千金藤素抗病毒作用的免疫学机制研究

目的 探索千金藤素体内外的抗病毒作用,并基于抗病毒天然免疫通路探究其抗病毒作用的分子机制。方法 CCK-8 法检测千金藤素（0.062 5～64.000 0 μmol·L^-1）对 A549 细胞活力的影响;利用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-GFP）感染 A549 细胞模型,结合流式细胞术检测千金藤素对病毒复制的影响并探究预处理、吸附过程及吸附后加药对 VSV-GFP 病毒复制的影响;实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测千金藤素对甲型流感病毒（H1N1）、脑心肌炎病毒（EMCV）和单纯疱疹病毒 I 型（HSV-1）复制的影响;构建 VSV 感染小鼠模型探究千金藤素的体内抗病毒作用;A549细胞中利用生物信息学方法探究其抗病毒机制;qRT-PCR 检测药物处理 A549 和原代胚胎成纤维细胞（MEF）后 IFNB1 及干扰素刺激基因 （ISGs） 表达变化;免疫印迹法 （Immunoblotting） 检测人源单核细胞白血病细胞（THP-1）中 TBK1 和STAT1 的磷酸化水平。结果 与模型组相比,千金藤素在 A549 细胞中显著抑制 VSV、H1N1、EMCV 和 HSV-1 复制;千金藤素不影响 VSV 的吸附过程,而预处理或吸附后给药可以显著抑制病毒复制;千金藤素提高 VSV 感染小鼠的存活率;千金藤素激活基于IFN-I通路的抗病毒天然免疫应答。结论 千金藤素通过激活基于IFN-I通路的抗病毒天然免疫发挥体内外抗病毒作用。     

小檗胺的体外抗病毒作用及基于Ⅰ型干扰素通路的机制研究

目的 观察小檗胺的体外抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）通路的抗病毒天然免疫反应探讨其作用机制。方法 CCK-8法检测0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000 μmol·L^-1的小檗胺对A549细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-GFP）以0.05的感染复数（MOI）感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12 h的小檗胺2.5、5.0、10.0 μmol·L^-1对GFP阳性细胞比例的影响;VSV感染A549细胞,Western blotting检测小檗胺对VSV病毒G蛋白表达的影响;小檗胺使用预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10 h 3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-GFP在A549细胞中复制的影响;分别使用甲型流感病毒（H1N1）（MOI＝0.05）,脑心肌炎病毒（EMCV）（MOI＝3）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）（MOI＝1）感染A549细胞,同时给药共同孵育12 h后,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测小檗胺对病毒RNA表达的影响;小檗胺10.0 μmol·L^-1处理A549细胞24 h,进行转录组测序分析;10 μmol·L^-1小檗胺处理MEF细胞12 h后,qRT-PCR法检测Ifnb1、Ifit1、Ifit2、Ifi44基因的mRNA表达;利用IFN刺激性DNA （ISD）转染THP-1细胞,预先激活IFN-I信号通路,4～6 h加入小檗胺5、10 μmol·L-1处理12 h,qRT-PCR法检测IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因的mRNA表达。结果 浓度为10 μmol·L^-1及以下时,小檗胺对A549细胞均未显示出明显的细胞毒性;与模型组相比,小檗胺剂量相关性地减少了VSV-GFP阳性细胞的比例（P＜0.05、0.001）,明显减少了病毒的VSV-G蛋白表达;小檗胺对VSV的吸附过程没有影响,而预处理或吸附后给药可以显著抑制病毒复制;与模型组比较,小檗胺剂量相关性地抑制了H1N1、EMCV和HSV-1的病毒基因表达（P＜0.001）;转录组测序和qRT-PCR结果表明,小檗胺促进细胞基于IFN-I信号通路的抗病毒免疫激活;在ISD刺激后,小檗胺诱导更高水平的IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44 mRNA表达（P＜0.05、0.01、0.001）。结论 小檗胺可能通过促进基于IFN-I通路的抗病毒天然免疫反应抑制多种病毒复制。     

血必净注射液对多种病毒的抑制作用及机制研究

目的 在细胞水平评价血必净注射液（简称血必净）对水疱性口炎病毒（VSV）、甲型流感病毒（H1N1）、Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）等多种病毒复制的影响,并探讨其与免疫系统相关的作用机制。方法 通过CCK-8法检测血必净对A549细胞活力的影响;采用流式细胞术及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测血必净对VSV-eGFP、H1N1、HSV-1复制的影响;利用碘化丙啶（PI）染色检测血必净对病毒引起的细胞死亡的影响;qRT-PCR检测血必净对干扰素（IFN）及干扰素刺激基因（ISGs）mRNA水平的影响,以及其对病毒引起的促炎细胞因子基因表达的影响。结果 血必净以剂量相关方式抑制VSV、H1N1及HSV-1等病毒的复制（P＜0.001）,并显著减少病毒诱发的细胞死亡（P＜0.05）;血必净能有效降低病毒感染诱导的IL1Β、IL6、TNFΑ基因的表达（P＜0.05）,并抑制IFIT1、IFIT2等ISGs的表达（P＜0.05）。结论 血必净能在体外抑制多种病毒的复制,降低病毒诱导的细胞死亡和炎症反应,其抗病毒的机制可能独立于Ⅰ型IFN信号通路。     

异土木香内酯体外抗病毒作用与机制研究

目的 研究异土木香内酯的体外抗病毒作用及机制。方法 CCK-8法检测0.125、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000 μmol·L^-1的异土木香内酯处理24 h对人非小细胞肺癌细胞系（A549）细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-eGFP）以0.02的感染复数（MOI）感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12 h的异土木香内酯5、10、20 μmol·L^-1对GFP阳性细胞率的影响;VSV感染（MOI=0.1） A549细胞,Western blotting检测异土木香内酯处理16 h对VSV病毒G蛋白表达的影响;分别使用甲型流感病毒（H1N1,MOI=0.1）、脑心肌炎病毒（EMCV,MOI=0.1）感染A549细胞,同时给药共同孵育8 h后,实时荧光定量PCR （qRT-PCR）检测土木香内酯对病毒RNA表达的影响;异土木香内酯分别以预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10 h 3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-eGFP在A549细胞中复制的影响;异土木香内酯20 μmol·L^-1处理胚胎成纤维（MEF）细胞12 h,进行转录组测序分析;异土木香内酯5、10、20 μmol·L^-1处理MEF细胞12 h,qRT-PCR检测干扰素α1（Ifna1）、干扰素β1（Ifnb1）、干扰素诱导蛋白44（Ifi44）、干扰素刺激基因15（Isg15）的mRNA表达。结果 异土木香内酯对A549细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为51.01 μmol·L^-1;与模型组比较,流式结果显示异土木香内酯显著减少VSV-eGFP阳性细胞率（P<0.001）,但对病毒的吸附过程没有影响,药物预处理及吸附后给药显著抑制VSV病毒复制（P<0.01、0.001）;qRT-PCR结果显示异土木香内酯显著降低H1N1、EMCV病毒的mRNA水平（P<0.001）;Western blotting结果显示异土木香内酯显著抑制VSV的G蛋白表达（P<0.001）;转录组测序分析和qRT-PCR结果表明,异土木香内酯促进I型干扰素通路的激活,并诱导Ifna1、Ifnb1、Ifi44、Isg15（P<0.001）表达。结论 异土木香内酯通过促进基于干扰素通路的抗病毒天然免疫激活,发挥抑制病毒复制的作用。     

四逆散方中甘草在巨噬细胞中诱导I型干扰素应答的作用与机制研究

目的 在巨噬细胞中确定四逆散中具有I型干扰素（IFN-I）调控作用的中药,并探究其具体作用靶点及主要作用成分。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测四逆散组方药材柴胡、枳实、白芍、甘草水提物对IFN-I通路相关基因表达的影响;通过CCK-8法检测甘草水提物对巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响;qRT-PCR法检测甘草水提物对IFNα2诱导的干扰素诱导基因（ISGs）mRNA表达水平的影响;蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测甘草水提物对IFNα2诱导的JAK1、TYK2、STAT1、STAT2蛋白磷酸化水平的影响;qRT-PCR法检测甘草水提物中单体成分甘草酸、甘草苷、异甘草素、甘草素、18β甘草次酸对IFNα2诱导的ISGs的mRNA表达水平的影响。结果 四逆散组方药材柴胡、枳实、白芍各水提物对IFNα2诱导的Isg15和Ifit1表达水平无显著影响,而甘草水提物显著增加了IFNα2诱导的Isg15和Ifit1的基因表达水平（P＜0.01、0.001）;甘草水提物显著增加了IFNα2诱导的JAK1、TYK2、STAT1、STAT2蛋白磷酸化（P＜0.05、0.01、0.001）;甘草水提物中18β-甘草次酸能够显著增强IFNα2诱导的Isg15和Ifit1的mRNA表达（P＜0.001）。结论 甘草水提物能够显著激活JAK-STAT信号通路并诱导IFN-I下游ISGs的表达,具有较强的固有免疫激活作用。18β-甘草次酸可能是甘草水提物发挥激活IFN-I通路的主要有效成分之一。     

水痘带状疱疹病毒野毒株和疫苗株区分方法研究

目的：建立水痘带状疱疹病毒野毒株和疫苗株的聚合酶链反应和限制性片段多态性（PCRRFLP）区分方法。方法：对疫苗株和水痘临床患者疱疹液进行开放阅读框62（ORF62）区基因序列测定,确定可用于野毒株和疫苗株区分的单核苷酸的多态性（SNP）位点。PCR扩增含SmaⅠ、BssHⅡ和NaeⅠ酶切位点的基因（DNA）片段后进行限制性内切酶酶切,利用酶切图谱区分野毒株和疫苗株。结果：用PCR-RFLP分析疫苗株和疱疹液,疫苗株酶切图谱为SmaⅠ⁺BssHⅡ⁺NaeⅠ⁺,疱疹液酶切图谱为SmaⅠ^-BssHⅡ^-NaeⅠ^-。结论：基于ORF62区的106262（SmaⅠ）、107136（BssHⅡ）、107252（NaeⅠ）的PCR-RFLP可有效区分野毒株和疫苗株。     

防己诺林碱阻断自噬抑制 H1N1病毒感染的研究

目的 探索防己诺林碱在细胞水平抗H1N1病毒的作用,阐明防己诺林碱调控细胞自噬抑制H1N1病毒复制的分子机制。方法 CCK-8法检测0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0、40.000 0、60.000 0 μmol·L^-1的防己诺林碱对MDCK细胞活力的影响;MDCK细胞设置对照组、模型组和防己诺林碱（2.5、5.0、10.0 μmol·L^-1）组,除对照组外,以感染复数（MOI）为0.1的H1N1病毒感染MDCK细胞,加入防己诺林碱共同孵育12 h,同时设置防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）与病毒共同孵育4、8 h组,通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR,检测HIN1 mRNA表达）和Western blotting ［H1N1病毒核蛋白（NP）］检测防己诺林碱对病毒复制的抑制作用;PI/Hoechst 33342染色检测防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）对MDCK细胞死亡的影响;qRT-PCR法检测防己诺林碱检测防己诺林碱预处理、病毒感染早期药物处理、病毒感染晚期药物处理以及吸附和进入阶段给药对病毒复制的影响;MDCK细胞转染EGFP-LC3或EGFP-mCherry-LC3双荧光质粒,观察防己诺林碱对EGFP-LC3的荧光强度、EGFP-mCherry-LC3共定位的影响,设置自噬诱导剂雷帕霉素（0.5 μmol·L^-1）、自噬晚期抑制剂氯喹（10 μmol·L^-1）、巴佛洛霉素A1 （100 nmol·L^-1）对照。转染过EGFP-LC3质粒的MDCK细胞感染H1N1病毒,免疫荧光检测防己诺林碱对LC3与胞内的病毒NP蛋白共定位的影响;体外培养A549细胞,以MOI为0.1的H1N1病毒感染,Western blotting检测防己诺林碱对LC3II/LC3I蛋白表达的影响。结果 防己诺林碱对MDCK细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为40.19 μmol·L^-1 ;与模型组比较,防己诺林碱以浓度相关性的方式抑制HIN1 mRNA表达,以浓度和时间相关性的方式抑制NP蛋白表达（P＜0.01、0.001）;显著减少H1N1诱导的细胞死亡（P＜0.001）;抑制H1N1病毒进入过程。与对照组比较,防己诺林碱处理诱导LC3荧光聚集,诱导EGFP-LC3和mCherry-LC3双荧光共定位显著增加（P＜0.001）。与模型组比较,防己诺林碱处理明显减少NP的荧光数量（P＜0.001）,同时造成LC3荧光积累并与胞内的病毒NP蛋白共定位;引起LC3II积累（P＜0.01、0.001）。结论 防己诺林碱同氯喹和巴佛洛霉素A1一致,阻断自噬途径,使病毒粒子在自噬体内滞留,破坏病毒生命周期。     

EGCG通过p38信号因子诱导IFN-β抗甲型流感病毒感染的研究

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）通过p38信号因子诱导IFN-β抑制甲型流感病毒H1N1复制作用机制。方法 将EGCG作用于人气管上皮细胞（BEAS-2B），通过qRT-PCR和ELISA检测BEAS-2B中IFN-β mRNA和蛋白的表达，Western blotting检测p38和p-p38蛋白表达；使用p38抑制剂抑制p38信号因子的信号传导，检测EGCG作用BEAS-2B细胞诱导的IFN-β蛋白和mRNA表达；用IFN-β抗体中和细胞中IFN-β的产生，通过qRT-PCR和Western blotting检测EGCG作用H1N1后NP蛋白和mRNA的表达。结果 与EGCG（0 μg·mL^-1）相比，随着EGCG剂量增加，IFN-β蛋白和mRNA明显增加。与作用0 h相比，EGCG（20 μg·mL^-1）作用细胞12 h时诱导IFN-β蛋白表达显著（P<0.01）。EGCG可促进BEAS-2B中p38磷酸化；使用p38抑制剂抑制p38信号通路后，EGCG诱导IFN-β mRNA和蛋白表达减少（P<0.01）。与EGCG单独治疗感染H1N1的细胞相比，EGCG和IFN-β抗体共同治疗，可明显升高感染细胞中NP蛋白和mRNA表达水平（P<0.05）。结论 EGCG可通过上调p38信号因子磷酸化水平诱导BEAS-2B产生IFN-β，从而抑制H1N1复制。     

丙种球蛋白联合α1b干扰素治疗儿童EB病毒感染的疗效分析

目的 探讨丙种球蛋白联合α1b干扰素治疗儿童EB病毒感染的效果。方法 选择佛山市南海区妇幼保健院2015年1月-2018年12月收治的80例EB病毒感染患儿,根据随机数字表法,将所有患儿分为观察组（45例）及对照组（45例）,两组患儿均给予抗感染、补液等对症治疗,对照组在对症治疗基础上给予α1b干扰素,观察组在对照组基础上加用丙种球蛋白。对比两组患儿的治疗效果、临床症状改善时间、EB-DNA转阴率、患儿治疗前后的T淋巴细胞亚群水平及治疗过程中不良反应。结果 观察组的总有效率为97.8%,对照组为82.2%,观察组的总有效率显著高于对照组（P<0.05）。观察组的体温下降时间、淋巴结消退时间、咽部体征消失时间、异型淋巴细胞恢复正常时间均显著低于对照组（P<0.05）。治疗后,两组患儿的CD4⁺、CD4⁺/CD8+显著上升,CD8+显著下降（P<0.05）;且观察组改变幅度显著优于对照组（P<0.05）;观察组的EB-DNA转阴率显著高于对照组（P<0.05）。两组治疗过程中不良反应发生情况无统计学差异。结论 与单独应用α1b干扰素相比,丙种球蛋白联合α1b干扰素治疗儿童EB病毒感染安全有效,可缩短患儿临床症状改善时间,提高转阴率及患儿免疫功能。     

重组人干扰素α-1b联合大剂量丙种球蛋白治疗重症手足口病合并病毒性脑炎的疗效

目的 探究重组人干扰素α-1b联合大剂量丙种球蛋白治疗重症手足口病（HFMD）合并病毒性脑炎的临床效果。方法 选取2014年2月至2017年4月宜宾市第二人民医院收治135例HFMD并病毒性脑炎患儿,按随机数字表法分为对照A组（重组人干扰素α-1b）、对照B组（大剂量丙种球蛋白）及观察组（重组人干扰素α-1b+大剂量丙种球蛋白）,各45例。比较三组患儿疗效、治疗后血清胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、S100B、神经特异性烯醇化酶（NSE）水平及血清T细胞亚群水平变化情况。结果 观察组总有效率（93.33%）高于对照A组、B组（73.33%、73.56%）,差异有统计学意义（P<0.05）。治疗后,观察组CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD8⁺改善程度大于对照A、B组,血清IGF-1、IL-6、TNF-α、S100B、NSE改善程度大于对照A、B组,差异均有统计学意义（P<0.05）。三组患儿不良反应发生率比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 重组人干扰素α-1b联合大剂量丙种球蛋白治疗重症HFMD并病毒性脑炎患儿疗效显著,能显著提高患儿免疫功能,减轻机体炎性反应,缓解脑损伤,调节IGF-1水平。