因子PTEN在分化过程中的表达,以了解PTEN是否通过表达量来调节正常脂肪细胞形成,为探索PTEN的药物靶标作用奠定基础.方法 DMEM高糖培养基培养3T3-L1脂肪前体细胞,地塞米松、3-异丁基1-甲基黄磦呤(IBMX)和胰岛素按2种组合方案分别诱导3T3-L1细胞分化,油红O染色鉴定脂肪细胞,蛋白裂解液提取细胞总蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分化过程中PTEN的表达量,用生物信息学进行小鼠和人类PTEN的同源性分析.结果 1 μmol/L地塞米松、0.5 μmol/L mMX和5 μg/ml胰岛素诱导48 h后,再用含5 μg/ml胰岛素的DMEM高糖营养液培养48 h的方案对3T3-L1细胞诱导分化效果较好,脂肪细胞分化率高且均一,在分化第10天可见90%以上细胞分化为脂肪细胞.PTEN在脂肪细胞分化过程中表达量在第0、4 th、6 th、9 th和第12天时不一致,在12天时明显下降,显著低于诱导前.同源性比对分析表明,小鼠和人类的PTENmRNA编码序列匹配率为96%,而氨基酸序列匹配率为100%.结论 内源性PTEN在小鼠3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化为脂肪细胞的时相过程中表达量有所变化,提示PTEN可能在生理条件下即可发挥提高胰岛素敏感性和促进脂肪细胞形成的作用.     

氯沙坦改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的机制研究

目的探讨氯沙坦改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的主要作用机制。方法以地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞,建立胰岛素抵抗细胞模型,根据细胞模型添加干预药物的不同分为模型对照组（不添加任何药物）、氯沙坦组（分别给予1、10、100μmol/L氯沙坦干预48 h）和wortmannin＋氯沙坦组,wortmannin＋氯沙坦组以100 nmol/L的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）特异性抑制剂wortmannin预处理20 min后再加入100μmol/L氯沙坦干预48 h。观察脂肪细胞体积的变化,采用葡萄糖氧化酶法检测细胞培养上清液中葡萄糖的浓度,采用Western blotting分析脂肪细胞中PI3K和胰岛素受体底物1（IRS-1）的表达以及IRS-1丝氨酸磷酸化水平。结果与模型对照组比较,氯沙坦组脂肪细胞体积明显缩小（P〈0.01）,细胞培养上清液中葡萄糖的浓度显著降低（P〈0.01）,PI3K和IRS-1表达明显上升（P〈0.01）,IRS-1丝氨酸磷酸化水平显著下降（P〈0.01）但可被wortmannin阻断。结论氯沙坦可使3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的细胞体积缩小,并增加细胞对葡萄糖的利用,其机制可能与PI3K信号通路有关。     

Verapamil inhibits 3T3-L1 preadipocyte differentiation

Objective: To investigate the effect of the calcium channel blocker verapamil on adipocyte differentiation and its mechanism of action. Methods: Preadipocytes from 3T3-L1 strain mouse embryos were cultured and differentiated into matured adipocytes in vitro. Verapamil was added to the culture medium in the concentration of 30 μmol/L on Day 0. Cell differentiation was determined by Oil Red O staining and marker gene mRNA expression was evaluated and compared by RT-PCR. The fluo-3/AM probe and laser scanning confocal microscopy were used to measure intracellular calcium concentrations. Results: ①The differentiation rate of 3T3-L1 preadipocytes exposed to verapamil was lower than that of untreated cells. ②Verapamil promoted the retention of pref-1 gene expression. Lipoprotein lipase expression in the verapamil group was significantly lower than that in the control group on Day 4, Day 6 and Day 8 (P < 0.05) and resistin expression was significantly lower than that in the control group on Day 6, Day 8 and Day 10 (P < 0.05). Fatty acid synthase expression in the verapamil group was significantly lower than that in the control group from Day 2 (P < 0.05). ③ Intracellular concentrations of calcium [Ca2+]i in the verapamil group were significantly decreased compared with those in the control group on Day 2, Day 4 and Day 6 (P < 0.05), while there was no obvious difference between the two groups on Day 0 (P > 0.05). Conclusion: In 3T3-L1 preadipocytes verapamil significantly reduced adipocyte differentiation, down-regulated the mRNA expression of three marker genes for adipocytes differentiation, and prolonged the mRNA expression of an inhibitor of differentiation. The inhibitory effect of verapamil on differentiation may involve its role as a blocker of calcium influx in adipocytes.     

熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP表达的影响

目的：观察熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗、摄取及细胞分化的影响,并探讨其作用机制。方法：将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,用高糖、高胰岛素联合诱导胰岛素抵抗模型。使用葡萄糖氧化酶法检测3T3-L1细胞葡萄糖消耗量,氚标葡萄糖法检测其葡萄糖摄取量,以评价模型建立情况。用四唑盐（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测不同浓度熊果酸对3T3-L1脂肪细胞活力的影响以确定实验药物浓度。加入不同浓度熊果酸分组干预,用氚标葡萄糖法检测脂肪细胞葡萄糖摄取量;用油红O色法检测3T3-L1脂肪细胞分化情况;用实时荧光定量聚合酶链反应法、蛋白质印迹法分别观察熊果酸对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型细胞分化相关蛋白脂肪细胞脂类结合蛋白、基质金属蛋白酶1和原癌基因Cbl相关蛋白（c-Cbl-associatedprotein,CAP）表达的影响。结果：在成功建立胰岛素抵抗模型的基础上,使用MTT法检测细胞活力。确定熊果酸的作用浓度在4～20μmol／L。与模型组相比,低、高剂量熊果酸组（10、20μmol／L）及罗格列酮组（5μmol／L．）葡萄糖摄取均明显升高（P〈0．01）;低、高剂量熊果酸组3T3-L1脂肪细胞分化程度低于对照组和罗格列酮组。熊果酸可明显上调3T3-I,1细胞胰岛素抵抗模型CAPmRNA及蛋白的表达（P〈0．01）。结论：熊果酸改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的同时可抑制其分化,这一机制可能与熊果酸上调脂肪细胞CAP的表达有关。     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。
     

甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响

目的探讨甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响。方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,诱导分化成熟后加入含有1nmol／L、10nmol／L、100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素的基础培养基培养24h,并设立基础培养基组为空白对照组,培养24h,RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素mRNA水平。结果100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素均抑制脂联素mRNA的表达中,1000nmol／L胰岛素的抑制作用强于100nmol／L胰岛素。地特胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素及甘精胰岛素。甘精胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素。结论高浓度甘精、地特、人胰岛素均不同程度抑制3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA的表达。     

重组人促红细胞生成素对3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体表达及下游信号通路的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素( rHuEPO)对正常和胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体(EPOR)表达及其下游信号通路的调控作用.方法 以1μmoL/L地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛索抵抗模型(模型组),以分化成熟的正常3T3-L1脂肪细胞作为对照组.采用细胞免疫荧光法和Western blotting法检测细胞EPOR的蛋白表达,采用Real-TimePCR技术检测细胞EPOR mRNA的表达.分别以rHuEPO、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂(LY294002)及信号转导和转录激活因子5( STAT5)抑制剂对模型组和对照组细胞进行干预,采用Western blotting法检测不同药物干预对EPOR蛋白的表达及其下游分子丝(苏)氨酸蛋白激酶( Akt)和STAT5磷酸化水平(p-Akt和p-STAT5蛋白的表达)的影响.结果 与对照组比较,模型组EPOR蛋白和mRNA的表达均显著下调(P＜0.05).干预实验结果显示:与相应对照组或模型组比较,rHuEPO+对照组或模型组EPOR、p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量均显著上调(P＜0.05);与相应rHuEPO+对照组或模型组比较,rHuEPO+LY29400或STAT5阻断剂+对照组或模型组的p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量显著下调(P＜0.05).结论 正常3T3 -L1脂肪细胞上存在EPOR,胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞EPOR蛋白和mRNA的表达下调,rHuEPO可通过EPOR介导激活PDK-Akt和JAK2 -STAT5信号通路.     

吡格列酮对3T3-L1细胞葡萄糖转运蛋白4表达的影响

目的研究噻唑烷二酮类药物吡格列酮对3T3-L1细胞中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRNA和蛋白表达的影响。方法将3T3-L1细胞随机分为3组对照组3T3-L1细胞进行正常的诱导分化,实验1组在3T3-L1细胞诱导时加入吡格列酮(0.1mmol/L),实验2组在诱导分化后成熟的3T3-L1脂肪细胞中加入吡格列酮(0.1mmol/L)。提取细胞总RNA和总蛋白做RT-PCR和Western-blot测定GLUT4mRNA和蛋白的表达情况。结果与对照组比较实验组GLUT4mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。结论吡格列酮促进3T3-L1脂肪细胞GLUT4mRNA和蛋白表达。     

氧化应激对3T3-L1脂肪细胞MCP-1、PAI-1、脂联素表达的影响

目的观察氧化物质第三丁基过氧化氢(t-BHP)对3T3-L1脂肪细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、1型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、脂联素的影响初步探讨氧化应激引发脂肪细胞功能障碍的可能作用机制。方法培养3T3-L1脂肪细胞,将其诱导分化为成熟的脂肪细胞,不同浓度t-BHP(100,200,300,400,500μmol/L)作用10min后继续培养。MTT比色法检测24h时3T3-L1脂肪细胞的存活率;荧光定量PCR检测8h时MCP-1、PAI-1、脂联素的表达,Real-time PCR检测t-BHP(500μmol/L,10min)作用于3T3-L1脂肪细胞后不同时间点(2,4,8,12,24h)MCP-1、PAI-1、脂联素的表达。结果 (1)t-BHP对3T3-L1脂肪细胞的存活状态无明显影响;(2)t-BHP可剂量依赖性的降低脂联素而增加MCP-1、PAI-1mRNA的表达;(3)500μmol/L的t-BHP对脂联素、MCP-1、PAI-1的调节具有时间相关性。结论氧化损伤能够促进MCP-1、PAI-1的表达、抑制脂联素的表达,这是其介导脂肪细胞功能障碍的可能机制之一。     

胰岛素、地塞米松、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对3T3-L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节作用

目的通过细胞培养研究胰岛素样生长因子-1(IGF鄄1)、地塞米松对成熟脂肪细胞水孔蛋白(Aquaporinadipose,AQPap)基因表达的影响,并与胰岛素的作用相比较,以此了解AQPap基因表达的影响因素,探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法用不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)的胰岛素、IGF鄄1(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)及地塞米松刺激液(10-6、10-7、10-8mol/L)刺激诱导分化第9天的3T3鄄L1细胞6h;提取细胞RNA,运用半定量RT鄄PCR技术,检测AQPapmRNA表达量的变化。结果与对照组相比,10-9mol/L胰岛素刺激细胞6h可使AQPap基因表达下降16%,10-6mol/L胰岛素使之下降超过50%。IGF鄄1也降低AQPap的基因表达,但相同浓度(10-7mol/L)刺激下,IGF鄄1的作用要弱于胰岛素(P<0.05)。地塞米松对AQPapmRNA的表达量无明显影响,不过,同时给予10-6mol/L的地塞米松和胰岛素与单用10-6mol/L胰岛素相比,AQPapmRNA的表达量有所上升(P<0.05)。结论胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap的表达起抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。IGF鄄1也有抑制作用,但较胰岛素弱。地塞米松能够拮抗胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap基因表达的下调作用。     

麦冬多糖对脂肪细胞胰岛素敏感性的作用机制

【目的】研究麦冬多糖对3T3-L1细胞诱导分化的脂肪细胞胰岛素敏感性作用机制的研究。【方法】将实验分为5组：模型对照组、阳性对照罗格列酮组、麦冬多糖低、中、高剂量组。体外诱导分化3T3-L1细胞为脂肪细胞,ELISA法检测各实验组3T3-L1脂肪细胞上清液中肿瘤坏死因子-α的表达量;RT-PCR法检测各实验组3T3-L1脂肪细胞瘦素、脂联素、抵抗素mRNA的表达水平。【结果】与模型对照组相比：其他实验组肿瘤坏死因子-α表达量降低,且3T3-L1脂肪细胞肿瘤坏死因子-α表达量随着麦冬多糖剂量的增加而降低;瘦素、脂联素mRNA表达升高,且3T3-L1脂肪细胞瘦素、脂联素mRNA表达随着麦冬多糖剂量的增加而增高;抵抗素mRNA的表达量随着麦冬多糖剂量的增加而降低。【结论】麦冬多糖降糖作用的部分机制可能与促进脂肪细胞高表达瘦素、脂联素而抑制TNF-α、抵抗素的表达而增加胰岛素的敏感性有关。     

小檗碱对脂肪细胞分化的影响

目的 探讨小檗碱对脂肪细胞分化的影响和其机制。方法 培养3T3-L1前脂肪细胞。以四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测3T3-L1前脂肪细胞的增殖,以油红O染色检测3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂肪的堆积,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹技术检测小檗碱对过氧化脂质体增殖激活受体γ2(PPARγ2)mRNA和蛋白质表达的影响。结果 10μmol/L小檗碱使3T3-L1前脂肪细胞的MTT值增加36%(P<0.001),小檗碱处理的脂肪细胞胞浆中,脂肪的堆积明显少于对照组,仅10％～20％的细胞出现较大脂滴。RT-PCR结果显示,在3T3-L1脂肪细胞分化过程中,小檗碱组脂肪细胞的PPARγ2 mRNR较对照组低48％(P<0.01),蛋白质免疫印迹结果也显示小檗碱抑制PPARγ2蛋白质的表达。结论 小檗碱促进前脂肪细胞的增殖,小檗碱减少脂肪细胞分化过程中脂质的堆积、抑制脂肪细胞的分化,可能与其降低PPARγ2mRNA和蛋白质的表达有关,这提示小檗碱在临床上可能适合于治疗肥胖的2型糖尿病患者。