反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5的抑制作用

目的　观察反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞 5型磷酸二酯酶 (PDE5 )的抑制作用 ,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据。　方法　将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸与DOTAP转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞 ,Western印迹法检测转染后不同时间 (1～ 4 8h)海绵体平滑肌细胞内PDE5的浓度变化 ,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内PDE5的作用。　结果　转染后 1～ 6h ,反义组人阴茎海绵体平滑肌原代细胞内PDE5表达量较对照组显著降低 (P=0 .0 0 0～ 0 .0 14 ) ;转染后 12～ 4 8h ,三组细胞内PDE5的表达比较 ,差别无显著性意义 (P =0 .189～0 .96 2 )。　结论　PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5有抑制作用。     

应用RNA干扰技术抑制PDE5A3基因在人阴茎海绵体平滑肌细胞表达

目的应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,探讨应用该技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法构建6个靶向人PDE5A3基因的短发夹RNA(shRNA)重组质粒,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5A3基因的表达抑制效果.结果抑制率最高的1、2、4号重组质粒使PDE5A3基因表达在mRNA水平分别抑制(66.26±4.02)%,(54.90±3.06)%,(23.83±3.61)%;在蛋白质水平分别抑制(64.14±3.32)%,(49.21±2.96)%,(29.85±4.91)%.结论RNAi能明显抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,且抑制率具有序列相关性,是潜在的ED基因治疗新方法.     

靶向人PDE5A3基因的shRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP的影响

目的:观察腺病毒载体介导特异性短发夹RNA(shRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞环磷酸鸟苷(cGMP)的影响,为应用RNA干扰(RNAi)技术治疗阴茎勃起功能障碍(ED)提供实验依据。方法:成功构建携带3条针对人PDE5A3基因位点特异性shRNA的重组腺病毒(rAd5-shRNA-PDE5A3),并设立阴性对照病毒组和空白对照组,分别转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。以放射免疫法分别检测转染重组腺病毒24、48、72h后细胞内cGMP浓度变化,观察rAd5-shRNA-PDE5A3对海绵体平滑肌细胞内cGMP的影响。结果:实验组rAd5-shRNA-PDE5A3转染人阴茎海绵体平滑肌细胞后胞内cGMP水平显著高于阴性对照组和空白对照组,在转染后72h最为显著。结论:3条特异性针对人PDE5A3mRNA靶位点的shRNA可有效地增加海绵体平滑肌细胞内cGMP的水平,增强对PDE5基因的阻抑效果。     

反义N-ras寡脱氧核苷酸对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨N-ras反义寡脱氧核苷酸（ASODN）对前列腺癌细胞增殖的影响。方法：针对N-ras基因转录、翻译起始区分别合成硫代修饰的ASODN，采用^3H-TdR掺入、流式细胞荧光免疫和斑点杂交法检测LNCaP细胞增殖和N-ras基因表达。结果：两种ASODN单独作用后，LNCaP细胞内N-ras mRNA、p21蛋白和PSA表达水平以及^3H-TdR掺入率明显低于对照组，10μmol/L浓度对细胞生长的抑制率分别达63％，51％；二者联合应用后，N-ras基因表达、PSA水平以及^3H-TdR掺入率进一步降低，细胞生长抑制率进一步增高达85％。结论：N-ras ASODN可有效抑制前列腺癌细胞增殖；同时证明N-ras在前列腺癌发生发展中起重要作用。     

PDE5基因siRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP的影响

目的:观察PDE5基因小干扰RNA(siRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞环磷酸鸟苷(cGMP)的影响,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法:使用美国Amb ion公司提供的设计软件设计并合成人PDE5基因的siRNA序列,合成3对PDE5 siRNA和1对阴性对照siRNA,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设定空白转染组为对照组。以酶联免疫法分别检测转染后不同时间(24、48、72、96 h)点海绵体平滑肌细胞内cGMP浓度变化,观察PDE5 siRNA对海绵体平滑肌细胞内cGMP的影响。结果:siRNA1、siRNA2和siRNA3转染后人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平显著高于阴性对照siRNA组和空白对照组(P<0.05),在转染后72 h最为显著,siRNA1、siRNA2、siRNA3、阴性对照siRNA和空白对照组cGMP测定值分别为:5.89±0.19、3.52±0.16、2.88±0.08、0.72±0.12、0.60±0.16 pmol/m l,siRNA1组明显高于siRNA2、siRNA3组(P<0.05)。结论:体外化学合成的PDE5 siRNA能有效地增加海绵体平滑肌细胞内cGMP的水平,不同序列siRNA增加cGMP水平的能力不同,为ED的基因治疗提供了新思路。     

针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2作用的研究

目的探讨针对于胰腺癌K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2的作用。方法用脂质体将针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC-2（反义组）,转染正义寡脱氧核苷酸（正义组）和生理盐水（对照组）,免疫组化和原位杂交检测靶基因表达,人工计数、噻唑蓝（MTT）和集落形成实验检测细胞增殖情况。结果转染48h后,反义组ras蛋白和K-ras基因mRNA的表达强度较正义组和对照组均明显降低（P〈0．05）。人工计数、MTT检测和集落实验均证实反义组细胞增殖受到明显抑制（P〈0．05）。结论针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的胰腺癌细胞,对靶基因表达和细胞增殖有明显的抑制作用。     

反义寡脱氧核苷酸逆转人肝癌多药耐药性的实验研究

目的：探讨坂义寡脱氧核苷酸（ASPODNs)对人肝癌多药耐药基因（MDR）的逆转作用,方法：ASPONs作用于肝癌MDR细胞模型后,用MTT法检测其逆转作用,用逆转录PCR和流式细胞术检测其对4种MDR基因表达的影响,结果：ASPODNs抑制DR基因的表达存在时间－效应和剂量－效应关系,对单基因MDR细胞药性的逆转率为90．26％－100％,对多重MDR细胞耐药性逆转率70．09％－100％,结论：多种ASPODNs联合逆转多重MDR具有可行性并取得明显效果。     

逆转录-聚合酶链反应检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU-87细胞mRNA表达的影响

我们试图通过基因转染技术将针对增殖细胞核抗原 (ＰＣＮＡ)的反义寡脱氧核苷酸转入ＢＩＵ 87细胞 ,与细胞ＰＣＮＡｍＲＮＡ形成ｍＲＮＡ ＲＮＡ杂交链 ,从而降低细胞的增殖水平 ,达到治疗肿瘤的目的。一、材料与方法1 .细胞培养和寡脱氧核苷酸的处理 :人膀胱移行细胞癌细胞株ＢＩＵ 87在含 1 0 %灭活小牛血清和双抗的ＲＰＭＩ1 640培养基 (ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司 )、37℃、5 %ＣＯ2 恒温箱中培养 ,0 .2 5 %胰蛋白酶消化传代。我们采用与ＰＣＮＡｍＲＮＡＡＵＧ端互补的反义寡脱氧核苷酸 (Ａ ＳＯＤＮ)及正义寡脱氧核苷酸 (ＳＯＤＮ) ,序列如…     

靶向人PDESA3基因的shRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP的影响

目的：观察腺病毒载体介导特异性短发夹RNA（shRNA）对人阴茎海绵体平滑肌细胞环磷酸鸟苷（cGMP）的影响,为应用RNA干扰（RNAi）技术治疗阴茎勃起功能障碍（ED）提供实验依据。方法：成功构建携带3条针对人PDESA3基因位点特异性shRNA的重组腺病毒（rAd5-shRNA-PDE5A3）,并设立阴性对照病毒组和空白对照组,分别转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。以放射免疫法分别检测转染重组腺病毒24、48、72h后细胞内cGMP浓度变化,观察rAd5-shRNA-PDE5A3对海绵体平滑肌细胞内cGMP的影响。结果：实验组rA（15-shRNA-PDE5A3转染人阴茎海绵体平滑肌细胞后胞内cGMP水平显著高于阴性对照组和空白对照组,在转染后72h最为显著。结论：3条特异性针对人PDE5A3mRNA靶位点的shRNA可有效地增加海绵体平滑肌细胞内cGMP的水平,增强对PDE5基因的阻抑效果。     

阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及其影响因子的研究进展

阴茎海绵体平滑肌细胞是组成阴茎海绵体的主要功能成分,其表型转化是平滑肌细胞增殖和迁移的关键性起始步骤。因此,探讨平滑肌细胞表型转化的机制及其影响因子在阴茎勃起功能障碍的防治过程中具有重要意义。目前通常将平滑肌细胞分为收缩型(分化型)和合成型(未分化型、增殖型或去分化型)两种类型,并发现L转化生长因子(TGF-β)、转录因子E2F1、基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)、胰岛素等因素可能影响平滑肌细胞表型转化。本文就近年来阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及其影响因子的研究进展作一简要综述。     

成人及家兔阴茎海绵体平滑肌细胞培养和鉴定

目的 :探索阴茎海绵体平滑肌细胞 (CCSM)体外培养及鉴定方法。　方法 :采用勃起功能正常的成年男子及新西兰家兔的新鲜阴茎标本 ,经处理后采用原代细胞培养法 ,对阴茎海绵体组织块进行培养 ,获得CCSM后用光镜、透射电镜和免疫组化等多种方法从细胞形态学及CCSM生长特性等不同侧面对培养的人及新西兰家兔的CCSM进行鉴定 ,并测定CCSM在体外培养时的细胞增殖情况。　结果 :经 2 4h潜伏期 ,体外培养的CCSM进入指数增长期 ,维持约 96h后进入平台期 ;从接种组织块至长成单层细胞约需 15～ 2 0d ,传代后约 4～ 7d后长成单层 ;传代后的细胞增殖旺盛 ,成束状生长 ,并呈现层叠排列及“峰 谷”现象 ;CCSM在体外可稳定传 7～ 12代 ,传代期间其形态及增殖活性变化不明显 ;各种检测鉴定均证实所获细胞为CCSM。　结论 :CCSM原代细胞培养法简便、稳定、可靠 ,对研究阴茎的勃起机制及勃起功能障碍的发生、发展、调控及其治疗药物筛选有重要理论及现实意义。     

钙通道阻滞剂舒张阴茎海绵体平滑肌的研究进展

钙通道广泛存在于心肌、骨骼肌、平滑肌及神经元细胞膜上 ,钙通道阻滞剂因其舒张血管平滑肌而广泛应用于心血管疾病的治疗。本文综述了钙通道阻滞剂舒张阴茎海绵体平滑肌的实验研究的最新进展 ,能否应用于阴茎勃起功能障碍的诊断和治疗尚有待进一步研究和探讨     

小干扰RNA抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接蛋白connexin43的表达

目的:利用小干扰RNA(siRNA)抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接蛋白connexin43(Cx43)的表达和检测细胞间间隙连接通讯功能,探讨该技术在阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接和阴茎勃起功能研究中的应用。方法:利用Ambion公司设计软件,构建靶向人Cx43基因的siRNA重组质粒,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞48h后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹检测Cx43基因和蛋白的相对表达水平、划痕标记荧光染料传输技术检测细胞间间隙通讯功能,并分别与siRNA阴性对照、空白对照组比较。结果:酶切和测序证实siRNA真核表达载体构建成功。siRNA重组质粒转染细胞后的Cx43 mRNA和蛋白相对表达水平分别为(0.45±0.08)%、(0.56±0.06)%,与siRNA阴性对照组(0.72±0.04)%、(0.80±0.08)%和空白对照组(0.74±0.09)%、(0.77±0.11)%相比,差异均有显著性(P(0.05);转染后的细胞间间隙连接通讯功能也显著降低。结论:siRNA能有效抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞Cx43的表达和阻断间隙连接介导的间隙连接通讯功能。     

低氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨低氧和SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)凋亡的关系。方法:体外培养CCSMC,免疫组化鉴定细胞;低氧(1%O2浓度)干预12、24、48、72 h,常规氧浓度作为对照,流式细胞术测定细胞周期变化和凋亡情况。结果:体外培养的CCSMC生长良好,抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化DAB法染色阳性。流式细胞术检测CCSMC G0/G1期在48 h内细胞比例逐渐增加,后下降;S期细胞比例与G0/G1期呈相反趋势;G2/M期细胞比例无明显规律。结论:CCSMC在低氧环境下,随时间的延长凋亡程度加重,48 h达到最大值,进一步延长时间细胞裂解,不能加重凋亡。     

内源性一氧化碳对离体犬阴茎海绵体平滑肌的作用

目的:探讨内源性一氧化碳(CO)对离体犬阴茎海绵体平滑肌作用的影响。方法:利用水浴条件下阴茎海绵体肌条的张力测定技术,用CO合成的关键酶血红素氧合酶(HO)的诱导剂———氯高铁血红素诱导海绵体平滑肌生成内源性CO,观察CO对去氧肾上腺素(PE)诱导收缩的阴茎海绵体肌条作用的影响。结果:氯高铁血红素对10μmol/L PE诱导的肌条收缩具有浓度依赖性的松弛作用,10~100μmol/L氯高铁血红素对平滑肌肌条的松弛效应与空白对照相比明显升高(P<0.01)。用锌原卟啉-Ⅸ(ZnPP-Ⅸ)或亚甲蓝孵育处理后的肌条,氯高铁血红素的舒张作用明显减弱(P<0.01)。结论:内源性CO具有浓度依赖性松弛阴茎海绵体平滑肌的作用,其机制可能是通过CO环磷酸鸟苷途径作用所致。     

睾酮对体外大鼠阴茎海绵体组织细胞增殖的影响

目的:探讨睾酮对雄性SD大鼠阴茎海绵体组织细胞增殖的影响。方法:无菌条件下获取大鼠阴茎海绵体组织,免疫组化法检测其雄激素受体的表达,再分别采用酶消化法培养平滑肌细胞和贴壁法培养成纤维细胞,用四氮唑蓝(MTT)还原法观察对照组及睾酮10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L浓度组对海绵体组织细胞增殖的影响。结果:雄激素受体在大鼠阴茎海绵体组织表达,10-5mol/L睾酮刺激可促进大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞和成纤维细胞增殖,MTT还原法测定分别为68100±2200和70200±1300(P<0.05);10-4mol/L睾酮刺激可抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增殖,MTT法测定A值为分别55000±1400和59100±1500(P<0.01);其他组作用不显著。结论:大鼠阴茎海绵体组织存在雄激素受体,睾酮可经雄激素受体途径对阴茎海绵体组织细胞增殖的产生影响,不同浓度睾酮可促进或抑制海绵体平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖。     

正义Tankyrase转染大鼠海绵体平滑肌细胞的作用研究

目的构建正义Tankyrase真核表达载体,探讨其转染大鼠海绵体平滑肌细胞的作用。方法(1)构建及鉴定正义Tankyrase真核表达载体；(2)正义Tankyrase重组质粒(pcDNA-TNKS)转染大鼠海绵体平滑肌细胞,进行DNA水平、RNA水平鉴定；(3)端粒酶活性的定量检测(TRAP-ELISA法)、端粒长度的检测(Southern blot法)及生长曲线(MTT法)的检测。结果(1)成功构建正义Tankyrase真核表达载体；(2)正义Tankyrase重组质粒成功转染大鼠海绵体平滑肌细胞：(3)TNKS转染细胞(SMC-TANKS)、空载转染细胞(SMC-Zeo)及未转染细胞(SMC)的端粒酶活性无显著性差异(P＞0．05)；(4)SMC-TANKS的端粒长度较SMC-Zeo及SMC长(P＜0．01)(5)SMC-TANKS的光密度(OD)值显著高于SMC-Zeo及SMC(P＜0．01)。结论正义Tanks重组质粒转染有助于改变海绵体平滑肌细胞的端粒长度而延长细胞寿命。     

体外诱导毛囊干细胞成血管平滑肌细胞的实验研究

目的探讨体外诱导人毛囊干细胞成血管平滑肌细胞的可行性。方法采用中性蛋白酶(Dispase)分离人毛囊干细胞,用含10 ng/mL PDGF-BB、10%血清的低糖DMEM诱导液对其进行诱导,无PDGF-BB的培养液为对照组,观察每代细胞形态,诱导4代后检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)与肌钙结合蛋白(Calponin)的表达。结果在诱导液的作用下,细胞形态逐步向平滑肌样转变,对照组细胞形态改变不显著。细胞免疫荧光检测显示,至第4代,实验组已明显表达α-SM actin与Calponin,对照组表达不明显;流式细胞仪检测显示,实验组α-SM actin与Calponin阳性表达率近50%,对照组则低于8%;RT-PCR显示,实验组表达Calponin,而对照组未见明显表达。结论使用含10 ng/mLPDGF-BB的低糖DMEM培养液可体外诱导人毛囊干细胞成血管平滑肌细胞。     

人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒在原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及其作用

目的:观察腺相关病毒载体介导的人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因在原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的表达及其作用,探讨其应用于勃起功能障碍(ED)基因治疗的可行性。方法:原代培养的SD大鼠CCSM细胞随机分为4组:实验组、空病毒组、示踪剂组和对照组,分别以可分泌表达hCGRP重组腺相关病毒VssH-GCMV-hCGRP、空病毒VssHGCMV和表达绿色荧光蛋白(GFP)重组腺相关病毒VssCMV-GFP进行体外转染或不予任何处理。采用斑点印迹试验检测培养液中的hCGRP和放射免疫法检测转染细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)水平,观察hCGRP和示踪剂GFP的表达及其对CCSM细胞的影响。结果:重组腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入大鼠CCSM细胞并稳定表达,与空病毒组和对照组相比,该病毒明显刺激大鼠CCSM细胞中cAMP水平升高[(48.7±1.1)nmol/L对(12.3±1.2)nmol/L和(7.8±1.4)nmol/L,P均<0.01],培养液中可检测到免疫反应性hCGRP。结论:可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在CCSM细胞过表达,并影响该细胞的cAMP水平,可被应用于ED的基因治疗。