抗人结肠癌单链抗体CL-3在大肠杆菌中的表达、复性和纯化

目的:为得到单链抗体高效表达,我们对抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究.方法:以重组质粒表达载体 pJW2-CL-3 转化大肠杆菌DH5α,重组克隆在培基中温控诱导,以包涵体形式表达单链抗体.包涵体经溶解、复性、纯化后,以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白,ELISA法鉴定单链抗体的免疫活性.结果:42 ℃诱导 5 h 蛋白表达量占菌体蛋白的 30%. 8 mol/L 尿素可将包涵体大部分溶解,稀释于复性缓冲液中静置 10 ℃ 48 h 以上可使包涵体蛋白复性.纯化峰经鉴定, 27 KD 处表达之蛋白为带有E-tag的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,并证明其具有与抗原CEA特异性结合的功能,免疫活性与亲代抗体 CL-3 相似.结论:本研究获得的以包涵体形式在大肠杆菌中表达的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,具有与亲代抗体相似的免疫活性,为高效表达单链抗体,用于肿瘤的诊断和治疗提供了依据.     

重组IL-33融合表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的：构建人白介素-33（IL-33）硫氧还蛋白融合表达载体,高效表达IL-33蛋白。方法：采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞（PBMC）mRNA中扩增IL-33 cDNA;将扩增的IL-33目的基因与融合表达质粒pET102/D-TOPO连接,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。结果：扩增的IL-33 cDNA大小为800bp左右。表达的IL-33融合蛋白大小为45kDa左右,Western blotting鉴定显示表达的蛋白正确,为IL-33目的蛋白。但表达的大部分蛋白为无生物学活性的包涵体,在后续对表达蛋白进行纯化的同时对蛋白进行了复性,得到了复性后具有生物学活性的IL-33蛋白。结论：成功制备了具有生物学活性的IL-33蛋白。     

重组人骨形成蛋白-7成熟肽的表达、纯化及活性的研究

目的:研究重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性,为其实际应用打下基础.方法:将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2-B7m,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达;通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白;用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性,用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12-K4检测其活性.结果:成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2-B7m;42℃诱导5 h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白40.3%,表达产物以包涵体形式存在.包涵体经洗涤、离子交换层析纯化,目的蛋白纯度至少在96.0%以上.Western blot实验证实其抗原性,细胞株C2C12-K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP-7m有较强的活性.结论:成功地在E.coli中表达了hBMP-7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

肿瘤血管导向肽与人突变IL-2融合蛋白的克隆、表达及生物学活性分析

目的获得具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽（NGR）融合表达的突变人IL-2蛋白.方法将突变人IL-2与NGR的融合基因重组到表达载体pET-22b（＋）并转化E.coli BL21（DE3）,测序正确后,IPTG诱导表达,并对产物进行纯化、复性和鉴定.结果目的蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%以上,Western blot分析显示纯化后的目的蛋白具有免疫结合活性,CTLL-2细胞增殖实验证明具有生物学活性.结论具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽融合表达的重组人IL-2蛋白可成功地克隆并表达,为进一步的肿瘤导向治疗打下基础.     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。     

变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定

目的 探寻诱导谷胱甘肽转移酶(GST)与Cavl.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法.方法 在E.coli BL21中转化入pGEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达,采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯化GST-CT1融合蛋白,用Pull down assay方法鉴定GST-CT1融合蛋白及其生物活性.结果 应用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER能够分离得到高纯度的易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白,且分离纯化的GST-CT1融合蛋白具有与钙调蛋白结合的生物活性.结论 操作简易的GST包涵体变性复性法能够针对易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白进行分离和纯化,且得到的蛋白具有生物学活性.     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

小鼠IL-4重组质粒的构建及目的蛋白的表达和纯化

目的 构建重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并鉴定.方法 将优化后的小鼠IL-4 cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a (+)上,获得重组质粒pET32/rmIL-4,转入BL21(DE3)中经IPTG诱导表达得到包涵体.经复性处理后,依次用阴离子交换柱和分子筛纯化蛋白.对纯化得到的蛋白用Western blot检验免疫学特异性,用mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖实验和动物实验测定其生物学活性.结果 经酶切和测序证实重组质粒pET32/rmIL-4构建成功.诱导得到的包涵体用3 mol/L盐酸胍溶液洗涤后溶于加有β-巯基乙醇的7 mol/L盐酸胍溶液中变性,在pH9.5的条件下梯度透析复性.纯化出的蛋白经Western blot鉴定,能与抗小鼠IL-4抗体特异性结合;经细胞和动物实验鉴定,rmIL-4蛋白具有生物学活性,能刺激mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖,使小鼠体内细胞因子发生从TH1到TH2的漂移.结论 成功制备了高纯度、具有生物学活性的小鼠IL-4,为进一步研究其生物学功能提供了条件.     

重组THANK诱导表达和变性、复性及纯化

目的 :获得较纯的具有生物学活性的 THANK蛋白。方法 :THANK基因在大肠杆菌中高效表达 ,菌体超声破碎后 ,以洗涤剂反复洗涤包涵体。包涵体经 8mol/L尿素变性溶解后 ,再用 Sephacryl S- 2 0 0凝胶过滤层析初步纯化 ,对重组蛋白浓度、氧化还原剂等复性参数进行优化和选择 ,将蛋白稀释复性。复性后组分经 Q Sapharose Fast Flow离子交换层析再次纯化 ,最后以 Sep hadex G- 2 5脱盐。 结果 :得到了纯度 >97%、具有一定生物学活性的 THANK蛋白。 结论 :THANK蛋白变性、复性及纯化方法的建立 ,为 THANK活性蛋白的制备提供了依据     

人DC-SIGN的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化和鉴定

目的:获得纯化的DC-SIGN蛋白,为揭示DC-SIGN参与抗原提呈的机制,探讨宿主细胞DC-SIGN蛋白和HIV、HCV、结核杆菌等病原体的相互作用机制奠定基础。方法:人DC-SIGN的cDNA克隆到pGEX-KG表达载体上,转化入E.coli中,通过IPTG诱导,过度表达GST-DC-SIGN融合蛋白,并使用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱提取得到纯化的DC-SIGN蛋白,最后通过SDS-PAGE和Western Blot方法进行检测和鉴定。结果:酶切鉴定证实DC-SIGN基因已插入原核表达载体pGEX-KG。重组表达质粒pGEX-KG-DC-SIGN在大肠杆菌BL21中成功表达了DC-SIGN融合蛋白,其分子质量约为44 kU。结论:成功构建DC-SIGN原核表达重组质粒,并提取纯化出DC-SIGN原核蛋白,为下一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础。     

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的：观测和鉴定人钠／二羧基转运蛋白2(hSDCT2)在大肠杆菌中的表达，并分离、纯化其蛋白产物。方法：应用：DNA重组技术，构建重组表达质粒pGEX-hSDCT2；IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B亲和层析纯化GST-hSDCT2，经Factor Xa酶切和二次亲和层析后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting进行鉴定。结果：成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体，SDS-PAGE及Western Blotting显示GST-hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞，蛋白产量约占菌体总蛋白量的25％。经酶切及二次纯化后，获得纯化的hSDCT2蛋白。结论：人钠／二羧基转运蛋白2可在大肠杆菌中稳定表达。     

一种新型原核表达载体的构建及应用

目的 利用基因重组技术构建一种新型原核表达载体，使之表达带有His和GST标签的融合蛋白。方法 以质粒pGEX为模板，将PCR扩增出的GST基因插入到载体pQE-30中构建pQE-30-GST，经IPTG诱导GST蛋白表达并用Westernblot鉴定。分别将huNSEl88-354、huPrP23-91和huDoppe124-152基因插入pQE-30-GST，转化E-coliM15并诱导表达融合蛋白。采用NiSepharose4B和(或)Glutathione Sepharose 4B纯化融合蛋白，并用羟胺裂解。结果 重组表达载体pQE-30-GST可有效地表达各种His-GST融合蛋白，并可用两种方法纯化不同大小的融合蛋白；利用羟胺可将目的蛋白肽段与His-GST蛋白有效裂解。结论 新型原核表达载体pQE-30-GST可进行多种蛋白质的表达，表达的蛋白质可经两种方法纯化以提高蛋白质的纯度，融合蛋白可经羟胺裂解获得目的蛋白质单体。     

人VIGILINN端融合蛋白的表达及亚细胞定位

目的 原核表达人VIGILIN N端基因,制备抗人VIGILIN的多克隆抗体,对人VIGILIN作亚细胞定位.方法 用PCR扩增人VIGILIN基因N端,克隆到表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达.产物经 Glutathion Sepharose 4B纯化后免疫新西兰白兔制备抗人VIGILIN N端融合蛋白抗体,采用ELISA和Western blot鉴定抗体的效价及特异性.通过细胞免疫荧光染色,观察VIGILIN在细胞中的分布.结果 在28 ℃、1 mmol/L IPTG诱导3 h的最优条件下成功表达GST-VIGILIN N端融合蛋白,抗体ELISA滴度为1:16000,Western blot证实抗体特异性较高,VIGILIN在细胞质和核中均有分布,核中的分布集中在核膜内侧和靠近DAPI染色显著的区域. 结论 成功表达人VIGILIN N端融合蛋白和制备兔抗人VIGILIN抗体,并应用于亚细胞定位,为研究人VIGILIN的性质和功能奠定基础.     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。     

IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的：研究人IL-18成熟蛋白（mhIL-18）在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法：利用PCR方法扩增出mhIL-18基因，构建融合型表达载体pPTYB1-IL18，转化入大肠杆菌ER2566中，IPTG诱导表达，优化表达条件，超声裂解细胞，采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达，亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果：成功构建载体并转化入ER2566后，经IPTG诱导，表达量可占菌体总蛋白的26％以上，其中80％以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95％，具有显著的IL-18的生物学活性。结论：成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18，并具有显著的IL-18的生物学活性。     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

Construction and expression of the fusion vector of His-tagged human ARPC2 gene]

OBJECTIVE: To construct the expression vector of His-ARPC2 fusion protein and obtain its expression and purification in E. coli. METHODS: ARPC2 cDNA codon region was amplified by PCR from human liver cDNA library and cloned into pET-14b vector following the routine procedures. After identification by enzyme digestion, PCR and sequencing, the positive clones were transformed into BL21 (DE3) competent cells, and the expression of His-ARPC2 fusion protein was induced with IPTG and further purified by Ni-NTA affinity chromatography. RESULTS: The constructed His-ARPC2 fusion protein vector was highly efficiently expressed in E. coli. With Ni-NTA affinity chromatography, a purified His fusion protein with relative molecular mass of approximately 36 000 was obtained. CONCLUSION: The expression vector of His-ARPC2 fusion protein is constructed, expressed and purified under non-denaturing conditions, which may significantly facilitate future study of the physiological functions of ARPC2 and characterization of its interaction proteins.     

截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达

目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3.1 VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6 1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX 5X，在E.coli中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。对表达产物进行SDS PAGE和Western blot分析。通过改变宿主菌、培养基、IPTG浓度和培养温度等条件，提高目的蛋白的可溶性表达水平，使用GST Sepharose 4B亲合层析进行初步纯化。结果：选定VP6 氨基酸12～143片段为目的蛋白， PCR扩增其396?bp的编码基因片段，构建出pGEX 5X VP6 1。将该重组质粒转化E.coli后，SDS PAGE和Western blotting 分析均显示，含有截短VP6蛋白的重组融合蛋白GST::VP6 1在E.coli中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％。该蛋白主要以包涵体形式存在，经条件优化，最终通过低浓度IPTG、低温诱导提高重组蛋白的可溶性表达水平，GST亲和层析可对其进行初步纯化。结论：VP6 1蛋白在E.coli中可被高效表达和纯化，为下一步制备抗VP6的特异性单克隆抗体并用于免疫检测打下基础。