人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建

目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 6E7mRNA的转录     

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的: 构建人乳头瘤病毒16型 (HPV-16) E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达。方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7。 将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果: E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖
凝胶电泳,均可见300 bp的目的基因条带。表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符。结论: 在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

HPV16 E6基因特异性RNA干扰表达载体的构建及对HPV16 E6基因抑制作用的研究

目的:构建针对HPV16 E6基因的RNA干扰表达载体,并研究其对宫颈癌HPV16 E6基因的抑制作用。方法:针对HPV16 E6基因序列设计shRNA(short hairpin RNAs,shRNAs)片断,构建针对HPV16 E6基因的RNA干扰(RNA interference,RN Ai)质粒表达载体,脂质体法转染宫颈癌Caski细胞株,应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对HPV16 E6 mRNA及蛋白表达的影响。结果:经PCR及测序证实3种表达载体构建成功,细胞试验表明3种表达载体均抑制了HPV16 E6的mRNA及蛋白的表达,其中CaskiB细胞HPV16E6mRNA的抑制率为89.5%,蛋白抑制率达98.1%。结论:RNAi表达载体可以有效的抑制HPV16 E6基因的表达。     

HPV18E6原核表达载体的构建及3×flag-HPV18E6融合蛋白的诱导表达

目的 构建pET-22b-3×flag-HPV18E6原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白.方法 用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带HindⅢ、SalⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,将HPV18E6基因片段克隆到p3×flag-myc-CMV-24载体上.然后设计特异性引物扩增3×flag-HPV18...     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

人乳头瘤病毒16型L1基因乳酸杆菌表达载体的构建

目的:构建含人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1基因的乳酸杆菌分泌表达载体。方法:从培养的CasKi细胞中提取DNA为模板,经PCR得到HPV16L1衣壳蛋白基因,将其连接入乳酸杆菌分泌表达载体pVE5523质粒中,并转化入Top10菌中保存。结果:构建的HPV16L1-pVE5523重组表达载体经PCR鉴定正确;获得的目的基因片段经测序与GenBank公布的HPV16L1基因序列符合。结论:成功构建了HPV16L1-pVE5523表达载体。     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞增殖及其调控因子的影响

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６／Ｅ７基因对人角质形成细胞增殖及细胞周期调控因子ｐ５３,ｐＲｂ的影响。方法 Ｌｏｐｏｆｅｔａｍｉｎｅ介导法进行 染,筛选阳性克隆,免疫荧光染色检测ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染细胞内的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化,免疫印迹分析ｐ５３,ｐＲｂ表达情况。结果 免疫荧光染色检测见转染细胞内有ＨＰＶＥ６／Ｅ７表达,汉式细胞仪显示转染细胞Ｇ１期细胞为４９．２％比正常     

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体，并分析其在HEK293细胞中的表达。方法 从重组pcDNA3／HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上，经PCR、酶切和测序鉴定，将重组质粒pcDNA3-flag／HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞，细胞裂解后，用Western blot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果 PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag／HPC2构建正确，并可在HEK293细胞内高效表达。结论 成功构建了pcDNA3-flag／HPC2真核表达载体，该载体能在哺乳动物细胞中有效表达，为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。     

HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达。结果经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功。结论构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础。     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepal-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力.方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepal-6细胞.G418筛选阳性克隆(Hepal-6-MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT法检测Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞接种于CA7BL/6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepal-6-MAGE-1细胞的致瘤能力.结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepal-6细胞,PT-PCR与Western bohting检测分别在Hepal-6-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力.     

人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasy系统构建人乳头瘤-16(HPV-16)E6 E7基因重组腺病毒,并通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.方法:将质粒pET-32a( )-E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-E6E7,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-E6E7,经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-E6E7;用包装后的病毒上清再次感染293细胞,提取细胞中的蛋白,通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.结果:连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-E6E7;经人胚肾293细胞包装,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010 pfu/L滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-E6E7重新感染人胚肾293细胞3 d后,提取细胞蛋白,Western Blot检测,E6E7有明显表达.结论:利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒Ad E6E7.     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...