荧光偏振法测定荧光素钠荧光寿命的研究

用荧光偏振法测定荧光素钠荧光寿命的灵敏度和准确度较高.在荧光素钠荧光强度最强时——激发波为490nm,发射波为515nm,pH值8.5,溶液浓度1.6×10~(-5)mol/L,测定荧光素钠溶液的荧光偏振度,测定不同温度时荧光素钠溶液的粘度,再根据Perrin公式,求出荧光素钠的荧光寿命.用荧光偏振法测得荧光素钠荧光寿命为3.4ns.     

分离大鼠大脑皮质神经元长时程单细胞内Ca2+的测定

采用酶解结合机械分离方法,急性分离生后6～7d的SD大鼠的大脑皮质神经元;用Fura-2作为钙离子指示剂,用M40钙离子测量系统(PTI)长时程测量单个细胞内钙离子浓度的变化.以激发光波长340nm和380nm时510nm处的荧光发射强度比率(340/380)显示胞内Ca²⁺浓度的动态变化.     

大鼠蓝斑衰老变化——Ⅱ.细胞乙酰胆硷酯酶活性定量研究

用二异丙基氟磷酸(DFP)控制的乙酰胆硷酯酶(AChE)活性的药物组织化学方法,研究衰老大鼠蓝斑核(LC)含AChE神经元胞体在被DFP抑制后重新产生AChE量的变化。对5只3个月龄和6只26月龄大鼠LC的AChE细胞,用图像分析仪测量细胞灰度(酶活性浅染或深染后的透光度),细胞数目及细胞大小。三种参数分别列表与图加以比较。结果,老年大鼠LC胞体产生AChE速率减低,AChE活性明显减弱,AChE细胞数显著减少,细胞截面积也变小。     

荧光比率法测量平滑肌细胞内的钙动力学变化

目的建立一种荧光比率方法来测量细胞内钙离子的动力学变化,并研究血管平滑肌细胞钙动力学变化在重症休克血管反应性降低中的作用.方法复制SD大鼠失血性休克模型,分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC),使用荧光探针Fluo-3/AM、FuraRed双标记比率方法结合激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞钙动力学变化;评估荧光比率法在动态测定胞内钙离子浓度变化中的应用及其观察ATP敏感钾通道(KATP)特异性阻滞剂优降糖对血管反应性和钙动力学影响.结果休克后2 h(失代偿期),血管反应性明显降低,NE作用带来的平滑肌细胞内钙离子浓度升高的程度明显减弱;加入优降糖可明显提高NE对平滑肌细胞内钙离子的升高作用,改善细动脉对NE的反应性,带来血管反应性部分恢复.在37℃,Fluo-3/AM、FuraRed浓度为5μnol/L的条件下,肠系膜细动脉平滑肌细胞负载40 min左右即可获得良好的标记效果.结论优降糖特异性的阻滞ATP敏感钾通道的开放,增多细胞外钙内流并提高血管反应性;使用荧光比率法可以使胞内钙离子浓度的测量不受荧光探针浓度、细胞大小、激光漂白等因素的影响,可以准确、实时、动态测量细胞内钙离子浓度变化.     

刺激蓝斑对下丘脑弓状核单位放电的影响

本室以往的工作表明,β-内啡肽能神经元胞体集中的下丘脑弓状核(ARC)与去甲肾上腺素(NE)能神经元胞体密集的蓝斑(LC)均参与痛觉调制及针刺镇痛过程。形态学资料表明LC有纤维直接投射到ARC,生化测定也证明ARC区含有较高的NE含量。为了进一步探讨它们之间的功能     

蓝斑-去甲肾上腺素能系统及中缝背核-5-羟色胺能系统在刺激弓状核镇痛中的作用

大量资料表明,下丘脑弓状核(ARC)、蓝斑(LC)、中缝背核(DR)在痛觉调制及针刺镇痛中具有重要作用。ARC、LC和DR分别为脑内β-内啡肽(β-End)能神经元胞体、去甲肾上腺素(NE)能神经元胞体和5-羟色胺(5-HT)能神经元胞体主要集中的部位。而且这三个核团之间有密切的解剖和功能上的联系。免疫组化资料表明,从ARC发出的β-End能纤维投射到LC和DR,并且人们已在LC和DR中发现鸦片受体的存在。本实验用行为测痛结合生化测定的方     

荧光比率法测量平滑肌细胞内的钙动力学变化

目的 建立一种荧光比率方法来测量细胞内钙离子的动力学变化，并研究血管平滑肌细胞钙动力学变化在重症休克血管反应性降低中的作用。方法 复制SD大鼠失血性休克模型，分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)。使用荧光探针Fluo-3／AM、FuraRed双标记比率方法结合激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞钙动力学变化；评估荧光比率法在动态测定胞内钙离子浓度变化中的应用及其观察ATP敏感钾通道(KATP)特异性阻滞剂优降糖对血管反应性和钙动力学影响。结果 休克后2h(失代偿期1，血管反应性明显降低，NE作用带来的平滑肌细胞内钙离子浓度升高的程度明显减弱；加入优降糖可明显提高NE对平滑肌细胞内钙离子的升高作用，改善细动咏对NE的反应性，带来血管反应性部分恢复。在37℃，Flu-o-3／AM、FuraRed浓度为5μmol／L的条件下，肠系膜细动脉平滑肌细胞负载40min左右即可获得良好的标记效果。结论 优降糖特异性的阻滞ATP敏感钾通道的开放，增多细胞外钙内流并提高血管反应性；使用荧光比率法可以使胞内钙离子浓度的测量不受荧光探针浓度、细胞大小、激光漂白等因素的影响，可以准确、实时、动态测量细胞内钙离子浓度变化。     

三叶青提取物解热作用及对大白鼠下丘脑5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺含量的影响

目的探讨三叶青提取物(ETR)对酵母致大白鼠发热和下丘脑5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量的影响,为其解热降温机理作用提供科学依据。方法用荧光分光光度计在365、385、325 nm处为激发波长,以485、480、375 nm为发射波长,测定5-HT、NE和DA含量。结果给药组大白鼠在给予三叶青提取物后1 h体温显著下降,下丘脑组织中5-HT、NE和DA含量明显低于空白对照组。结论三叶青提取物对酵母致发热大白鼠有明显的解热作用,其解热作用与影响体温调节中枢介质5-HT、NE、DA的含量有关。     

海兔5-羟色胺能神经纤维与侧节感觉神经元的关系 Ⅰ免疫光镜研究

应用ABC免疫组化技术,研究了海兔5-羟色胺免疫反应阳性(5-HT-IR)纤维在侧节感觉神经元簇(PSC)中的分布及其与侧节感觉神经元(PSN)的关系。可见PSN胞体和轴突的近侧段被含有大量膨体的5-HT-IR纤维所包绕。光镜下测量4个视野区的5-HT-IR,膨体平均短径为1.1±0.6μm,分布范围为0.2～3.8μm。膨体大小的频数分布呈正偏态,79%的膨体短径分布于0.2～1.4μm之间。5-HT-IR纤维至少存在4种类型。少数5-HT-IR纤维可有分支发出,发出点通常是在膨体上,从膨体发出2～4条细分支,每条分支上又可见数个子膨体存在。发出分支的膨体平均短径为1.70±0.5μm,分布范围在1.0～2.4μm,某些小的膨体似与PSN胞体表面形成接触,但现有结果尚不足以说明5-HT-IR纤维与PSN之间存在着突触样联系,因为PSN细胞胞体表面有胶质细胞形成的胶质鞘包绕,这一结构或许阻碍5-HT-IR纤维与PSN形成真正的突触联系。     

海兔5-羟色胺能神经纤维与侧节感觉神经元的关系 Ⅰ免疫光镜研究

应用 ABC 免疫组化技术,研究了海兔5-羟色胺免疫反应阳性(5-HT-IR)纤维在侧节感觉神经元簇(PSC)中的分布及其与侧节感觉神经元(PSN)的关系。可见 PSN 胞体和轴突的近侧段被含有大量膨体的5-HT-IR 纤维所包绕。光镜下测量4个视野区的5-HT-IR,膨体平均短径为1.1±0.6μm,分布范围为0.2～3.8μm。膨体大小的频数分布呈正偏态,79%的膨体短径分布于0.2～1.4μm 之间。5-HT-IR 纤维至少存在4种类型。少数5-HT-IR 纤维可有分支发出,发出点通常是在膨体上,从膨体发出2～4条细分支,每条分支上又可见数个子膨体存在。发出分支的膨体平均短径为1.70±0.5μm,分布范围在1.0～2.4μm,某些小的膨体似与 PSN 胞体表面形成接触,但现有结果尚不足以说明5-HT-IR 纤维与 PSN 之间存在着突触样联系,因为 PSN 细胞胞体表面有胶质细胞形成的胶质鞘包绕,这一结构或许阻碍5-HT-IR 纤维与 PSN 形成真正的突触联系。     

大鼠睾丸和附睾的去甲肾上腺素能神经支配

应用改良的乙醛酸诱发儿茶酚胺(CA)的荧光组织化学方法,证明去甲肾上腺素(NA)能神经终末在大鼠睾丸和附睾内的分布及其构筑形式。实验发现,大鼠皋丸间质结缔组织及血管壁接受NA能神经支配:此种带膨体荧光神经纤维发出分枝,伸进曲细精管壁;神经终末包绕着睾丸网内小管壁;NA能神经终末延伸进入附睾头部的输出小管,并在管腔内形成网织状结构;在附睾体,有神经纤维伸入附睾管内;附睾尾部,荧光膨体纤维分布更为丰富。     

衰老大鼠下丘脑单胺类神经递质含量的变化

目的:观察D-半乳糖衰老大鼠下丘脑单胺类神经递质含量的变化.方法:D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型,采用高效液相色谱-电化学法检测各组大鼠下丘脑单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量.结果:D-半乳糖衰老大鼠下丘脑NE、DA、5-HT的含量明显降低(与正常大鼠相比P＜0.01).结论:D-半乳糖衰老大鼠脑单胺类神经递质含量下降,这可能是D-半乳糖致衰老的作用机制之一.     

甲羟戊酸对人类肾小球系膜细胞增殖的影响

目的探讨甲羟戊酸(MVA)对人类肾小球系膜细胞(HMC)增殖的作用和机制。方法用酶联免疫检测仪检测不同浓度MVA作用下HMC在490 nm波长处的光吸收(A490 nm)值以测定不同浓度和时间点MVA作用下HMC的增殖水平。结果MVA在10-100 nmol/L范围内对HMC增殖有促进作用,且作用呈浓度依赖性,100 nmol/L MVA作用下A490 nm值从正常组0.408±0.019上升到0.509±0.011。100 nmol/L MVA对HMC的增殖作用在12-48 h内呈时间依赖性。12,24,48 hA490 nm值分别为0.201±0.040,0.326±0.019,0.509±0.011。结论MVA是HMC增殖的促进剂。     

心脉通胶囊对离体大鼠胸主动脉条的作用及机制

目的 探讨心脉通胶囊(XMT)对离体大鼠胸主动脉舒张作用的影响及机制。方法 采用大鼠胸主动脉环张力测定法,观察不同浓度XMT (200、400及800 g/L)对去甲肾上腺素(NE)和氯化钾(KCl)预收缩胸主动脉环的舒张作用及量效曲线的影响;以NE作为血管收缩刺激剂,观察XMT对内钙释放与外钙内流的影响。结果 XMT使NE和KCl的量效曲线向右下移动,最大反应性降低;在无钙Kerbs液中,XMT抑制NE诱导内钙释放所诱导的血管收缩反应,对复钙后NE所致的血管持续收缩具有抑制趋势。结论 XMT可使离体大鼠胸主动脉条舒张,该作用可能与钙离子拮抗有关。     

PM_(2.5)对大鼠气管上皮细胞氧化应激及自噬的影响

目的:探讨PM_(2.5)对RTE大鼠气管上皮细胞的氧化应激及自噬的影响。方法:采集制备不同浓度的PM_(2.5)来处理RTE细胞,用MTT比色法测定细胞增值率,流式细胞术检测细胞内活性氧类(ROS)自由基生成,Western Blot检测微管相关蛋白1轻链3I蛋白(LC3I)和LC3II表达。结果:PM_(2.5)100mg/L和200mg/L处理后细胞存活率均明显降低,并呈浓度和时间依赖性。不同浓度PM_(2.5)可升高胞内ROS水平及增加LC3II蛋白表达,亦呈浓度和时间依赖性。结论:PM_(2.5)通过诱发氧化应激及自噬对气道上皮起到损害作用,其中氧化应激促进细胞过度自噬的发生。     

荧光光谱法测定人血浆中奎尼丁浓度

鉴于奎尼丁化学结构具有喹啉环显示的荧光特性,作者设计了于体液中测定血药浓度的荧光光谱法。血样经碱化后用苯萃取,转移入硫酸介质中测量奎尼丁荧光强度。激发波长(E_x)353nm;发射波长(E_m)445nm。奎尼丁浓度在0.06～0.8μg/ml范围与荧光强度呈直线相关(相关系数r=0.9999;回归方程C=0.0102F-0.0024)。溶液的荧光强度稳定。由测得人血浆中回收率数据,平均可达97.14±1.27(SD)％(n=24),变异系数1.30％。应用于病人血样分析,结果良好。本法为临床监测奎尼丁血浓度提供可行的手段。     

骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-128 调控GSK3B参与脑梗死进展

目的 探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCS)外泌体源性miR-128调控GSK3B对脑梗死大鼠自噬与炎性反应的影响。方法 分离BM-MSCS及外泌体,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)对miR-128与GSK3B的表达量进行检测,双荧光素酶报告实验验证miR-128和GSK3B的靶向关系,Western blot法检测自噬相关蛋白(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)的表达,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测组织中炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)分泌水平。结果 与sham组大鼠比较,大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠脑组织中miR-128表达下调,但miR-128在BM-MSCS外泌体中表达上调(P＜0.05)。外泌体处理或上调外泌体中miR-128表达能降低MCAO大鼠脑组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达,抑制TNF-α、IL-6浓度(P＜0.05)。但下调外泌体中miR-128表达则相反。miR-128与GSK3B的靶向关系被验证,下调miR-128的作用被si-GSK3B部分抵消。结论 BM-MSCS外泌体源性miR-128通过靶向GSK3B抑制脑梗死大鼠自噬与炎性反应。     

衰老大鼠海马单胺类神经递质含量的变化

目的:观察D-半乳糖衰老大鼠学习记忆能力及海马单胺类神经递质含量的变化.方法:D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型,采用Morris水迷宫检测各组大鼠的空间学习记忆能力、高效液相色谱-电化学法检测各组大鼠海马单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量.结果:D-半乳糖衰老大鼠空间学习记忆能力明显下降,模型大鼠在90秒内穿过原平台位置的次数和在原平台象限探索时间占总时间的百分比与正常大鼠相比明显下降(P＜0.01);衰老大鼠海马NE、DA、5-HT的含量明显降低(与正常大鼠相比P＜0.01).结论:D-半乳糖衰老大鼠学习记忆能力及海马单胺类神经递质含量下降,这可能是D-半乳糖致衰老的作用机制之一.     

问号钩端螺旋体磷脂酶C的活性及其内化时细胞内游离Ca2+水平的变化

目的:了解不同毒力的钩端螺旋体(简称钩体)对细胞内游离Ca2 水平的影响及其磷脂酶C(PLC)活性与细胞内游离Ca2 水平的关系.方法:建立问号钩体Vero和J774A.1细胞感染模型.采用fluo-3/AM胞内Ca2 特异荧光标记激光共聚焦技术,检测强毒力的问号钩体黄疸出血群赖型56601株和弱毒力的波摩那群波摩那型56608株及无毒力的双曲钩体Patoc Ⅰ株作用的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 水平.以[3H]PIP2为底物,采用同位素法检测上述3株钩体培养物上清、胞浆和胞膜中PLC的活性.结果:正常Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 基础值分别为(102.3±8.2)%和(105.9±7.3)%,在观察时间内Patoc Ⅰ株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于(102.3±8.2)%～(102.2±8.3)%.问号钩体56601株感染的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 浓度呈双峰型增高,第一峰荧光强度变化百分数分别为(430.5±35.7)%和(747.5±18.5)%,第二峰荧光强度变化百分数分别为(380.6±17.4)%和(804.6±22.4)%.问号钩体56608株感染Vero和J774A.1细胞,其胞内游离Ca2 浓度均呈缓慢的单一坡型升高,其最大荧光强度变化百分数分别为(235.0±19.3)%和(402.4±17.4)%,明显小于56601株问号钩体(P<0.01).问号钩体56601株和56608株及双曲钩体Patoc Ⅰ株的培养物上清、胞浆蛋白和胞膜蛋白成分中均显示PLC活性(P<0.05).结论:不同毒力的问号钩体所感染细胞的胞内游离Ca2 水平及其峰型有明显差异,而且与被感染细胞的种类有关,与PLC活性无关.     

心肌细胞面积与其活力缺乏相关关系

目的:建立培养心肌细胞活力的测定与简便的面积测量方法,观测不同培养条件下,新生大鼠心肌细胞面积与活力的关系.方法:采用一步伊红染色法与NIH Image软件测量心肌细胞面积.MTT比色法测量心肌细胞的A490 nm值,以A490 nm/总细胞数之比作为衡量心肌细胞活力的指标.结果:心肌细胞面积随培养时间延长而增大,随接种密度增加而减小,且有血清培养组的面积明显大于无血清培养组(P<0.01).心肌细胞的A490 nm值与A490 nm/总细胞数之比随培养时间延长均保持不变,当细胞接种密度为4.5×104/cm2时,A490 nm/总细胞数之比达峰值,且无血清培养组的A490 nm值与A490 nm/总细胞数之比皆明显低于有血清组(P<0.01).结论:在培养时间与细胞接种密度不同的培养条件下,培养新生大鼠心肌细胞面积的改变并未对其活力产生明显影响,即面积与活力之间缺乏相关关系.