消炎痛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察消炎痛(Indomethacin)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、克隆形成率、形态学、生长曲线、流式细胞术分析(FCM).结果 消炎痛明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量.效应关系.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞增殖抑制率依次升高,克隆形成率依次降低(P均<0.01),镜下可见明显的形态学改变.其中,0.5 mmol/L消炎痛组24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为50.6%、47.1%、43.4%;集落形成率为(0.00±0.00)%.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别为110.1、199.3、-614.2 h,与对照组(58.6 h)比较,0.1、0.2 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别延长了2.17倍和3.40倍,而0.5mmol/L消炎痛处理组第6天的细胞均数[(3.4±0.4)×104个]少于初始细胞数(4×104个)结果细胞倍增时间为负值而无法计算.FCM显示,G1期细胞比例随消炎痛浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随消炎痛浓度增加而降低(P均<0.01).结论 在一定条件下,消炎痛可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现.     

内源性大麻素诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡中Caspase-3的作用

目的 检测内源性大麻素(AEA)是否诱导人肝癌高转移细胞株MHCC97H细胞凋亡、以及Caspase-3在细胞凋亡过程中的作用.方法 分别于AEA(100 μmol/L)作用细胞前后,应用Annexin V Binding方法 、流式细胞仪检测细胞凋亡率;荧光活性检测试剂盒检测细胞Caspase-3活性;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 ,检测Caspase-3、bcl-2及bax的mRNA表达.结果 AEA作用细胞3、6、12、24 h,细胞凋亡率分别为(14.13±2.17)%、(27.04±3.21)%、(34.98±7.74)%及(81.35±9.71)%,其中24 h的细胞凋亡率与对照组(12.72±0.44)%比较,差异有统计学意义(P<0.01).AEA作用细胞24 h,细胞的Caspase-3活性由142.0±5.8增加至226.0±6.4(P<0.01);Caspase-3 mRNA的表达由0.24±0.13升高至0.54±0.32(P<0.05);如预先加入Caspase-3抑制剂(Z-VAD-FMK)后再加入AEA,则细胞的Caspase-3活性不再升高90.0±4.3.RT-PCR方法 未检测到bcl-2 mRNA及bax mRNA的表达.结论 AEA对人肝癌高转移细胞MHCC97H具有凋亡诱导作用,Caspase-3参与了凋亡的调控.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨绿脓杆菌制剂(pseudomonas aeruginosa vaccine,PA)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 采用不同浓度的PA分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、生长曲线、克隆形成率、流式细胞术分析(FCM)、侵袭、运动、迁移、VEGF和MMP2蛋白表达(ELISA法).结果 PA明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量-效应关系.PA 48 h和72 h的IC50分别为3.1×108/ml和1. 9×108/ml.PA浓度为0.5×108/ml、1×108/ml和2×108/ml时,其细胞倍增时间依次增加,克隆形成率依次降低(P均＜0.01);FCM显示,G1期细胞比例随PA浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随PA浓度增加而降低(P均＜0.01).PA浓度为1×108/ml时,穿过人工基底膜(侵袭实验)和上室底膜(运动实验)的细胞数(分别为4.8±1.3和8.8±2.2)明显低于对照组(8.6±2.1和15.6±1.2)(P均＜0.01);细胞经72 h培养后,对照组划痕逐渐愈合,1×108/ml的PA组细胞划痕依然明显.ELISA法检测发现,1×108/ml的PA组其VEGF蛋白和MMP2蛋白含量和对照组相比均无明显差异(P均＞0.05).结论 在一定条件下,绿脓杆菌制剂可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现的;绿脓杆菌制剂可以明显抑制MHCC97L细胞的侵袭、运动和迁移能力,其作用和VEGF、MMP2蛋白分泌关系不明显.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.     

人肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞初探

目的 从人肝癌细胞系MHCC97H中分选侧群细胞,探索其形态、表型和功能特征.方法 利用流式细胞仪从MHCC97H中分选得到侧群细胞,用相差显微镜和透射电镜观察其形态学特点;Western blotting观察其ABCG2表达;用流式细胞仪评估侧群细胞与干细胞基因CD133、CD117的关系;用克隆形成实验和NOD/SCID接种实验分别观察侧群细胞体外增殖和体内成瘤情况.结果 侧群细胞体积较小,呈圆形或短梭形;侧群细胞的细胞器如线粒体、内质网等明显少于非侧群细胞;流式检测显示侧群细胞中含有CD133、CD117阳性细胞;Western blotting显示侧群细胞和非侧群细胞中均有ABCG2表达,两者无明显差异;平板克隆形成实验显示SP具有较强的克隆形成能力;体内移植实验显示2000个SP细胞即能在体内形成肿瘤.结论 肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞具有肿瘤干细胞样细胞的表型和特性;ABCG2可能不是决定肝癌侧群细胞表型的主要因素.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.     

骨髓间充质干细胞对人肝癌细胞系MHCC97-H增殖能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSC)对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 人肝癌细胞系MHCC97-H培养液中分别加入0、25%和50%MSC的条件培养基(MSC-CM),采用CyQUANT细胞增殖实验检测吸光度A值变化.在MHCC97-H细胞培养液中添加50%MSC-CM,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67抗原的变化.16只裸鼠皮下接种MHCC97-H细胞后,实验组经静脉注射MSC,1×106个/次,每周3次,对照组静脉注射PBS;比较肿瘤体积.结果 培养液中加入MSC-CM后A值依次为211.65±54.72、236.24±57.15和283.59±62.16(P<0.05).PCNA和Ki-67的表达水平分别升高1.8和7.0倍.实验组肿瘤体积(1745±455)mm3m大于对照组(972±568)mm3(P<0.05),肿瘤体积平均增加速度(56.0±26.1)mm3/d高于对照组(32.4±14.5)mm3/d(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞可促进肝癌细胞系MHCC97-H的增殖.     

线粒体在雷帕霉素诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡中的作用

目的观察雷帕霉素（rapamycin,RAPA）体外对肝癌细胞Bel-7402的生长抑制和诱导凋亡作用,并探讨线粒体在诱导凋亡机理中的作用。方法以5、10、20、30、40和50nmol／L不同浓度的RAPA作用于体外培养的Bel-7402细胞,MTT法检测细胞生长抑制率;应用流式细胞仪检测细胞凋亡;Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡时的形态学变化;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential）的变化。结果RAPA可显著地抑制Bel-7402的生长,诱导细胞发生凋亡,并呈现出明显的量-效与时-效关系,50nmol／LRAPA作用72h,引起的细胞抑制率和凋亡率明显高于其他浓度药物组（P〈0．01）。RAPA作用Bel-7402细胞48h后,在Hoechst33258荧光染色图片上可见细胞核浓缩、细胞核碎裂等典型的细胞凋亡特征。凋亡过程中线粒体膜电位下降。结论RAPA能抑制Bel-7402细胞的生长,诱导细胞凋亡发生,线粒体膜电位下降在凋亡过程中可能起到重要作用。     

MHCC97中肝癌干细胞的分离及其特性

目的 分离肝癌细胞系MHCC97中肝癌干细胞并观察其干细胞特性.方法 利用流式分选法从MHCC97中分离出边缘群(SP)和主群(MP).分别采用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验观察SP和MP细胞体内、外成瘤能力;羟基喜树碱(HCPT)体外诱导,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析其分化潜能.结果 SP细胞克隆形成率为57%,MP细胞仅为13%;1×103SP细胞可成瘤(2/8),MP细胞则需1×105才能成瘤(2/8).诱导3 d后,约15%SP细胞出现双核;诱导后SP细胞甲胎蛋白和r-谷氨酰转肽酶的表达降低,白蛋白表达增强,葡萄糖磷酸酶仅诱导后表达.结论 MHCC97中SP亚群富集具有干细胞特性的癌细胞,即肝癌干细胞.     

内源性大麻素对人肝癌细胞生长及黏附和侵袭性的影响

目的 观察内源性大麻素(AEA)对人肝癌高转移细胞MHCC97H细胞生长、黏附、侵袭性等的抑制作用.方法 不同浓度AEA(100、50、0μmol/L)作用细胞后,应用体外细胞-基质黏附实验方法,检测细胞对Fibronectin黏附能力的改变;应用体外细胞趋化实验和侵袭实验,检测细胞的运动功能及对人工基底膜的侵袭能力;应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制率.结果 (1)不同浓度的AEA(100、50、0 μmol/L)作用细胞3、6、12 h后,细胞黏附抑制率分别为:3 h(24.4%、20.6%和20.8%)、6 h(23.6%、21.3%和19.6%)及12 h(25.2%、24.1%和22.8%),组间及组内比较差异无统计学意义(P＞0.05).(2)100μmol/L的AEA作用细胞48 h后,平均每个视野的透膜细胞数为(13.00±4.30)个,与对照组(15.70±3.30)个比较,差异无统计学意义(P＞0.05);平均每个视野的侵袭细胞数为(4.10±1.65)个,与对照组(3.40±1.24)个比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(3)不同浓度的AEA(100、50、0μmol/L)作用细胞24 h后,细胞生长抑制率分别为(39.30 ±9.17)%、(35.60±8.25)%和(28.70±0.04)%,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AEA对体外生长的人肝癌细胞MHCC97H的生长、黏附和侵袭性等方面无明显抑制作用.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of anandamide (AEA) on proliferation and adhesion and invasion in human hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H. Methods Mmethyl thiazol tetrazolium (MTT) method, cell-matrix adhesion assay, and Transwell invasion chamber and matriger were used to analyze the effect of AEA on proliferation ability, adherence ability, and migration,chemotaxis and invasion of MHCC97H cells, respectively. Results After MHCC97H cells were treated with AEA at the different concentrations (100, 50, 0 μmol/L) for 3, 6 and 12 h, the inhibition ratio of cell adhesion was 24.4%, 20.6% and 20.8% for 3 h, 23.6%, 21.3% and 19.6% for 6 h, and 25.2%, 24.1% and 22. 8% for 12 h, respectively (P＞0.05). After MHCC97H cells were treated with AEA (100 μmol/L) for 24 h, the migration, adhesion and invasion was not markedly inhibited (P＞0. 05 ). Conclusion AEA did not show inhibition effects on adhesion, invasiveness and proliferation of MHCC97H cells.     

DHA对人肝癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制的研究

目的：探讨二十二碳六烯酸（DHA）对人肝癌细胞株Bel-7402增殖和凋亡的影响及其机制。方法：用不同浓度的DHA（0,25,50,100,200 μmol/L）分别作用人肝癌Bel-7402细胞24,48,72 h后,用MTT法检测细胞的增殖情况、Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达,并分别用流式细胞仪、real-time PCR和caspase-3活性检测试剂盒检测上述梯度浓度的DHA作用 Bel-7402细胞48 h后的凋亡情况、Bim基因表达和caspase-3活性。结果：不同浓度、不同时间DHA作用后,Bel-7402细胞增殖明显抑制,呈浓度和时间依赖性（均P<0.05）;细胞Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达降低,呈明显浓度依赖性（均P<0.05）,但无明显时间依赖性（均P>0.05）。不同浓度DHA作用48 h后,Bel-7402细胞凋亡率、Bim基因表达和caspase-3的活性均明显增加,且均呈浓度依赖性（均P<0.05）。结论：DHA可抑制人肝癌Bel-7402细胞的增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与激活线粒体凋亡通路有关。     

加热联合吲哚美辛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 观察水浴加热联合吲哚美辛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 42℃水浴加热前2h加入0.2 mmol/L吲哚美辛,加热组不加药,对照组不加热、不加药,其他处理相同并在同一时间点观察.在不同的时间观察细胞增殖、生长曲线、克隆形成率、流式细胞术(FCM)分析细胞周期、侵袭、运动、血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白表达[酶联免疫吸附试验(ELISA)法].结果 与对照组比较,加热+吲哚美辛明显抑制MHCC97L细胞增殖(P＜0.01),其最大抑制效应为加热后48 h(53.6％),细胞倍增时间延长了2.07倍;加热+吲哚美辛组48、96 h的细胞集落形成率均明显降低(P ＜0.01);FCM显示,吲哚美辛能逆转加热对细胞周期的影响,加热+吲哚美辛组48 h和96 h的G1期细胞比例均明显升高,S+G2期细胞比例均明显降低(P＜0.05).加热+吲哚美辛组48 h和96 h相同数量的细胞穿过人工基底膜到达Transwell小室膜背面的细胞平均数(侵袭实验)和穿过Transwell小室膜到达背面的MHCC97L细胞平均数(运动实验)均明显低于加热组(P＜0.01);ELISA法检测发现,加热+吲哚美辛组48、96 h的分泌量均明显低于加热组(P＜0.05).结论 吲哚美辛抑制体外加热后肝癌细胞的增殖,其作用和抑制细胞进入DNA合成期和分裂期有关;进一步抑制其侵袭运动能力,其作用和MMP-2、VEGF表达降低有关.     

FAK的阻断对MHCC97肝癌细胞侵袭性的影响

目的 通过对MHCC97肝癌细胞株的FAK基因的表达进行干预，观察MHCC97肝癌细胞侵袭转移能力的变化。方法 用Oligofec TAMINE介导的方法，将反义FAK ODN引入MHCC97肝癌细胞株，或用Genistein抑制MHCC97肝癌细胞FAK磷酸化方法，观察经过不同干预后的MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的活力变化，比较MHCC97肝癌细胞转染反义FAK ODN前后和用Genistein抑制磷酸化前后，细胞侵袭转移能力的变化。结果 反义FAK ODN转染的肝癌细胞和用Genistein干预的肝癌细胞穿过Matrigel胶的能力减弱。结论抑制FAK的表达能影响肝癌细胞的侵袭转移能力。     

微小RNA-101通过USP22抑制人肝癌MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能

目的 研究微小核糖核酸（miR）-101对人肝细胞癌（肝癌）MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能的影响及其相关机制。 方法 MHCC97H肝癌细胞株分别转染miR-101 mimics和negative control mimic,分别作为M101组、NCM组,并设立未转染对照（control）组,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组细胞miR-101含量。Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力。Western-blot法检测3组细胞vimentin、α-catenin、E-cadherin和USP22表达水平。双荧光素酶实验检测miR-101与USP22的关系。 结果 M101组miR-101的表达水平明显上调,表达水平约为control组的761倍（P < 0.05）。M101组迁移细胞数量明显低于control组的[（15.7±1.6）个比（94.1±1.8）个,P < 0.05]。M101组侵袭细胞数量明显低于control组的[（9.1±0.4）个比（51.6±0.9）个,P < 0.05]。M101组细胞vimentin蛋白表达量明显降低,α-catenin及E-cadherin蛋白表达量明显升高,USP22蛋白表达量明显降低。双荧光素酶检验结果显示USP22为miR-101的下游靶基因。 结论 miR-101可能通过降低下游靶基因USP22水平影响EMT相关蛋白表达,抑制MHCC97H肝癌细胞的上皮-间质转化功能。     

miR-1470对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨miR-1470对人肝细胞癌增殖和凋亡的影响。 方法 采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）检测人正常肝细胞株（LO2）和人肝癌细胞株（HepG2、Hep3B、Huh7）中miR-1470的差异表达;采用慢病毒转染肝癌细胞株,过表达（HepG2细胞株,过表达组）或敲减miR-1470（Huh7细胞株,抑制组）后,qPCR检测各组细胞miR-1470的表达;CCK8法检测细胞增殖改变;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 miR-1470在肝癌细胞系HepG2、Hep3B和Huh7中的表达水平高于正常肝细 胞系LO2,HepG2、Hep3B、Huh7三种细胞系相对正常细胞表达量分别为：2.304±0.366、2.851±0.508、 5.768±0.445（均P＜0.05）。CCK8实验证实,过表达miR-1470组OD值在72 h显著高于对照组（P＜0.05）,而抑制组显著低于对照组（P＜0.05）。流式细胞分析结果显示过表达miR-1470抑制肝癌细胞的凋亡（P＜0.05）;而miR-1470抑制组对比对照组,凋亡细胞显著增多（P＜0.05）。结论 miR-1470促进肝癌细胞增殖,抑制肝癌细胞凋亡。