免疫器官滋养层对造血基质的影响

本文研究了60Gy照射的胸腺细胞滋养层对小鼠骨髓细胞体外单层培养CFU-F成集落的影响,胸腺滋养层细胞对低密度骨髓细胞(24孔培养板每孔3×10~4个)无成集落刺激作用,而对高密度骨髓细胞(2×10~5个/孔)则有成集落促进作用。添加滋养层细胞密度在10~5～10~6个/cm~2条件下,随着滋养细胞的增多,小鼠骨髓CFU-F成集落数也增加,甚至可达到集落融合生长的程度。本结果为进一步研究造血基质祖细胞、造血免疫器官损伤修复及免疫对造血影响创造了好的方法。     

抗人IgA McAb的鉴定

用人IgA免疫BALB/C小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0-Ag 14融合,测定99个融合孔,抗体阳性者10孔。其中2个经克隆获得代表株39-1,2-9。对后者所分泌的McAb及杂交瘤细胞免疫小鼠的腹水,进行了特异性和纯度鉴定。被动血凝抑制试验证明,2个McAb均可被抗原IgA所抑制,抑制率与抗原量成正比;用含2％PEG-6000的琼脂免疫双扩散试验,39-1McAb和免疫抗原IgA产生一条沉淀线,     

杂交瘤细胞染色体制备及生物学意义初探

目的:改进杂交瘤细胞培养及染色体制备方法。方法:取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0常规融合,用不同的培养基制备杂交瘤细胞,并在制备杂交瘤染色体时改变秋水仙素作用的时间。结果:12孔板中加入DMEM培养液的杂交瘤细胞株生长良好,其中6孔板加秋水仙素培养1h,染色体形态最佳,数目稳定。结论:DMEM培养液更适合此种杂交瘤细胞的培养。制作染色体时缩短秋水仙素培养时间,使得杂交瘤细胞染色体形态更接近于两种亲本细胞。     

不同细胞密度对小鼠心肌微血管内皮细胞小管生成的影响

目的 探讨小鼠心肌微血管内皮细胞的体外小管生成实验的最佳细胞浓度，从而为心脏微血管的研究提供体外实验模型。方法 组织块贴壁法培养小鼠心肌微血管内皮细胞，将小鼠心肌微血管内皮细胞分成5×103个/孔、1×104个/孔、2×104个/孔、3×104个/孔4组，并接种至Matrigel胶包被的48孔板中，细胞接种后24 h在倒置显微镜下观察拍照，并用Image J软件对形成的管腔数量、分支数量进行统计，统计结果用（x-〗±s)表示，数据采用SPSS 17.0软件分析。结果 组织块贴壁法可成功培养小鼠心肌微血管内皮细胞，分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞vWF相关抗原阳性表达。细胞密度为5×103个/孔时无管腔样结构生成，当细胞浓度为1×104个/孔、2×104个/孔、3×104个/孔时可有管腔样结构生成。细胞浓度为2×104个/孔时形成的管腔数量及分支数量高于1×104个/孔、3×104个/孔（P＜0.05）。 结论 分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞具有血管形成能力。在一定的细胞接种浓度范围内，接种的细胞密度越大，体外血管形成能力增强，但细胞浓度超过血管形成的最佳浓度后，随着接种细胞浓度的增大，小鼠心肌微血管内皮细胞的体外血管形成能力减弱。     

融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。     

人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定

目的 建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定. 方法 将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合. 结果 提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A490)是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白.结论 分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合.     

小鼠原代海马神经元培养方法优化及HT22-GRK2-/-细胞构建

目的 探究并优化新生小鼠海马神经元体外原代培养方法；构建小鼠海马神经元HT22细胞中G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因敲除细胞株(HT22-GRK2^-/-)。方法 为优化小鼠原代海马神经元的培养，取新生1～2 d C57BL6/J小鼠海马组织，经胰酶消化后吹打形成细胞悬液，于Neurobasal-A培养基中加细胞培养添加剂维持细胞生长。利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术构建HT22-GRK2^-/-细胞株，并通过免疫荧光染色和Western blot检测GRK2敲除效率。结果 以3×10⁷/孔密度接种的新生小鼠原代海马神经元以无血清培养方式接种于6孔板中，可获得纯度高、活性好的小鼠原代海马神经元细胞；HT22-GRK2^-/-细胞株构建成功。结论 成功建立并优化小鼠海马神经元体外原代培养方法，利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术成功构建HT22-GRK2^-/-细胞株。     

4种品系小鼠角质形成细胞原代培养比较研究

目的 体外分离、培养并鉴定成年小鼠背部皮肤角质形成细胞(KC);对比4种品系小鼠KC的增殖与分化能力。方法 剪取4种品系成年小鼠背部皮肤,剥离皮下脂肪组织,0.25%胰蛋白酶消化获得KC;免疫荧光法鉴定KC;显微镜下观察细胞生长状况;设计不同的种板时间和密度,使用CCK-8法、EdU和高内涵法检测细胞增殖活力;通过Western blot检测4种成年小鼠KC分化情况。结果 对4种品系成年小鼠背部相同面积的皮肤组织进行胰蛋白酶消化,昆明(Kunming, KM)小鼠提取的KC数量最低,C57BL/6提取的细胞数量最多;BALB/c、KM、裸小鼠分别以8×10³个/孔的密度铺板增殖效率较高,C57BL/6以1.6×10⁴个/孔的密度铺板增殖效率较高;4种品系小鼠,BALB/c小鼠原代KC较C57BL/6小鼠原代KC增殖能力弱,分化程度差异无统计学意义。结论 采用简便易行的方法成功分离并比较4种成年小鼠背部皮肤原代KC的增殖和分化能力,为皮肤相关疾病模型小鼠的品系选择提供一定实验依据。     

骨肉瘤与活化B淋巴细胞融合疫苗的抗肿瘤效应

目的　建立骨肉瘤与活化 B淋巴细胞融合的肿瘤疫苗 ,探讨其生物学与抗肿瘤特性 .方法　以 50 0 g· L-1 聚乙二醇为融合剂 ,将 C3 h小鼠来源的 HGRPT基因缺陷型 LM9骨肉瘤细胞与脂多糖活化的小鼠 B淋巴细胞进行融合 .经HAT选择性培养基筛选后 ,再观察该融合瘤株的体内外生长特性 ,对小鼠的致瘤性以及抗肿瘤活性 .结果　该融合瘤株体外生长缓慢 ,对 C3 h小鼠无致瘤性 ,杂交瘤细胞细胞表达B7(70 .6% ) H- 2 Kb (53.4% ) ,融合疫苗保护的小鼠可获 1 0 0 %无瘤生存 (8/ 8)而 LM9和射线照射后的 L M9对照组小鼠全部死亡 (0 / 8) ,皮下接种融合疫苗治疗的荷瘤小鼠可获得80 %无瘤生存 .结论　活化 B淋巴细胞融合骨肉瘤细胞可能改变其生物学特性 ,对小鼠有较好的预防和治疗作用 ,说明了细胞融合方法构建的肿瘤疫苗具有潜在的应用价值     

淋球菌孔蛋白PIB和PIA融合蛋白真核表达载体构建及体内表达

目的克隆淋球菌孔蛋白PIB和PIA基因并构建融合蛋白真核表达质粒pCI-PIB-PIA,了解pCI-PIB-PIA能否被小鼠骨骼肌细胞摄取并表达。方法采用PCR方法从质粒pET-PIB和pET-PIA中获得孔蛋白PIB和PIA全长DNA片段,构建表达融合蛋白PIB和PIA的真核表达载体pCI-PIB-PIA。pCI-PIB-PIA肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ABC法检测pCI-PIB-PIA免疫小鼠肌细胞中PIB-PIA融合蛋白的表达。结果PCR可扩增出预期大小的全长PIB和PIA基因片段。与GenBank报道的PIB和PIA序列比较,重组质粒pCI-PIB-PIA中目的插入片段的核苷酸序列同源性达到99%以上。免疫小鼠的肌细胞能摄取pCI-PIB-PIA并表达PIB-PIA融合蛋白。结论本研究成功地构建了淋球菌孔蛋白PIB和PIA基因重组真核表达载体pCI-PIB-PIA;pCI-PIB-PIA接种小鼠后可见免疫小鼠肌细胞中PIB-PIA融合蛋白的表达,该结果可作为淋球菌多价DNA疫苗的研究基础。     

抗杜氏利什曼原虫单克隆抗体的研究——对新疆株保护性抗体的探索(摘要)

本文报道用杜氏利什曼新疆株前鞭毛体免疫BALB/C小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/O融合,融合率为91.7％。经用ELlSA法检测抗体,获得9个分泌抗体的杂交瘤细胞孔(阳性率为26.5％)。选择其中一个稳定的分泌抗体的B细胞株进行再克隆后,用7个呈单个克隆细胞生长阳性孔获得的腹水作了进一步研究。7个McAbs的特异抗体滴度在1:12,800～1:839,200之间(ELISA),又经间接荧光法证实且进一步筛选发现,其中E_(12)、A_(11) McAbs具有一定保护性功能。     

反义脱氧寡核苷酸对SRS病毒复制的抑制作用

本文研究了合成的反义脱氧寡核苷酸,包括修饰的和非修饰的,同聚的和异聚的脱氧寡核苷酸对小鼠SRS病毒复制的抑制作用。结果表明,所合成的寡聚物都有抑制活性。使用不同的寡核苷酸dC_(14),S-dC_9和18mer(PS),使体外培养的病毒感染细胞增殖的抑制率分别达到39％～96％,26％～97％和24％～90％,并且与寡核苷酸的剂量有关。感染细胞经dC_(14)处理后群落数由38/孔减少至22.5/孔;XC融合细胞数由11/孔减少至0/孔。而非感染的NIH3T3细胞,加和不加寡聚物均为0/孔。研究提示     

两个分泌抗小鼠T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞亚株的建立

用C3H小鼠胸腺细胞免疫的大鼠脾细胞分别与两株小鼠骨髓瘤细胞(8P2/0和NS-1)融合,选择出两个杂交瘤细胞孔连续用有限稀释法进行克隆化,获得了50个亚克隆细胞培养物。对其中两个亚克隆细胞培养上清液的生物学特性作初步分析表明:(1)它能在补体参与下杀伤多种品系小鼠的胸腺细胞(>90％)、淋巴结细胞(约60％)和脾细胞(约30％);(2)用间接荧光法证实它与多种品系小鼠胸腺细     

抗轮状病毒单克隆抗体简报

本研究用牛轮状病毒NCDV株为抗原,免疫2月龄Balb/c雌鼠,二个半月后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP_2/o融合,共融合二次,融合率达100％。平行采用酶联免疫吸附试验和血凝抑制试验两种方法,从192个原始孔中初步筛选出12个阳性孔,其中11个孔为酶联免疫吸附试验阳性、1个孔为血凝抑制阳性。将其中几个孔进行三次有限稀释克隆化,得到3株抗轮状病毒单克隆抗体(2G_2、3F_4、4B_5)。在酶联免疫吸附试验中,2G_2株     

表达bcr-abl基因片段的可移植小鼠细胞系的生物学特性

目的建立稳定表达bcr-abl融合基因的、可移植的小鼠肿瘤细胞系,解决慢性粒细胞白血病疫苗研究的瓶颈问题。方法从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进反转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组反转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行反转录病毒滴度测定,计算病毒效价为2×107CFU/mL。收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击同品系BALB/c小鼠,观察SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的情况。结果经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。SP2/0/bcr-abl细胞能够在同品系小鼠体内形成移植肿瘤。结论该表达bcr-abl融合基因片段的小鼠肿瘤细胞系将作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定物质基础。     

抗人绒毛膜促性腺激素McAb的制备及其特征(简报)

人绒毛膜促性腺激素(hCG)与人促黄体素(hLH),促卵泡素(hFSH)及促甲状腺素(hTSH)的结构近似,因而很难制备出与后三种糖蛋白激素无交叉反应的McAb。我们采用不同的免疫方法以及用不同分子量PEG作为融合剂,将hCG免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/O小鼠骨髓瘤细胞融合。在3次成功的融合中(融合率高于95％),从360个培养孔筛选出抗体阳性孔65个。经连续2～3次克隆化及液氮冻存后的多次再克隆化和传代,获得了12个持续分泌抗hCG McAb的杂交瘤株,并制备了抗体含量高达20～60mg/ml的大量小鼠腹水。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建

目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 6E7mRNA的转录     

抗狂犬病疫苗单克隆抗体的制备和初步鉴定

用狂犬病疫苗为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/O融合,经过培养、克隆、ELISA鉴定,筛出3株分泌抗狂犬病疫苗单克隆抗体细胞株。双扩散结果证明:3株细胞均分泌IgG1。     

抗—HBs单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

给BAlB/C小鼠注射HBsAg,取脾细胞与Sp2/O瘤株融合,经ELISA和PHA方法检测杂交瘤上清获得19个阳性孔。经4次克隆化,建立了2株分泌抗-HBs的杂交瘤。2个月在体外传代6次,液氮中经4次反复冻融仍稳定地分泌抗体。接种BALB/C小鼠腹腔后产生高滴度抗体腹水。 1975年kohler和Milstin首创杂交瘤技术以来,Shih,Wands和郭恒昌先后在国外和国内报道建立分沁抗-HBs的细胞系。我们实验室应用这一技术将亲和层析纯化得到的HBsAg免疫小鼠亦获得2株抗-HBs单克隆抗体,现报告如下;     

条件培养基抑制L-抗坏血酸钠介导的小鼠黑色素瘤细胞凋亡

目的探讨肿瘤细胞B16F10通过自分泌对抗由L-抗坏血酸钠(VitCNa)介导的凋亡作用。方法常规在75 cm~2培养瓶中培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,待细胞长至90%～95%融合时吸取原DMEM/高糖培养液,用PBS反复清洗后加入无血清的DMEM/高糖10ml在培养箱中培养6～8 h,收集培养液用2500 r/min离心5min后上清用0.22μm滤器过滤,-20℃保存备用,在6孔板中每孔接种1×10~6 B16F10,常规培养24h后,实验组每孔加入2ml条件培养液(含有10%胎牛血清),对照组用普通培养液,两组均用10 mmol/L VitC Na促凋亡,分别在3、6、24 h观察细胞凋亡情况,hoechst染核,收集细胞免疫荧光检测caspase3和TUNEL、RT-PCR检测Bcl2表达。进而分离出条件培养液中相对分子质量大于5 000和小于5 000成分,分别煮沸,用蛋白酶K灭活后对B16F10促凋亡。结果发现条件培养基能够抑制VitC Na介导的小鼠黑色素瘤细胞B16F10凋亡,抗凋亡成分小于5 000,且不能被煮沸和蛋白酶K灭活,提示其是小分子抗凋亡物质。结论 B16F10可以分泌出拮抗细胞凋亡的小分子物质。