PAI－1糖基化位点突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡＩ－１）是一种Ｍｒ为５０×１０３的单链糖蛋白，有３７９个氨基酸残基，３个Ｎ型糖基化位点。构建ＰＡＩ－１糖基化突变体，以便研究糖链的功能。用寡核苷酸定位突变技术将３个糖基化位点２０９，２６５，３２９位进行突变，把３个糖基化位点都发生了突变的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ组装到真核表达载体ｐＳＶ２中，得到真核表达质粒ｐＺＨ－ｐ１－Ｍ３Ｅ；在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯｄｈｆｒ－）中进行短暂表达，用发色底物法和夹心ＥＬＩＳＡ方法检测培养液中ＰＡＩ－１的活性和含量。结果：糖基化位点突变的ＰＡＩ－１能在ＣＨＯ细胞中表达，但表达水平及活性较低。非糖基化ＰＡＩ－１的活性和抗原分别为４．３４ＩＵ／ｍｌ和３．１５μｇ／Ｌ结论：用寡核苷酸定位突变方法获得了ＰＡＩ－１糖基化突变体，并且在ＣＨＯ细胞中得到表达。     

汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体的构建

目的构建汉坦病毒糖基化位点的突变体。方法利用基因定点突变的方法构建了5个糖蛋白突变体，即将G1、G2上的天冬酰胺置换为丙氨酸，根据被替换的位置，突变体分别命名为N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。结果构建的5个N-联糖基化位点的突变体，经测序图谱显示原序列中的天冬酰胺（N）均被置换为丙氨酸（A）。结论成功构建了5个糖基化位点的突变体，为进一步研究N-联糖基化的缺失对细胞融合的影响奠定了基础。     

人组织型纤溶酶原激活剂cDNA糖基化位点突变体的构建

构建人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ糖基化位点突变体，为ｔ－ＰＡｃＤＮＡ在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统中的表达提供条件。方法运用ＤＮＡ重组技术，构建ｐＡＨＲ、ｐＡＲＨ质粒，然后应用改良的寡核苷酸诱导定位突变技术，构建ｐＭＡＨＲ、ｐＭＡＲＨ质粒，并用限制性核酸内切酶鉴定、核酸序列分析证实。结果琼脂糖凝胶电泳显示了特异的片段，序列分析证实获得的ｐＭＡＨＲ为Ａｓｎ１１７和Ａｓｎ１８４位点突变的阳性克隆，ｐＭＡＲＨ为Ａｓｎ４４８位点突变的阳性克隆。结论成功地构建了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ糖基化位点突变体。     

N-糖基化对KCNE1功能的影响

目的:探究N-糖基化在KCNE1功能中的作用.方法:根据N-糖基化序列特征"Asn-X-Ser/Thr"分析和N-糖基化特异消化酶实验检测KCNE1是否存在N-糖基化,通过点突变构建N-糖基化位点突变体并通过蛋白质印迹法检测其蛋白表达,细胞免疫荧光染色检测突变体亚细胞定位;免疫共沉淀检测突变体与KCNQ1的相互作用.结果:KCNE1存在N-糖基化,N5和N26是其可能位点;点突变获得KCNE1-N5Q、KCNE1-N26Q和KCNE1-N5,26Q 3个突变体.蛋白质印迹法确定N5和N26为KCNE1的两个糖基化位点;与野生型相比,突变体在细胞内呈现不同程度的蛋白囤积现象,KCNE1-N26Q表现尤为显著,KCNE1-N5,26Q和KCNE1-N5Q则表现略轻;KCNE1 N-糖基化突变体仍能与KCNQ1结合.结论:N-糖基化在KCNE1转运中发挥重要作用,其中N26较为关键;N-糖基化在KCNE1与KCNQ1之间的相互作用中不起重要作用.     

基于质谱的N-糖蛋白分析进展

N-连接糖基化是蛋白质上常见的翻译后修饰，在修饰位点上具有跟其他小分子修饰（如甲基化、乙酰化、磷酸化）同样的宏观不均一性，也就是蛋白质氨基酸序列上具有多个潜在的修饰位点。但相对于小分子修饰单一的结构，N-糖基化修饰具有来自不同单糖组成，序列结构、链接结构、异头异构，立体构象等多个结构维度的数以万计的结构。这使得N-糖基化在修饰位点上具有额外的微观不均一性，也就是说同一个N-糖基化位点可以以一定的化学计量比修饰不同的糖链。N-糖基化修饰以位点和结构特异的方式调控N-糖蛋白的结构和功能，疾病条件下差异表达的N-糖基化需通过位点和结构特异的定量分析来表征。本文主要介绍最新发展水平的基于质谱的位点和结构特异定量N-糖蛋白质组学及在生物医学中的应用。     

重症乙型肝炎病人HBV前C区A83位点的变异

目的：探讨ＨＢＶ前Ｃ区Ａ８３位点的变异和重症肝炎发病机理的关系。方法：应用多聚酶链反应，结合限制性内切酶多态性分析法及末端终止法对３例重症乙型肝炎病毒前Ｃ区变异状况进行了分析，并选择５例其他型乙肝病人作对照。结果：发现３例重症乙型肝炎病人中有２例ＨＢＶ前Ｃ区Ａ８３位点突变；其它５例未发现变异。结论：ＨＢＶ前Ｃ区Ａ８３位点突变和重症肝炎的发生有密切的关系。     

线粒体12SrRNA、ND1基因突变与糖尿病

目的探讨线粒体基因(mtDNA)12SrRNA1382、1442位点及NDI3394、3423位点突变与中国上海地区非肥胖2型糖尿病的关系。方法采用PCR-SSCP及PCR产物直接测序等技术检测mtDNA12SrRNA、NDI片段的突变情况。结果286例非肥胖2型糖尿病患者在12SrRNA1382位点有6例存在A→C的点突变，1442位点8例存在G→A的点突变；242例非糖尿病对照组中，2例存在1382位点A→C，1例存在1442位点G→A的点突变。286例非肥胖2型糖尿病和242例非糖尿病对照组中，未发现NDI3394位点突变，而3423位点的突变率为100％。结论12SrRNA1382、1442位点突变可能增加糖尿病的易感性。mtDNANDI3423位点突变率为100％，可能与人种有关；3394位点不存在突变说明糖尿病的发生在线粒体遗传上存在一定的异质性。     

河北省石家庄地区HBV基因分型及耐药突变分析

目的 探讨石家庄地区经各种核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型、基因耐药突变位点分布和基因耐药情况。 方法 选择CHB患者1 157例,收集患者的基本资料,采用基因测序技术检测患者基因分型和基因耐药突变位点,对检测结果进行统计分析。 结果 石家庄地区CHB患者的基因分型以C型为主,少量为B型。石家庄地区CHB患者中HBV基因分型B型和C型分布比例差异无统计学意义(P＞0.05);不同年龄间HBV基因分型B型和C型分布比例差异有统计学意义（P＜0.05）,41~60岁患者HBV基因分型C型占比最高。未发生基因突变172例,单基因位点突变393例,2个基因位点突变361例,3个基因位点突变174例,4个基因位点突变42例,5个基因位点突变10例,6个基因位点突变3例,7个基因位点突变1例,9个基因位点突变1例;基因型分布特点随突变位点数的增多HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P＞0.05)。发生突变的985例患者共检出1 889个突变位点,检测的14个基因位点中,M204I/V/S、L180M、A181V/T/S突变率为14个基因位点发生突变的前3位,不同基因位点中HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P＞0.05) 。发生突变的985例患者对拉米夫定(lamivudine,LAM),替比夫定(telbivudine,LDT),阿德福韦酯(adefovir,ADV)及恩替卡韦(entecavir,ETV)4种核苷(酸)类似物耐药模式共检出11种,其中对单一药物发生耐药有3种模式,对2种药物发生耐药的有4种模式,对3种药物发生耐药有3种模式,还有一种是对4种药物均发生耐药。不同耐药模式患者HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论 石家庄地区CHB患者感染的基因分型以C型为主,且发生的基因耐药突变以多重耐药为主。     

长爪沙鼠毛色突变的类型及其遗传研究概况

长爪沙鼠毛色的突变迄今已有11种之多，本文综述了有详细特征描述的8种毛色及其遗传机制。这8种毛色分别是野生色，受A位点（刺鼠毛色）和a位点（非刺鼠型黑色）控制；白色，受c位点控制（白化型），等位基因包括ch基因（喜马拉雅型毛色）及cchm基因（中度青紫蓝）；白斑毛色，受Sp位点控制；灰色，受g位点控制；粉眼淡化色，受p位点控制。另外还有无毛突变、扩展位点的突变及淡化位点的突变等毛色出现。因长爪水鼠是一种多用途的实验动物，其毛色研究有着较广阔的前景。     

应用ARMS方法检测苯丙酮尿症致病基因的研究

应用ＡＲＭＳ方法对１６个中国ＰＫＵ家庭进行了常见ＰＡＨ致病基因的筛查。在３２个突变位点中，突变基因（点突变）检出率分别为：Ｅｘｏｎ７突变为５６．２５％、Ｅｘｏｎ６突变为１２．５％，Ｅｘｏｎ１２为６．２５％、Ｅｘｏｎ３为３．１３％和ｉｎｔｒｏｎ４切拼受端突变为９．３８％。由于该方法对突变的检出率已达到８７．５％，且简便、快速、不应用放射性同位素，故可作为产前诊断ＰＫＵ的一种手段。     

应用ARMS方法检测苯丙酮尿症致病基因的研究

应用ＡＲＭＳ方法对１６个中国ＰＫＵ家庭进行了常见ＰＡＨ致病基因的筛查。在３２个突变位点中，突变基因（点突变）检出率分别为：Ｅｘｏｎ７突变为５６．２５％、Ｅｘｏｎ６突变为１２．５％，Ｅｘｏｎ１２为６．２５％、Ｅｘｏｎ３为３．１３％和ｉｎｔｒｏｎ４切拼受端突变为９．３８％。由于该方法对突变的检出率已达到８７．５％、且简便、快速、不应用放射性同位素，故可作为产前诊断ＰＫＵ的一种手段。     

长爪沙鼠毛色遗传的研究进展及其应用前景

长爪沙鼠毛色的突变迄今已有11种之多，本综述了有详细特征描述的8种毛色及其遗传机制。这8种毛色中的野生色，受A位点(刺鼠毛色)和a位点(非刺鼠型黑色)控制；白色，受c位点控制，其等位基因有c^h基因(喜马拉雅型毛色)、c^chm基因(中度青紫蓝)；白斑毛色，受Sp位点控制；灰色，受g位点控制；粉眼淡化色，受p位点控制。另外还有无毛突变、扩展位点的突变及淡化位点的突变等毛色出现。因长爪沙鼠是一种多用途的实验动物，其毛色研究有着较广阔的前景。     

苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因的两个新突变

寻找中国人苯丙酮尿症（ＰＫＵ）新的基因突变点，研究其对ＰＫＵ致病的作用，藉以提高该病的临床诊断率。方法应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增苯丙氨酸羟化酶（ＰＡＨ）基因外显子４区域。对发现的新突变，通过双链ＤＮＡ循环测序方法加以确定。结果２４例ＰＫＵ样品中，７例电泳行为与正常对照有差异，分属两种类型。第一种类型仅有１例，突变单链的两条带，一条位于正常单链的前方，一条滞后。测序结果显示突变发生在内含子４的５′受体位点（ＧＴ→ＡＴ）；第二种类型较多见，突变单链的两条带均位于正常单链前方，测序结果显示突变发生在内含子３中，位于内含子３的３′端第１１个核苷酸，为Ａ→Ｃ取代。结论两种突变类型的第一种发生于切接位点，第二种为一多态性改变（突变频率为２０％）。     

Leber遗传性视神经病变家系线粒体DNA突变检测

目的：探讨Leber遗传性视神经病变(LHON)患者的线粒体DNA(mtDNA)突变。方法：运用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR—SSCP)和DNA序列测定方法，设计4对引物，扩增出含11778、14484、3460三个已知原发突变位点和3394、4136、4160、4216、11696、14459、14482、14498八个已知继发突变位点的4对mtDNA片段，对3个LHON家系30位母系成员的血样进行检测。32份无视力障碍的正常人血样作对照。参照mtDNA序列为剑桥标准mtDNA序列。结果：30位母系成员均含11778位点突变，其中1人合许4164位点突变(A→G)与剑桥标准mtDNA序列对比，30位LHON母系成员和32位正常对照均含有11719位点突变。结论：11778是LHON患者常见的突变位点，4164位点突变可能是新的继发突变或正常人单核苷酸位点多态性。11719位点突变可能是中国人存在的单核苷酸位点多态性。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.     

登革病毒prM蛋白糖基化对ADE的影响

【立论依据及设计思路】 登革病毒的致病作用表现复杂,目前大多数学者均认同Halstead等于1977年提出的抗体依赖增强效应(ADE)学说。现已知与机体免疫应答有关的病毒蛋白包括E蛋白、M蛋白和NS1蛋白。其中,prM蛋白(即M蛋白的前体)的切割是未成熟登革病毒颗粒向成熟病毒颗粒转变的关键步骤。且prM蛋白为黄病毒属的主要表面抗原,能诱导机体产生特异性抗体,研究发现其亦与ADE作用相关。同行及我们的研究均发现 prM抗体是诱导ADE作用发生的主要增强型抗体。prM蛋白本身为糖蛋白,其糖基化位点存在于7、31、52上。目前对于prM蛋白各位点的糖基化作用及其机制不明,特别是其对ADE作用的影响尚无报道。因此,本实验通过构建单个和多个糖基化位点突变的真核表达载体,制备突变后prM抗体,探讨登革病毒prM蛋白N-糖基化位点7、31、52的单个和多个位点的突变重组对其ADE效应的影响。 【实验内容】 通过聚合酶链式反应(PCR)、突变体的设计与构建技术构建重组真核表达载体pPICZαA-prM,通过毕赤酵母表达系统稳定表达并纯化蛋白,免疫小鼠,制备鼠多克隆抗体。用分析型流式细胞仪和荧光定量PCR两种方法检测ADE效应。 【材料】 酵母表达质粒pPICZαA;菌株P. pastoris x33;实验小鼠;C6/36细胞株;LoVo 细胞株。 【可行性】 预期结果:(1)prM蛋白的各位点的糖基化都将对病毒的ADE效应有所影响,且糖基化位点越多,对ADE效应影响越大。(2)prM蛋白部分位点的糖基化将对病毒的ADE效应有所影响,且不同位点影响不同。(3)prM蛋白3个位点的糖基化对病毒的ADE效应都没有影响。 【创新性】 登革病毒是广泛流行于热带亚热带危害较大的虫媒病毒。人们对登革出血热和登革休克综合征机制未明确。其次,从蛋白糖基化角度研究探讨prM蛋白参与ADE效应的可能机制尚未见报道。本研究项目有助于进一步探讨DHF/DSS的发生机制,并能为新型登革热病毒疫苗与药物的研发提供新方向或者新思路。     

人组织型纤溶酶原激活剂cDNA糖基化位点突变体的构建

目的 构建人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ糖基化位点突变体，为ｔ－ＰＡｃＤＮＡ在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统中的表达提供条件。方法 运用ＤＮＡ重组技术，构建ｐＡＨＲ，ｐＡＲＨ质粒，然后应用改良的寡核苷酸诱导定位突变技术，构建ｐＭＡＨＲｐＭＡＲＨ质粒，并用 限制性核酸内刀酶鉴定，核酸序列分析证实。结果 琼脂糖凝胶电     

多位点定点突变的新策略

定点突变是研究蛋白质结构与功能、基因调控序列、基因表达和载体修饰等的一种非常有用的技术。重叠延伸PCR（overlap extension PCR，OEPCR）可以方便的实现体外多点的定点突变，传统的OEPCR在引入n个突变位点时需要进行3n次PCR反应，本文介绍一种OEPCR的改良方法，在对n个位点突变时只需要进行2n＋1次PCR反应。本方法与传统的OEPCR相比，在引入n个突变位点时可以减少n-1次PCR反应。在同时进行多个位点突变时，不仅减少了实验时间，更重要的是减少因PCR反应发生非特异性突变的概率。我们利用本文介绍的方法成功在人骨形态发生蛋白7成熟肽序列引入3个突变位点和在人骨形态发生蛋白4成熟肽序列引入2个突变位点。     

PD-1/PD-L1的糖基化修饰对肿瘤免疫治疗影响的研究进展

 糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,程序性细胞死亡分子1（programmed cell death-1,PD-1）/程序性细胞死亡分子配体1（programmed cell death ligand-1,PD-L1）存在多个N-糖基化位点,其糖基化修饰显著影响免疫治疗的疗效。PD-1共有4个N-糖基化位点,分别为N49、N58、N74和N116。核心岩藻糖基转移酶8（fucosyltransferase 8,FUT8）可催化PD-1的核心岩藻糖基化。一些针对PD-1的N58位点糖基化修饰的单克隆抗体可以有效阻断PD-1/PD-L1相互作用。此外,阻断嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T）PD-1的N74糖基化修饰可以增强其杀伤效应。PD-L1同样含有4个糖基化位点,分别为N35、N192、N200和N219。一些重要的调控分子可以抑制或促进PD-L1的糖基化修饰,产生一定生物学效应。本文通过综述糖基化修饰对PD-1/PD-L1分子表达及功能的影响,期望为提高肿瘤免疫治疗的疗效提供基于糖基化修饰的新策略。     

波形蛋白糖基化突变质粒对PC12细胞分化的影响研究

目的 构建波形蛋白(vimentin)糖基化突变质粒并研究其对大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞)分化的影响。方法 构建波形蛋白糖基化突变质粒,进行凝胶电泳并测序鉴定;采用空载质粒pcDNA3.1b(对照组)、波形蛋白质粒(Vim组)、波形蛋白糖基化突变质粒(Vim mut组)转染PC12细胞,分别在外源性寡糖化合物(Cyclo-ManN pro)处理与不处理条件下培养0、3 d,进行细胞分化记录与定量分析(细胞平均神经突长度及分化神经突细胞百分比)。结果 成功构建含糖基化位点突变位点19(T-G)、97(A-G)、100(T-G)的波形蛋白基因片段(大小约为1 404 bp)重组质粒。Cyclo-ManN pro处理前与处理后,Vim组的PC12细胞平均神经突长度与分化神经突细胞百分比均大于对照组和Vim mut组[(61.98±19.03)μm vs.(51.09±14.45)μm、(51.49±14.78)μm,(6.60±0.25)%vs.(4.27±0.18)%、(4.76±0.33)%;(78.01±18.31)μm vs.(69.98±12.85)μm、(68.45±13....