应用原生质体融合法选育林可霉素高产菌株

将林可霉素产生菌N65—2^#、S78—1^#的原生质体分别热灭活和紫外灭活，并将灭活原生质体用PEG融合，从中获得92-201^#融合株，其摇瓶效价分别较N65—2^#、S78—1^#提高17％、52％，且色素分泌少，传代稳定性强。     

双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株

目的选育高产阿维菌素产生菌。方法分别以紫外线和加热灭活阿维菌素产生菌Strepto-myces avermitilis620和Streptomyces avermitilis632原生质体,并将2种灭活的原生质体用PEG4000融合,从融合株中筛选阿维菌素高产菌种。结果获得高产阿维菌素融合株StreptomycesavermitilisF32,总发酵单位达3 904 mg.L-1,其中B1a组分产量较高,达1 016 mg.L-1,分别较出发菌株S.avermitilis 620、S.avermitilis 632提高117.1%和103.6%。结论双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株是值得推广的一种选育方法。     

林可链霉菌与委内瑞拉链霉菌种间原生质体融合的研究

本文报道氯霉素产生菌委内瑞拉链霉菌A-186株与林可霉素产生菌林可链霉菌林可变种78-11株种间原生质体融合的结果。首先,研究了委内瑞拉链霉菌A-186的原生质体制备和再生条件,再生率可达86％。然后,采用氯霉素产生菌S.venezuelae A-186的原生质体用紫外线灭活后,与具有耐药标记的S.lincolnensis var.lincolnensis78-11原生质体融合的方法,种间融合频率达到3.2×10~(-5) 。并筛选到一株遗传稳定的重组子,经初步鉴定它能同时产生两亲株所产的两种抗生素。     

非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株

目的选育高产头孢菌素C产生菌。方法分别以紫外线和加热灭活头孢菌素C产生菌Cephalosporium acremonium 18-U5和Cephalosporium acremonium 18-M6原生质体,并将两种灭活的原生质体经PEG4000融合,从融合株中筛选头孢菌素C高产菌株。结果获得高产头孢菌素C的顶头孢霉融合株Cephalosporium acremonium F20,发酵单位达4 655 mg.L-1。与双亲菌株相比分别提高了42.4%和34.9%。结论非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株的方法值得推广。     

拟无枝酸菌B37与游动放线菌E92—70属间隔合

以去甲基万古霉素产生菌Ｂ３７和替考拉宁类抗生素产生菌Ｅ９２－７０为出发菌株，将Ｂ３７原生质体热灭活，进行属间原生质体融合，融合率１．４×１０＾－６－４．６×１０＾－６，融合子５０％以上抗菌活性增强。     

青霉素产生菌的原生质体融合

将细菌血红蛋白基因引入青霉素产生菌产黄青霉H－106中而获得了产黄青霉基因工程菌1M5。产黄青霉20^#是一个青霉素产量高但产孢子能力偏低的生产菌。为提高产黄青霉的产量及产孢子能力，降低产黄青霉对氧的需求，我们采用原生质体融合技术，将通过UV诱变处理的检出的产黄青霉基因工程菌1M5 Met^-缺陷型菌株和产黄青霉20^#Arg^-缺陷型菌株分别用Novozyme 234和Cellulase R-10(1∶1）混合酶处理所得原生质体按1∶1混合后加入30％聚乙醇6000融合，产物分离纯化，得到融合株C－396^#菌株，其青霉素产量和产孢子能力都有所提高，对氧的需求有所降低。     

2-酮基-L-古龙酸产生菌原生质体的属间融合

用配对法筛选得一株氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)10-3的优良伴生菌短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)97002，混合菌发酵产生2－酮基－L－古龙酸，山梨糖的转化率达90％左右，两菌分别经诱变处理，获得耐利福平B.pumilus 97002-1-6 Rif^r和耐红霉素G.oxydans 10-3-20 Em^r遗传标记菌株，并确定B.pumilus 97002-1-6Rif^r菌原生质体形成和再生最佳条件。初步尝试两菌属间原生质体融合。     

麦角菌与雀稗麦角菌种间灭活原生质体融合

探索了在麦角菌中进行省却营养缺陷型标记的种间灭活原生质体融合。亲株Ⅰ（Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅａ,麦角隐亭产生菌）用紫外线灭活（１５Ｗ,照射距离３０ ｃｍ ）７５ ｍ ｉｎ,存活率约６×１０－ ５;亲株Ⅱ（Ｃ．ｐａｓｐａｌｉ,麦角酰胺产生菌）用热灭活（５０～５２℃）６０ ｍ ｉｎ,存活率为零。融合后的再生菌落均为亲株Ⅰ的形态,其再生频率比灭活的亲株Ⅰ提高约２０ 倍,推测绝大多数为融合子。后者经５ 次传代,大多数的产碱能力与亲株Ⅰ相当或略有提高。     

利用亚硝酸诱变原生质体筛选L—亮氨酸高产菌株的研究

本实验以Ｌ－亮氨酸产生菌黄色短杆菌ＣＦＮ－１９为出发菌株。我们首先对ＣＦＮ－１９菌株制备原生质体，原生质体制备率为９５．１％，再生率为２５％，然后对原生质体进行亚硝酸、利福平、氯化锂复合诱变处理，从再生菌株中筛选出一株高产菌株Ｈ６－６６，产酸量由原来的２３．１ｍｇ／ｍｌ提高到３２．６ｍｇ／ｍｌ，提高率达４１％。同时又对Ｈ６－６６菌株进行遗传稳定性考察，考察结果Ｈ６－６６菌株是高产稳定菌株。     

金色链霉菌原生质体电融合

为了提高去甲基金霉素的发酵效价,将金霉素链霉菌产生去甲基金霉素的变株的原生质体与金霉素高产变株热灭活的原生质体,用非交流电场法和交流电场法进行了电融合。在非交流电场法实验中。先用25％PEG将原生质体聚集,再以BAEKON 2000和SDⅡ型二种基因转移仪,采用几种不同的实验参数(脉冲强度、宽度和个数)进行融合,皆未能提高融合频率。交流电场法融合实验用SD3000细胞融合仪,当原生质体在交流电场(频率0.5MHz,强度800v/cm,作用时间60s)中形成串珠状后,施加直流脉冲(脉冲强度7kv/cm,宽度20μs,间隔0.5s,个数3),融合频率为2×10~(-4)左右,比50％PEG诱导的融合频率(2.5×10~(-5)高约一个数量级。对225株融合子进行了初筛发酵和效价测定。结果表明,其中效价高菌株所占百分数高于对照组(去甲基金霉素产生菌不同营养缺陷型的融合子),而且85％以上的融合子只产生去甲基组分。尽管融合子的发酵效价皆不稳定,但经过几次自然分离后仍获得了产量比出发菌株提高一倍左右并只产生去甲基组分较为稳定的融合子菌株。     

林可霉素生物合成基因lmbH的回转化

以ＰＩＪ７０２或ＰＩＪ４８６为载体构建了３个含有ｌｍｂＨ基因的重组质粒ｐＥＳＳ７０１、ｐＥＳＳ７０４和ｐＥＳＳ７０８分子,分别回转化林可霉素产生菌Ｂ４８,并随机挑选了６００个回转化克隆进行摇瓶初筛,以抑菌圈直长作为稀理林可霉素产生量的标准。     

Search for Factors Related to the Indole Alkaloid Production in Cell Suspension Cultures of Tabernaemontana divaricata

Three strains derived from one cell line of a suspension culture of TABERNAEMONTANA DIVARICATA were obtained by subculturing on three different media: (i) Strain A: normal MS-medium (1), (ii) Strain S: medium in which the carbon source was starch instead of sucrose, and (iii) Strain N: medium in which the ammonium/nitrate ratio was changed from 1: 2 to 1:1. The alkaloid contents of all three strains were compared at each subculture for nearly one year. Strain N showed after its initiation a gradually increasing alkaloid production up to levels of about 500 microg/gDW. Strain A (on the original medium) showed a stable, but low alkaloid production (+/- 20 microg/gDW) while strain S turned into a non-producing line. The dissimilation curves, morphology, intracellular carbohydrates, and free amino acid pools of all three strains were determined. Strain N showed the highest biomass, the least dissimilation, most plastids, most intracellular carbohydrates, and high levels of arginine and glutamine, while strain S showed the lowest biomass, most dissimilation, no plastids, little intracellular carbohydrates, and high levels of arginine, phenylalanine, and tyrosine. The observed differences are discussed and evidence is provided that the differences are not caused by genetic instability.     

产黄青霉高产菌株的选育

目的:对现生产用产黄青霉菌诱变育种以获得稳定高产菌株。方法:用化学诱变剂对菌种进行诱变育种,筛选得到的菌株通过摇瓶试验考察其产抗能力与传代稳定性。结果:选育得到的259#菌株摇瓶效价比出发菌株提高,传代三代后仍稳定。结论:通过诱变育种得到259#菌株是高产优质菌株。     

林可霉素高产菌种的选育

以林可霉素产生菌82－7^#为出发菌株,采用氯化锂、紫外线（uV)、甲基磺酸乙酯（EMS）三重复合诱变处理、筛选耐自身产物的高产菌种,从中获得65－12^#菌株。其摇瓶效价较出发菌株提高25％,发酵培养基优化组合后,其摇瓶效价提高28％。应用于30吨发酵罐生产,其发酵指数较出发菌株提高16．8％。     

复合诱变和抗性筛选高产谷胱甘肽酵母菌株

对75株酵母菌经初筛、复筛和单倍体分离,得到胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量较高的单倍体酵母菌株S1(a),并进行遗传标记.经硫酸二乙酯诱变、紫外诱变及两者的复合诱变,ZnCl2、乙硫氨酸抗性交替筛选得GSH含量较高的单倍体F4(a,Arg-,ZnCl2r,Ethr),GSH含量与产量分别比出发单倍体提高了73.5%和118.1%.     

霉酚酸高产菌株短密青霉菌的选育

以短密青霉菌UH35-58为出发菌株,紫外线为诱变剂,采用摇瓶一级发酵补水工艺(64h补水20%)淘汰大量低产菌株,获得高产突变株N110-N76.用HPLC测定其发酵液的霉酚酸含量,发酵单位比出发菌株UH35-58提高120%.经过连续传代试验,该菌株的遗传性状稳定.     

用RP-HPLC法测定盐酸林可霉素眼用温敏凝胶中盐酸林可霉素的含量

目的:建立RP-HPLC法测定盐酸林可霉素眼用温敏凝胶中盐酸林可霉素的含量。方法:采用Diamond C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相:0.05mol/L硼砂溶液(用磷酸调节pH至7.4)-甲醇(50∶50),流速:1.0ml/min,检测波长:214nm。结果:盐酸林可霉素在2～48μg/ml范围内线性关系良好(r=0.999 9),日内和日间精密度、稳定性、重复性良好,低、中、高浓度(11.608、17.584、41.501μg/ml)的加样回收率分别为(91.40±1.27)%、(97.55±0.93)%和(99.13±1.11)%(n=3)。3批样品中盐酸林可霉素的平均含量分别为标示量的(98.67±1.21)%、(99.90±0.44)%和(99.28±1.17)%(n=3)。结论:该方法准确、灵敏,重现性好,可用于盐酸林可霉素眼用温敏凝胶的含量测定。     

抗流感病毒H1N1海绵放线菌的筛选及菌株HA10201的鉴定

目的从海绵中分离筛选具有抗H1N1活性的放线菌,并对活性菌株HA10201进行鉴定。方法采用CPE和MTT方法对从海绵中分离的放线菌进行抗H1N1活性筛选,对活性较强的菌株HA10201进行形态学和生理生化特性研究,测定其16SrDNA序列并进行系统发育分析。结果菌株HA10201发酵液稀释20倍后对H1N1抑制率达68.1%,HA10201与Streptomyces roseorubens的形态和生理生化特征最为接近,且与其16SrDNA序列相似性为99.40%,且在发育树上聚为一个分支。结论菌株HA10201鉴定为S.rose-orubens,其发酵液具有较强的体外抗H1N1活性,值得进一步研究。