云南边境地区登革1型病毒非结构蛋白编码区序列测定及进化分析

登革病毒有4个血清型,可引起登革热和登革出血热/登革休克综合征.登革病毒包括5'和3'非编码区(UTR)及一个单一的开放阅读框(ORF),该ORF编码一个聚蛋白前体,经蛋白酶裂解加工成3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1].     

云南边境地区登革1型病毒非结构蛋白编码区序列测定及进化分析

登革病毒有4个血清型,可引起登革热和登革出血热/登革休克综合征.登革病毒包括5'和3'非编码区(UTR)及一个单一的开放阅读框(ORF),该ORF编码一个聚蛋白前体,经蛋白酶裂解加工成3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1].     

云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NS基因进化分析

目的 阐明云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NSl、NS2基因变异特征及遗传进化关系。方法 在云南边境地区采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品,经H5N1亚型特异性多重RT-PCR检测,阳性样品对病毒NS基因进行扩增,克隆Z至pMDl8一T载体测序,获得NSl、NS2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析。结果 自1240份样品中检出H5N]亚型阳性样品71份,阳性率为5．72％;30份代表性阳性样品病毒NS基因测序获得17种序列,存在3个不同进化(亚)分支(I一1、I一2、Ⅱ);NSl／NS2基因与病毒血凝素(HA)基因呈现不同进化关系;NSl蛋白涉及核定位信号区、RNA结合区、效应区及其他致病性相关的关键性氨基酸位点存在替代或突变。结论 云南边境地区H5N1亚型病毒NSl／NS2基因具有遗传差异,2010年以来NS基因进化分支I一2、Ⅱ已成为当地流行的优势毒株。     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫B...     

首次从福建省登革热患者血清中分离登革Ⅰ型病毒

[目的]查明2004年夏秋季福州市部分地区发生疑似登革热暴发流行的病原。[方法]采用C6/36细胞对患者血清标本进行病毒分离,应用免疫荧光、RT-PCR方法进行鉴定。[结果]从27份患者血清标本中分离出16株病毒,经鉴定为登革Ⅰ型病毒。[结论]福州市本次暴发流行由登革Ⅰ型病毒所致,系福建省首次从暴发流行患者血清中分离出登革Ⅰ型病毒,为登革热流行的防治提供科学依据,同时对进一步研究其流行特点和诊断试剂奠定了基础。     

TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革Ⅰ型病毒

目的检测发热患者血清中的登革病毒含量,并判定其型别。方法在登革病毒的E基因区设计一对引物和一条MGB探针,建立TaqMan MGB实时荧光定量PCR体系;从10份疑似登革热患者血清中提取病毒RNA,逆转录成cDNA,采用TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术检测登革病毒及其型别。结果10份血清样本中,有9例出现阳性扩增曲线,病毒含量在103-105拷贝/ml,且扩增产物均出现大约100 bp的扩增带。结论2006年在广州市流行的登革热是由登革Ⅰ型病毒引起,TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革病毒感染具有快速、敏感的特点,为登革热的早期诊断提供了可能。     

登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究

目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因，从分子水平分析流行毒株的生物学特征，追踪传染源，为疾病的预防控制提供实验室依据。方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT—PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸，并用C6／36和BHK-21细胞分离登革病毒。采用RT—PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定，并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸，并分离到登革2型病毒；浙江省登革2型病毒分离株（ZJ／01／04）与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian／10／99株和Saudi／92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97．1％、99．2％和99．6％，而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68．7％、66．9％和63．6％。基因进化树显示ZJ／OI／04分离株与Saudi／92株亲缘关系最近，在进化树的同一分支上。结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起，该毒株最有可能来源于沙特阿拉伯。     

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT—PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株（NGC）全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物，在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列，下游引物中加入Cla Ⅰ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT—PCR法扩增出约11kb基因片段，经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT—PCR技术，获得了登革2型病毒NGC株全长基因组，为进一步构建感染性克隆打下基础。     

纳米磁分离实时荧光PCR定量检测登革2型病毒

目的建立一种登革2型病毒的快速提取和检测的方法。方法根据登革2型病毒的基因保守区,设计一套特异的实时荧光PCR的引物与探针,设计一对引物用于构建定量检测的标准品,以建立登革2型病毒实时荧光定量PCR检测方法;选用纳米磁微粒,建立纳米磁分离提取登革2型病毒RNA的方法,并对其核酸提取效果进行评估。结果纳米磁分离实时荧光PCR方法检测登革2型病毒具有快速、灵敏、特异的特点。在2.9×102~2.9×109copies/μl的范围内循环阀值(C)t值与病毒拷贝数的对数值存在线性关系(R2=0.99)。结论建立的纳米磁分离实时荧光定量PCR方法能够快速准确地检测登革2型病毒,在口岸卫生检疫中具有很好的应用价值。     

2010年郑州肠道病毒71型VP1基因和5'非编码区核酸序列分析

目的 比较不同临床结局EV71毒株的VP1和5' UTR序列,确定2010年郑州EV71的型别.方法 对采集自2010年3～5月的46个手足口病患儿的粪便标本进行处理,然后提取病毒的RNA,获得部分EV71株的VP1和5' UTR核酸序列,用MEGA5对序列信息进行分析.结果 共检测EV71阳性标本30例；其中9个毒株的VP1核酸序列一致率在97.82％以上,氨基酸序列一致率为100％；这9个毒株的5' UTR核酸序列一致率在96.94％以上；经过系统进化分析发现2010年郑州EV71分离株属于C4a亚型；根据EV71 5' UTR核酸序列一型的结果与根据VP1核酸序列分型的结果一致.结论 2010年郑州EV71分离株属于C4a亚型,各毒株间VP1及5’UTR核酸序列的同源性较高；根据EV71 5'UTR核酸序列分型的结果与根据VP1核酸序列分型的结果一致.     

广东省江门地区登革病毒分离株的鉴定及结构蛋白序列分析

目的：对广东省江门地区2001年夏、秋季一批发热、出疹患者进行确诊，并从分子水平分析流行株的可能来源。方法：分别采用免疫荧光、细胞毒力、乳鼠毒力实验以及逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术进行病毒鉴定，并对其结构蛋白基因序列进行克隆、测序及同源性搜索。结果：37份患者血清登革病毒（DV）IgM抗体阳性率为97％（36／37），IgG抗体阳性率为59％（22／37），最高抗体滴度均可达1：640。所得病毒可致C6／36细胞病毒，具有乳鼠神经毒力；其结构基因序列长度为2325bp，编码774个氨基酸；与其他登革2型病毒株TSV01、GD06／93、NGC、44、ThNH、04'GD08/98及S1进行比较，其核酸序列同源性（％）分别为98、96、94、94、92、92、92、91。结论：2001年江门地区登革热流行为登革2型病毒感染所致，推测其可能是输入性传染。     

云南省中缅边境2015年一起登革热暴发的分子特征分析

目的 对2015年云南省中缅边境一起登革热暴发查明病因,对流行的登革病毒(DENV)进行分子特征分析,为疾病防控提供病原学证据。方法 采用半巢式RT-PCR方法检测2015年7月云南省耿马县孟定镇DENV NS1抗原阳性血清中的DENV特异核酸(CprM基因),对阳性标本用DENV E基因特异引物进行扩增,并将PCR产物送测序,经拼接剪切后的序列在NCBI网站进行BLAST比对,在Megalign中计算核苷酸相似性;在GenBank中选出不同国家和地区不同年度的DENV E基因序列作为参考序列,在Mega 5.05 软件中采用邻接(NJ)法构建系统进化树。结果 对25份中国云南省耿马县孟定镇本地病例和14份缅甸输入病例DENV NS1抗原阳性的血清标本进行DENV特异核酸检测,共有21份本地和10份缅甸输入病例标本为DENV-1阳性,其余8份为DENV阴性。测序得到13株(8株来源于本地病例,5株来源于输入病例)1 485 bp的E基因序列,核苷酸相似性为100%,12株(9株来源于本地病例和3株来源于输入病例)406 bp的CprM基因序列,核苷酸相似性为100%。系统进化分析显示,13株E基因序列均属于DENV-1的基因Ⅰ型,位于独立的进化分支。结论 本次登革热暴发由DENV-1的基因Ⅰ型引起,该病毒与相邻缅甸区域流行的DENV进化关系最近,当地需加强对登革热防控的综合措施,以防止登革热疫情的进一步扩散。     

2020年广州市登革热流行状况和病毒E基因进化特征分析

目的:分析2020年广州市登革热流行状况和病毒E基因进化特征,探讨广州市登革热的流行特征和病毒传播特点。方法:通过中国疾病预防控制信息系统传染病报告信息管理系统收集登革热病例信息,采用荧光定量PCR检测血清标本并测定登革病毒E基因序列,运用MEGA 5.05软件构建最大相似度基因树,使用SPSS 20.0软件进行统计学...     

广州市2009年新出现登革3型病毒的分子流行病学分析

目的 对广州市2009年新出现的3型登革病毒(DEN)株的E基因进行RT-PCR扩增和序列测定,探讨其来源及基因型.方法 收集广州市2009年登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离DEN,RT-PCR扩增病毒全长E基因,测序并绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析.结果 2009年采集的19份患者血清标本中,分离到7株3型DEN株,RT-PCR扩增后测序获得E基因序列,7株DEN3病毒E基因均由1479个碱基组成,编码493个氨基酸,基因序列未见插入或缺失,分析发现7株病毒来自两个不同的亚型:09/GZ/1081、09/GZ/1483和09/GZ/10806属于东南亚/南太平洋型,09/GZ/10616、09/GZ/11144、09/GZ/11194和09/GZ/13105属于印度次大陆型,各亚型群内毒株序列同源性较高.结论 广州市2009年DEN3为输入性,分属两个基因型.     

2019年广西7份本地感染登革病毒E基因特征分析

目的 了解2019年广西本地感染登革病毒(Dengue virus,DENV)E基因特性,探索可能的输入来源。方法 采用实时荧光定量PCR（real - time fluorescence quantitative PCR,RT - qPCR）方法对广西本地感染登革热病例急性期血清样本进行病毒核酸检测并分型,扩增登革病毒 E基因后测序,测序结果与不同地区和国家的参考株进行同源性比较和系统进化分析。结果 53份登革热病例血清标本经RT - qPCR分型,结果42份（79.2%,42/53）登革病毒核酸阳性,其中南宁9份、梧州10份、玉林17份、崇左6份,均为DENV - 1型,其余11份为登革病毒核酸阴性,42份DENV - 1型阳性核酸样本经过E基因扩增共得到7份,其中南宁市1份、梧州市1份、玉林市2份、崇左市3份,进化分析结果显示7份样本均为DENV - 1型Genotype Ⅰ基因型,其中DENV1/GXNN/007/2019、DENV1/GXWZ/009/2019、DENV1/GXYL/011/2019、DENV1/GXYL/012/2019与2019年广东株（序列号:MN921500）同源性99.94%～100.00%,DENV1/GXCZ/015/2019、DENV1/GXCZ/016/2019、DENV1/GXCZ/017/2019与 2015年印度尼西亚株（序列号:MG894852）同源性达99.60%,与1945年夏威夷参考株（序列号:AF425619）比较存在12处氨基酸位点变异。结论 2019年广西登革病毒是Genotype Ⅰ基因型,推测病毒从广东和东南亚国家输入导致的本地流行,应加强登革热跨省、跨境传播的防控。     

福建口岸输入登革I型病毒E基因序列分析

目的研究分析福建口岸输入登革I型病毒E基因序列,为登革热诊断的分子溯源提供参考。方法收集2012—2013年福建口岸截获的7例入境Ⅰ型登革热病例资料及血清标本,用C6/36细胞培养分离病毒,提取病毒RNA,用RT-nested-PCR扩增包含E基因全长的核酸片段,扩增产物经纯化、测序,用生物学软件进行DNA序列比对分析。结果用C6/36细胞从7例登革热病例血清中成功分离出7株登革病毒株,经RT-nested-PCR证实均为DENV-Ⅰ型,构建E基因全长进化树分析发现,分离株与新加坡、越南和菲律宾等地的病毒株同源性最高,与病例入境时进行的流行病学调查资料完全吻合。结论从分子水平证明登革热病例血清中分离到的毒株为DENV-Ⅰ型病毒,结合流行病学调查资料,证实均为输入性感染病例,最有可能来源于东南亚一带。     

广州市2010-2019年4型登革热病例流行特征及其病毒E基因

目的  了解2010-2019年广州市4型登革热病例的流行病学特征和4型登革病毒的分子生物学特征。方法  2010-2019年,收集广州市登革热病例相关资料及血清标本,使用RT-PCR法检测血清标本并分型,对4型登革热病例标本进行登革病毒包膜(envelope, E)蛋白基因序列测定,并进行进化树构建及基因重组分析。结果  2010-2019年,广州市共报告43 174例登革热病例,其中23例为4型登革热病例。4型登革热病例仅分布在5个区,曾在2010年出现本地流行。广州市的4型登革热输入病例主要来自东南亚国家,病毒E基因序列与东南亚国家的序列有较高相似性,病毒基因型归属于印度尼西亚基因型和东南亚基因型,未检测到基因重组。结论  应加强对广州市4型登革热病例流行状况和输入病例的监测和关注,并进一步加强对东南亚回国人员登革热常识和个人防护的健康宣传。某些区需要预防出现4型登革病毒的扩散和蔓延。登革病毒基因型转换并未引起登革热在广州市流行强度的变化,有待进一步的观察和研究其是否会发生重组。