鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的基因表达谱分析

目的区分不同转移能力的鼻咽癌细胞亚群,对于探讨鼻咽癌转移的分子机制、脏器亲和性具有重要的临床和生物学意义。我们拟应用基因芯片技术来分析鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的基因表达谱差异。方法分别提取鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的总RNA,逆转录成荧光标记的cDNA,与Af-fymetrix Human Genome U₁33A 2.0寡核苷酸芯片杂交（每株重复3次）,用专业的软件和聚类分析法分析基因表达谱。结果得到差异表达基因3767个,其中差异表达2倍以上的基因281个,进一步筛选出16个可能与鼻咽癌肝转移关系密切的基因16个。结论这16个基因能够很好的区分5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP,为进一步寻找鼻咽癌肝转移的临床分子标志物、判断预后缩小了范围。     

具有肝转移倾向的结肠癌细胞亚系的筛选与鉴定

目的 筛选人结肠癌SW480细胞中具有特定肝脏转移倾向的亚克隆,比较它与母系生物学特性的差异,为结肠癌肝转移机制的研究提供基本的实验材料.方法 采用外科原位接种、组织块细胞培养法从裸鼠体内获得SW480细胞系中具有肝脏转移倾向的亚克隆SW480/M5;体内体外实验验证它与母系细胞在生物学特性上的差异.结果 体内实验证明SW480具有广泛转移的潜能,而SW480/M5细胞只具有向肝脏转移的潜能;SW480/M5细胞原位瘤的质量较SW480细胞大且皮下瘤生长速度较快:体外实验证明SW480/M5细胞的克隆形成能力,体外增殖能力、体外运动及侵袭能力较SW480细胞强,而对FN的粘附能力较SW480细胞弱.结论 从结肠癌细胞系SW480中筛选出的细胞亚系SW480/M5转移方向明确,是结肠癌肝转移机制研究的理想细胞模型.     

WNT5A干扰对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响

目的观察WNT5A干扰对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响。方法以高转移鼻咽癌细胞CNE2的亚克隆Clone-18为研究对象,通过逆转录病毒感染系统,建立WNT5A稳定干扰的细胞株,并用免疫印迹进行鉴定,划痕修复实验和三维培养观察细胞侵袭迁移能力的改变。结果WNT5A在高转移鼻咽癌细胞株Clone-18中的蛋白表达明显减少,稳定干扰WNT5A的细胞模型建立。当干扰WNT5A后,Clone-18的侵袭转移能力大大降低。结论WNT5A高表达与鼻咽癌侵袭转移密切相关。     

Tet-on系统调控A20基因在鼻咽癌肝转移亚系中的表达

目的构建pSUPERIOR-A20可调控性载体,检测其在肝转移亚系中表达的可调控性。方法通过基因芯片筛选出鼻咽癌肝转移相关基因,结合文献调研获得头颈部癌转移标签基因,并通过荧光定量PCR检测发现A20可能在鼻咽癌肝转移过程中发挥了重要作用。在线设计A20特异性干扰片段,选择相应酶切位点后将其插入pSUPERIOR质粒中,应用酶切鉴定和序列分析方法验证所构建载体的正确性。将pSUPERIOR质粒和Tet-on质粒共转染肝转移亚系5-8F-H3,PCR检测A20的表达。结果Real-time PCR检测A20在肝转移亚系5-8F-H3中的表达显著上调,结果具有统计学意义(P=0.005)。且成功构建了pSUPERIOR-A20载体,与Tet-on质粒共转染5-8F-H3后经嘌呤霉素筛选克隆,经荧光定量PCR检测阳性克隆A20基因的表达显著下调。结论成功构建pSUPERIOR-A20载体,并可有效干扰鼻咽癌肝转移亚系5-8F-H3中A20基因的表达,为进一步研究A20在鼻咽癌肝转移中的作用奠定了良好的基础。     

姜黄素通过调控Tiam1蛋白表达影响鼻咽癌增殖与侵袭的研究

通过观察Tiam1蛋白在鼻咽癌组织中表达情况,探究姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞增殖及侵袭的影响。通过免疫组化法检测发现鼻咽癌组织中Tiam1表达高于鼻咽黏膜慢性炎症组织;CCK-8实验、划痕实验及Transwell实验结果说明,姜黄素可体外抑制5-8F细胞的增殖及迁移能力; Western blot检测不同浓度处理5-8F细胞后Tiam1蛋白表达情况。本研究证实Tiam1在鼻咽癌组织中高表达;姜黄素可能通过抑制Tiam1蛋白表达,降低5-8F细胞增殖与侵袭能力。     

姜黄素通过调控Tiam1蛋白表达影响鼻咽癌增殖与侵袭的研究

通过观察Tiam1蛋白在鼻咽癌组织中表达情况,探究姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞增殖及侵袭的影响。通过免疫组化法检测发现鼻咽癌组织中Tiam1表达高于鼻咽黏膜慢性炎症组织;CCK-8实验、划痕实验及Transwell实验结果说明,姜黄素可体外抑制5-8F细胞的增殖及迁移能力; Western blot检测不同浓度处理5-8F细胞后Tiam1蛋白表达情况。本研究证实Tiam1在鼻咽癌组织中高表达;姜黄素可能通过抑制Tiam1蛋白表达,降低5-8F细胞增殖与侵袭能力。     

体内连续筛选法建立可视化乳腺癌肝转移裸鼠模型

目的 建立整体可视化原位乳腺癌肝转移模型,实时观察乳腺癌发展、转移的规律,为研究乳腺癌肝转移的机制以及治疗提供一种更好的动物模型.方法 利用pEGFP-N1表达质粒转染乳腺癌高转移亚系MDA-MB-231细胞,经稳定筛选后建立稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)的乳腺癌细胞株pEGFP-MDA-MB-231细胞.利用pEGFP-MDA-MB-231癌细胞株通过体内连续传代,建立乳腺癌高肝转移模型,并借助整体荧光成像系统采集、分析乳腺癌细胞发出的荧光信号,实时观察乳腺癌细胞在裸鼠原位生长及肝转移情况.结果 乳腺癌细胞pEGFP-MDA-MB-231稳定、高效表达EGFP,通过体内连续筛选法建立乳腺癌原位接种模型后,第1代、第2代、第3代原位接种模型的肝转移率分别为20%、80%、100%.并通过常规病理学方法验证了可视化模型的可靠性.结论 利用稳定转染的乳腺癌pEGFP-MDA-MB-231细胞通过裸鼠体内连续筛选可以建立高效、相对特异性的整体可视化原位乳腺癌肝转移模型,为研究乳腺癌肝转移的机制及治疗提供一种更可靠有效的实验模型.     

CSF-1R在鼻咽癌细胞株中的表达情况及对细胞增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响

目的 研究集落刺激因子1 受体(colony-stimulating factor 1 receptor,CSF-1R)在鼻咽癌中的表达,并对其功能进行初步探讨。方法 培养5-8F、6-10B、CNE-2、NP69细胞株,用实时荧光定量PCR 和Western blot法检测4种细胞株中CSF-1R的表达情况,通过比较5-8F、6-10B、CNE-2 鼻咽癌细胞株与NP69 正常鼻咽上皮细胞株中CSF-1R 的表达,筛选出CSF-1R 高表达细胞株和低表达细胞株;通过实时荧光定量PCR 检测两种细胞株的增殖因子Cyclin D1、凋亡因子Bcl-2和Bax、侵袭转移因子MMP-2 的mRNA 表达情况,分析CSF-1R 的表达与鼻咽癌预后的关系。结果 5-8F 鼻咽癌细胞株中CSF-1R 呈现高表达水平(P=0.000),6-10B 鼻咽癌细胞株中CSF-1R 呈现低表达水平(P=0.000、P=0.370),CNE-2鼻咽癌细胞株中CSF-1R 的表达与正常鼻咽上皮细胞株差异无统计学意义(P=0.057、P=0.481)。CSF-1R 高表达细胞株5-8F 的增殖、侵袭转移能力明显强于CSF-1R 低表达细胞株6-10B(P均=0.000),而凋亡能力则弱于6-10B细胞株(P=0.000)。结论 鼻咽癌细胞与正常鼻上皮细胞株之间CSF-1R的表达差异有统计学意义。CSF-1R 的表达与细胞增殖因子Cyclin D1、凋亡因子Bcl-2 及BAX、侵袭转移因子MMP-2 的表达有一定的相关性,CSF-1R 表达水平越高,细胞的增殖、侵袭转移能力越强,凋亡能力越弱。     

CD105/CD133筛选鉴定SMMC-7721株干细胞表面标志物的实验研究

目的：观察人肝癌细胞株 SMMC-7721中膜抗原CD133、CD105的表达情况并对不同亚群的生物学性状进行体内外实验研究。方法以含10%胎牛血清的 DMEM 对SMMC-7721株细胞培养;采用流式细胞仪方法分选检测CD133、CD105在SMMC-7721中表达情况并分选出CD133+/CD105+、CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4个亚群;CCK-8和 Transwell侵袭实验分别检测4个亚群和未分选细胞组的增殖及侵袭能力,软琼脂克隆实验检测5组细胞成球能力;裸鼠成瘤实验了解 CD133+/CD105+、CD133-/CD105-亚群和未分选组的成瘤能力。结果流式细胞仪分选的 CD133+/CD105+、 CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4种细胞亚群的比例分别为1．61%、0．01%、97．88%和0．50%。 CD133+亚群的增殖和成球能力较 CD133-亚群及未分选细胞组强,而CD105+亚群侵袭能力较 CD105-亚群及未分选细胞组强。CD133+/CD105+组与CD133-/CD105-组及未分选细胞组相比成瘤所需的时间短、所需细胞数少、成瘤的体积大。结论 CD133在人肝癌细胞株 SMMC-7721中的表达与其增殖成球能力有关,CD105与其侵袭能力有关,CD133+/CD105+具有体内高度的成瘤能力。 CD133+/CD105+亚群在人原发性肝癌细胞株SMMC-7721中具有肿瘤干细胞特性。     

miR-143在鼻咽癌细胞系中的表达及其对高转移细胞株5-8F的影响

目的检测鼻咽癌细胞系中miR-143表达情况,建立稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,为研究其在鼻咽癌的发生和发展
中的作用机制提供可靠的细胞模型。方法采用QPCR方法检测鼻咽癌细胞系CEN1、CNE2、HONE1、5-8F、6-10B及人永生化鼻
咽上皮细胞NP69中miR-143的表达水平。构建重组逆转录病毒质粒pMSCV-puro-miR-143,包装逆转录病毒pMSCV-miR-143
和pMSCV-Vector并感染鼻咽癌细胞,建立稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,并应用细胞黏附实验检测过表达mir-143后,鼻
咽癌细胞对胞外基质的黏附性。结果鼻咽癌细胞系中miR-143的表达水平均低于对照组NP69细胞,其中高转移潜能细胞株
5-8F的表达量最低,仅为对照组的3.03%,成瘤但不转移细胞株6-10B表达量最高,为对照组的63.59%。实时荧光定量PCR显示
筛选后第7代细胞miR-143的表达水平比对照组高出达1080倍（P<0.05）。细胞黏附实验结果显示,过表达mir-143可降低5-8F细
胞对胞外基质的黏附性。结论miR-143在鼻咽癌细胞系中表达失常,其作用可能与鼻咽癌细胞的侵袭和转移相关;成功建立了
稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,并初步确定miR-143能抑制5-8F细胞的黏附能力,为探索miR-143在鼻咽癌的发生和发展
中的作用机制奠定了实验基础。
     

Macrophage migration inhibitory factor enhances neoplastic cell invasion by inducing the expression of matrix metalloproteinase 9 and interleukin-8 in nasopharyngeal carcinoma cell lines

Background Nasopharyngeal carcinoma (NPC) shows highly invasive and metastatic features. This study aims to investigate macrophage migration inhibitory factor (MIF)-induced invasion of NPC cells in vitro and the effects on matrix metalloproteinases (MMPs) and interleukin-8 (IL-8), and to study the mechanism of tumor cell invasion and metastasis in the early stage of NPC. Methods Two nasopharyngeal carcinoma cell lines, CNE-1 and CNE-2, were adopted in this study. The NPC cell invasion and migration were evaluated by microinvasion assay. The variation of expression percentages of MMP2- or MMP9-positive cells was detected by flow cytometry in two cell lines with or without MIF treatment. Western blotting and RT-PCR were used to assay the protein and mRNA expressions of MMP2 and MMP9. The IL-8 concentration secreted by NPC cells was compared with the cells with different treatments using ELISA. Results After treating with MIF for 48 hours, the cell numbers of CNE-1 and CNE-2 which went through the 8-μm filter membrane were increased. Compared with non-MIF treated NPC cells, significant difference could be found both in CNE-1(P=0.005) and CNE-2 cells (P=0.001) . The percentages of MMP9-positive cells were significantly increased in both CNE-1 ［from （28.5±2.5）% to （82.4±3.5）%, P=0.001］ and CNE-2 ［from （32.8±3.5）% to （86.1±1.6）%, P=0.002］. The relative intensity of MMP9 protein expression was also enhanced in both cell lines (CNE-1: from 83.1±6.0 to 242.9±22.9, P=0.002; CNE-2: from 84.4±4.3 to 278.9±29.7, P=0.003). Correspondingly, the increased MMP9 mRNA expression level was significantly detectable in both cell lines.The concentration of IL-8 in the supernatant of CNE-2 was higher ［(1201.8±593.3） pg/ml］ after treatment. It was also remarkably higher than that in the supernatant of CNE-2 without treatment (P=0.026). However, there was no significant difference in the concentration variation of IL-8 in CNE-1 (P=0.581), while the IL-8 mRNA level was only enhanced in CNE-2. Conclusions MIF can induce potent invasion of NPC cell lines in vitro, and the infiltrating lymphocytes in NPC might be responsible for the invasion and metastasis of tumor cells. MIF cytokine which is secreted by these infiltrating lymphocytes might contribute to the invasion as well as metastasis of NPC in the early stages by induction of MMP9 and IL-8 in an indirect pathway.     

鼻咽癌淋巴结转移动物模型的建立及其转移相关标签基因的筛选

目的 建立稳定的鼻咽癌(NPC)淋巴结转移模型,筛选鼻咽癌淋巴结转移的候选标志基因.方法 我们用鼻咽癌5-8F-EGFP细胞株建立了稳定淋巴结转移可视化裸鼠模型,筛选获得具有淋巴结转移潜能的5-8F-LN鼻咽癌细胞.通过文献数据挖掘获得乳腺癌,头颈部鳞癌等肿瘤的转移标签基因和淋巴结转移标签基因.结合鼻咽癌5-8F和6-10B细胞株约307个差异性表达基因得到21个重叠的基因,最终分析得到3个可能促进恶性肿瘤转移的高表达基因:ADM,IRF1和CAV1.通过荧光定量PCR验证在5-8F.EGFP,6-10B-EGFP,5-8F-LN和NP69细胞中的表达情况.结果 IRF1在5-8F-EGFP、6-10B-EGFP和5-8F-LN中的表达远高于在NP69中的表达,且差别有统计学意义(p=0.008、0.022、0.006);CAV1在5-8F-EGFP中的表达高于其在6-10B-EGFP中的表达(p=0.014);ADM在4种细胞中的表达无明显差别.结论 IRF1可能在鼻咽癌演进过程中起着重要作用,而CAV1在5-8F-EGFP中的相对高表达可能和其高转移特性有关.     

稳定表达EGFP的不同转移特性骨肉瘤细胞亚株建立及其生物学特性

目的：建立经绿色荧光蛋白基因转染的骨肉瘤细胞亚株并研究其生物特性。方法：利用脂质体转染pEGFP人人骨肉瘤MG63细胞系，通过细胞电泳，获得两株细胞克隆M6和M8，经体外细胞增殖、软琼脂形成、生长曲线、裸鼠成瘤试验综合分析其生物学行为改变。应用组织形态学观察、染色体分析、软琼脂克隆形成法研究癌细胞的生物学特性。结果：发现M6和M8两株均保持人类染色体核型，所形成肿瘤显示人成骨肉瘤上皮样组织形态，其中M6的群体倍增时间为38．4h，软琼脂形成率为18．7％，M8群体倍增时间为23．0h，软琼脂形成率为29．3％。裸小鼠背部皮下接种M6和M8，发现M8成瘤时间短，细胞增殖快，但在4周内两者均不发生转移。结论：骨肉瘤细胞亚系有不同的转移特性，GFP的整合及表达未对MG63细胞的生长状态造成明显影响，可作为报告基因进一步了解骨肉瘤细胞转移的差异性分析。     

鼻咽癌候选侵袭和转移相关基因的筛选

目的筛选影响鼻咽癌侵袭和转移能力的相关基因。方法利用cDNA基因芯片,比较高转移鼻咽癌细胞株5_8F和非转移鼻咽癌细胞株6-10B之间的差异表达基因,并利用在线Milano程序筛选鼻咽癌侵袭和转移相关基因,GOstat分析这些基因功能,最后荧光定量PCR鉴定差异表达基因。结果芯片分析结果显示,鼻咽癌细胞株5—8F与6-10B之间共有200多个差异表达基因。基于Milano程序分析后,发现与侵袭和转移能力相关的基因有33个,其中27个上调,6个下调。GOstat分析显示,这些基因参与了细胞移动、调节凋亡、细胞黏附等。结论经在线Milano程序分析鉴定的鼻咽癌5—8F和6-10B细胞株之间的这33个差异表达基因可能参与了鼻咽癌的侵袭和转移。     

鼻咽癌细胞株中乳腺癌转移抑制基因表达的研究

目的:检测乳腺癌转移抑制(BRMS1)基因在不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中的表达情况。方法:应用免疫组织化学法和逆转录聚合酶链式反应法在mRNA和蛋白2方面检测人鼻咽癌细胞株高分化磷癌、低分化磷癌、低分化细胞株、高成瘤高转移性细胞株、低成瘤低转移性细胞株中BRMS1的表达。结果:5种细胞株中BRMS1的蛋白表达皆为阳性,在不同转移习性的细胞株中其表达强度明显不同。4种细胞株中扩增出BRMS1 mRNA,而BRMS1 mRNA在高转移性细胞株中未扩增出,高分化鳞癌、低分化鳞癌、低分化细胞株BRMS1mRNA表达水平均显著高于低成瘤低转移性细胞株(P<0.01)。结论:BRMS1的表达与细胞株的转移能力有明显相关性,表明BRMS1可能作为鼻咽癌细胞转移的重要指标。     

长非编码MALAT1基因在人鼻咽癌细胞株的表达及生物学意义

目的探讨MALAT1在鼻咽癌细胞细胞株中的表达及生物学功能。方法通过Real-time PCR检测MALAT1基因在鼻炎
癌细胞株5-8F、C666-1、CNE-1、CNE-2、HONE-1、6-10B及永生化鼻咽上皮细胞NP69株中的表达;采用RNAi技术和RNA激活
技术,构建MALAT1慢病毒干扰载体和激活载体载体并稳定转染鼻咽癌细胞株CNE-1,采用CCK8、平板克隆、划痕等试验分析
MALAT1基因对CNE-1细胞生物学行为的影响。结果MALAT1在高转移的鼻咽癌细胞株中高表达,在正常鼻咽上皮细胞低
表达;经激活过表达MALAT1 后,CNE-1 细胞的上皮性标志物E-Cadherin 的表达显著下调,间质细胞标志物Vimentin 表达上
调,侵袭转移能力明显增强（P<0.05）。结论MALAT1基因上调能够促进鼻咽癌CNE-1细胞的增殖、侵袭和转移能力。
     

胆囊癌肝转移模型的建立和高转移细胞亚群的筛选

目的建立胆囊癌肝转移模型并通过模型筛选高转移亚群细胞,为胆囊癌肝转移研究提供良好的实验工具。方法胆囊癌GBC-SD细胞在含10％胎牛血清的RPMI1645体外培养、胰蛋白酶分离、生理盐水制备细胞悬液1×107／ml,4-6周龄裸小鼠脾脏接种建立胆囊癌转移模型;从实验动物肝转移灶中分离肿瘤细胞,经过原代、传代培养,同样的方法建立转移模型,进行第二轮和第三轮高转移表型胆囊癌细胞亚群的筛选。光镜下观察转移灶和筛选细胞的形态特征;抽提细胞与实验动物肝组织DNA,PCR扩增三对人类特异的微卫星序列。结果建立了裸小鼠胆囊癌肝脏转移模型,转移灶分布肝实质各处,但以边缘为主。左叶多受侵犯,部分全肝转移。组织学观察转移病灶为腺癌。第一轮、第二轮、第三轮出转移模型在接种后10周、7周、5周形成肉眼转移灶,转移率为60％、70％、90％。从第三轮转移灶中筛选出高转移胆囊癌细胞亚群,命名为GBC-SD／M3。与亲代细胞GBC-SD相比,所筛选的GBC-SD／M3具有相似的形态特征。GBC-SD、GBC-SD／M3在微卫星D14S68、D18S69、D20S199位点扩增产物片段完全相同,荷瘤裸鼠肝脏没有扩增出相应的产物片段。结论本实验成功建立了胆囊癌肝转移模型;从转移模型中筛选出高转移胆囊癌细胞亚群GBC-SD／M3,与亲代细胞GBC-SD相比,形态和遗传背景保留一致性,但具有更高转移能力。