人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞增殖及其调控因子的影响

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６／Ｅ７基因对人角质形成细胞增殖及细胞周期调控因子ｐ５３,ｐＲｂ的影响。方法 Ｌｏｐｏｆｅｔａｍｉｎｅ介导法进行 染,筛选阳性克隆,免疫荧光染色检测ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染细胞内的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化,免疫印迹分析ｐ５３,ｐＲｂ表达情况。结果 免疫荧光染色检测见转染细胞内有ＨＰＶＥ６／Ｅ７表达,汉式细胞仪显示转染细胞Ｇ１期细胞为４９．２％比正常     

宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：进行人乳头瘤病毒１６型相关肿瘤的Ｅ６血清学研究。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从宫颈癌组织ＤＮＡ中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６基因片段,克隆至测序质粒ｐＧＥＭ－Ｔ中,并用限制性内切酶将ＨＰＶ１６Ｅ６基因切下,克隆至表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经ＩＰＴＧ诱导表达为融合蛋白,分子量约４５ＫＤ。结果：融合蛋白占菌体总蛋白的２５％,免疫印迹检测表明ＨＰＶ１６Ｅ６融合蛋白能被抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体识别。结论：     

HPV16L1—E7重组腺病毒rAd5HPV16L1—E7的构建及克隆表达

目的：研制人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１－Ｅ７重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法：以ＨＰＶ１６型－１１４／Ｋ为模板,利用ＰＣＲ克隆技术构建可表达ＨＰＶ１６主要宙蛋白Ｌ１（１－３０１ａａ）和转蛋白Ｅ７（１－６０ａａ）融合基因的重组质粒ｐＵＣ１９Ｌ１－ｐＨＢＧ１０共转染２９３细胞,制备重组腺病毒ｒＡｄ５ＨＰＶ１５６Ｌ１－Ｅ７,密度梯度超速离心纯楷ＨＰＶ     

绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达

目的：在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）为标记基因的合适条件。方法用带有ＧＦＰ突变体的质粒转染到表达细胞,观察ＧＦＰ瞬时表达的情况：１．直接测定ＧＦＰ在ＣＯＳ－７细胞中的表达并观察表达的稳定性;２比较不同启动子驱动的ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ和ｐＳＶＫ３－Ｓ６５Ｔ两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;３用ＬａｃＺ基因与ＧＦＰ基因共转染     

人乳头瘤病毒16型E6基因表达产物单克隆抗体的制备研究

将含有人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ_（１６））Ｅ_６基因的重组质粒ＰＡＳ１－ＨＰＶ_（１６）Ｅ_６转染大肠杆菌ＡＲ１２０，在萘啶酮酸诱导下进行表达，表达产物经分离、纯化和鉴定获得一种分子量为１９０００的Ｅ_６表达蛋白。用纯化后的Ｅ６蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４在ＰＥＧ_（４０００）作用下进行融合，经ＨＡＴ培养基筛选杂交瘤细胞株，甲基纤维素半固体培养基克隆，克隆筛选，ＥＬＩＳＡ检测和再克隆，得到一株持续稳定分泌抗ＨＰＶ_（１６）Ｅ_６蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤株ＲＡＣ_６。     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得足够量的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１融合蛋白及含ＨＰＶ１６Ｌ１ＯＲＦ序列的基因重组体。方法：通过ＰＣＲ扩增获得ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１，表达后进行菌体蛋白质Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹分析。结果：ＨＰＶ１６Ｌ１基因重组体的构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中个有抗     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

人乳头瘤病毒16型早期基因E7的克隆及其在原核细胞中的表达

目的 进一步研究与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因的生物学活性。方法 采用ＰＣＲ法从妇女宫颈癌标本中扩增ＨＰＶ１６早期基因Ｅ７,测人ＤＮＡ诉序列,结果 克隆的ＨＰＶ１６Ｅ７基因与标准型进行比较表明,前者无核苷酸突变。将此基因装入原核表达载体,能在Ｅ．Ｃｏｌｉ中高效表达出谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）－Ｅ７蛋白,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,此融合蛋白能在Ｅ７抗体特异地结合。结论     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

Increased expression of 70 kD heat shock protein in cultured primary human keratinocytes induced by human papillomavirus 16 E6/E7 gene

Background Heat shock protein 70 （HSP70） is expressed highly in epithelial tumours associated closely with human papillomavirus 16 （HPV16） infections. However, evidence about the direct relationship between HSP70 expression and HPVs infections are still lacking. In the present study, we examined the expression of HSP70 in keratinocytes introduced with HPV16 E6/E7 oncogenes. Methods Stable transfected cells were established by transfection of the plasmids pLXSN16E6/E7 into cultured primary keratinocytes and subsequently selected by plasmid specific selection antibiotic （G418） at the required concentration. The expression of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes was determined by Western blot. The correlation of HSP70 expression and E6/E7 transfeetion was further confirmed by doubly labelled immunofluorescent staining. Results Compared to non-transfected keratinocytes, there was a significant trend for higher levels of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes. Doubly labelled immunofluorescent staining experiment showed that the co-localization of HPV16 E6/E7 and HSP70 in transfeeted keratinoeytes was observed and increased expression of HSP70 was strongly associated with the transfection of HPV16 E6/E7. Conclusions Our studies demonstrated increased levels of HSP70 proteins in keratinocytes stably transfected by HPV16 E6/E7 oncogenes. It suggests that the expression of HSP70 is modulated by HPV16 E6/E7 proteins, which may be involved in HPV16 E6/E7 induced immortalization.     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞生长及CyclinA,CyclinD1和cdk4的影响

目的 研究１６型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７对人角质形成细胞细胞周期素（ＣｙｃｌｉｎＡ,ＣｙｃｌｉｎＤ１）及细胞周期素依赖（ｃｄｋ４）的影响。方法 用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法将ＰＬＸＳＮ１６Ｅ６／Ｅ７质粒转染逆 转录病毒包装细胞ＰＡ３１７,挑选Ｇ４１８抗性克隆检测病毒滴度,将表达ＨＰＶ１６原高滴度逆转 录病毒感染人角质形成细胞;免疫印迹分析感染细胞ＣｙｃｌｉｎＡ,ＣｙｃｌｉｎＤ１,ｃｄ     

人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建

目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 6E7mRNA的转录     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

密码子优化的HPV16 L2E7基因在大肠杆菌中高效表达

目的提高HPV16L2E7融合基因在大肠杆菌中的表达水平,为中试研究提供高表达量的疫苗候选株。方法根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对L2E7全基因进行密码子优化,将分段合成的基因分部插入到pET9a中,经酶切和测序鉴定无误后转化BL21(DE3 )中,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的融合蛋白进行SDS-PAGE胶和Western blot鉴定。同时还进行梯度实验分别对诱导的温度、时间和IPTG诱导时菌体浓度进行优化,并对蛋白的纯化方案进行摸索。结果优化后的pET9aSL2E7AB在大肠杆菌中得到高效表达,诱导条件优化后的目的蛋白占全菌60%左右。结论成功得到了具有较高表达水平的疫苗候选株。     

表达HPV-16 E6基因siRNA真核载体的构建及体外转染效率鉴定

目的：采用RNA干扰技术选择性的沉默宫颈癌CaSki细胞株中HPV-16E6基因的表达。为观察HPV-16E6基因的小干扰片段能否在CaSki细胞特异性的抑制E6基因的表达,构建能在哺乳动物细胞中表达E6小干扰RNA的真核表达质粒,并观察其转染效率。方法：根据HPV-16E6基因序列,设计特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至CaSki细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率：结果：通过酶切鉴定和序列测定,成功的构建二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功的转染到CaSki细胞株中,转染效率达到50％以上：结论：siRNA真核表达载体的构建及体外转染的成功为下一步研究奠定了良好的基础：     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

HPV16 E7"自杀性"DNA 疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的"自杀性"DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400 bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.