红花黄素腹腔注射联合BMSCs移植对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的 探讨红花黄素腹腔注射联合骨髓阳J充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤保护作用及其机制.方法 体外分离、培养BMSCs;SD大鼠45只,改良Allen法制备脊髓损伤模型,随机分为3组:A组、B组、C组.A组腹腔注射红花黄素治疗(40 mg/kg),B组和C组注射等体积的生理盐水,每日1次,共14 d;A组和B组损伤局部行BMSCs移植(6×106/60μl),C组注射等体积的PBS液.于术后1 d、2 d、3 d、4 d、7 d取材检测损伤处超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和细胞凋亡,术后1 d和7 d、14 d、21 d、28 d采用改良BBB评分法进行行为学检查评分.结果 术后随着时间的推移,各组BBB评分得分均增高,术后28 d时A组得分为(19.33±1.37),B组为(15.83±1.17),C组为(9.0±1.41),A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).SOD活性在相同时间点,均有A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05);MDA含量在术后2 d、3 d、4d A组低于B组和C组(P＜0.05),且有A组低于B组(P＜0.05).术后3 d时各组细胞凋亡达高峰:A组(72.83±13.38),B组(96.33±6.35),C组(219.33±28.64);之后各组细胞凋亡数逐渐减少,至术后7d:A组(3.67±3.72),B组(16.33±5.54),C组(86.17±12.27);除术后第1天,在相同时间点,细胞凋亡数有A组少于B组和C组,B组少于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 红花黄素和BM-SCs移植均能抑制损伤脊髓局部自由基生成、脂质过氧化和细胞凋亡,减轻继发损伤,两者联合具有累加协同效应,有助于脊髓损伤大鼠肢体运动功能的恢复.     

红花黄素腹腔注射联合BMSCs移植对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的 探讨红花黄素腹腔注射联合骨髓阳J充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤保护作用及其机制.方法 体外分离、培养BMSCs;SD大鼠45只,改良Allen法制备脊髓损伤模型,随机分为3组:A组、B组、C组.A组腹腔注射红花黄素治疗(40 mg/kg),B组和C组注射等体积的生理盐水,每日1次,共14 d;A组和B组损伤局部行BMSCs移植(6×106/60μl),C组注射等体积的PBS液.于术后1 d、2 d、3 d、4 d、7 d取材检测损伤处超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和细胞凋亡,术后1 d和7 d、14 d、21 d、28 d采用改良BBB评分法进行行为学检查评分.结果 术后随着时间的推移,各组BBB评分得分均增高,术后28 d时A组得分为(19.33±1.37),B组为(15.83±1.17),C组为(9.0±1.41),A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).SOD活性在相同时间点,均有A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05);MDA含量在术后2 d、3 d、4d A组低于B组和C组(P＜0.05),且有A组低于B组(P＜0.05).术后3 d时各组细胞凋亡达高峰:A组(72.83±13.38),B组(96.33±6.35),C组(219.33±28.64);之后各组细胞凋亡数逐渐减少,至术后7d:A组(3.67±3.72),B组(16.33±5.54),C组(86.17±12.27);除术后第1天,在相同时间点,细胞凋亡数有A组少于B组和C组,B组少于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 红花黄素和BM-SCs移植均能抑制损伤脊髓局部自由基生成、脂质过氧化和细胞凋亡,减轻继发损伤,两者联合具有累加协同效应,有助于脊髓损伤大鼠肢体运动功能的恢复.     

粒细胞集落刺激因子动员BMSCs归巢治疗大鼠脊髓损伤的疗效观察

目的观察粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)动员BMSCs归巢对大鼠脊髓损伤的治疗效果,评估G-CSF动员BMSCs治疗脊髓损伤的可行性。方法将24只成年健康雌性SD大鼠术前12 h于鼠尾静脉注射绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的BMSCs(GFP-BMSCs),并随机分为假手术组(A组)、假手术+G-CSF组(B组)、脊髓损伤组(C组)、脊髓损伤+G-CSF组(D组),每组6只。C、D组采用T10水平脊髓半切法建立脊髓损伤模型,A、B组仅行椎板切除,不损伤脊髓;术后1 h B、D组分别注射G-CSF(10μg/kg·d),连续注射3 d;A、C组注射等量生理盐水。术后1、3、7、14、21、28 d采用BBB评分行大鼠双后肢神经功能评估,并采用ELISA法检测血清TNF-α和基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)表达。术后28 d处死大鼠取脊髓样品行免疫组织化学染色观察细胞因子SDF-1、BDNF、VEGF和TNF-α表达,免疫荧光染色观察GFP-BMSCs阳性细胞及双染荧光黄色的GFP/神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)阳性神经元细胞和GFP/胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性神经胶质细胞数;并采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果术后各时间点A、B组BBB评分较术前无明显变化;术后1 d,C、D组BBB评分降至最低,后逐渐上升。除术后1 d外,其余各时间点D组BBB评分均显著高于C组(P0.05)。术后3、7、14、21、28 d,C、D组TNF-α和SDF-1含量均明显高于A、B组(P0.05);但D组各时间点TNF-α含量显著低于C组,SDF-1含量显著高于C组(P0.05)。免疫组织化学染色示,术后各时间点C、D组SDF-1、BDNF、VEGF和TNF-α表达均显著高于A、B组(P0.05);D组SDF-1、BDNF、VEGF表达显著高于C组,TNF-α表达显著低于C组(P0.05)。免疫荧光染色示,C、D组GFP-BMSCs、GFP/NeuN、GFP/GFAP阳性细胞数均显著多于A、B组,D组显著多于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。TUNEL法检测示,C、D组凋亡细胞数目显著低于A、B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 G-CSF可以动员BMSCs归巢至大鼠脊髓损伤部位并参与修复,其作用可能与其下调TNF-α减少细胞凋亡,上调SDF-1、BDNF、VEGF促进BMSCs迁移有关。     

重组人红细胞生成素治疗大鼠急性脊髓损伤的用药时间窗探讨

目的:探讨腹腔注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)治疗大鼠急性脊髓损伤(ASCI)的用药时间窗.方法:采用显微血管夹夹伤雌性SD大鼠T10脊髓建立脊髓急性损伤模型,将造模成功后的40只大鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组8只.A、B、C、D组分别于损伤后即刻、1h、3h和6h腹腔注射rHuEPO 50001U/kg,E组损伤后立即腹腔注射等量生理盐水,作为对照组.各组大鼠于术后1d、3d、5d、7d进行BBB运动学评分,并于术后3d、7d用TUNEL染色和caspase-3免疫组化染色法检测各组大鼠脊髓神经细胞凋亡情况.结果:术后1d、3d各组大鼠BBB评分无统计学差异(P>0.05);5d时A、B、C三组BBB评分均高于D、E两组(P<0.01),A、B、C 三组间与D、E组间无统计学差异(P>0.05);7d时D组BBB评分高于E组(P<0.01),但低于A、B、C三组(P<0.01),而A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05).损伤后3d、7d,A～D组的TUNEL、caspase-3染色阳性细胞均高于E组,且损伤后7d时D组TUNEL染色阳性细胞数高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异;损伤后3d.D组caspase-3染色细胞阳性率高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05),损伤后7d,A～D组间无统计学差异(P>0.05).结论:大鼠ASCI后3h内给予rHuEPO可以显著改善运动功能恢复情况,并抑制伤后脊髓神经细胞凋亡现象的发生;伤后6h给药效果较差.     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF基因和血管生成的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后运动功能恢复、VEGF基因表达和血管生成的影响,探讨BMSCs治疗SCI的机制。方法取5只4周龄Wistar雄性大鼠骨髓,分离培养BMSCs,取第3～4代细胞进行实验。取Wistar雌性成年大鼠87只,体重220～250 g,随机分为假手术组(A组,21只)、DMEM注射组(B组,33只)和BMSCs移植组(C组,33只)。A组仅咬除T8～10棘突和椎板;B、C组参照Nystrom方法制备T8～10 SCI模型,伤后30 min C组注射BMSCs(共3.0×105个),B组注射等量DMEM。于术后3、7、14、28 d采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评价大鼠后肢运动功能;术后3、7、14、28 d应用Ⅷ因子免疫组织化学染色行微血管计数观测血管生成情况;术后1、3、5 d应用RT-PCR法检测损伤脊髓组织内VEGF mRNA的表达。结果术后各时间点B、C组大鼠后肢功能随时间延长均有不同程度恢复,各时间点BBB评分与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后28 d,C组BBB评分显著高于B组(P<0.05),其余时间点B、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后3 d,B、C组损伤周围区脊髓灰质腹侧角内微血管数目明显少于A组(P<0.05);术后7、14、28 d与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组术后3、7 d脊髓灰质腹侧角内微血管数目与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);但术后14、28 d显著高于B组(P<0.05)。各组术后各时间点损伤周围区脊髓白质内的微血管数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测示,A组大鼠脊髓组织内VEGF mRNA表达水平较低。B、C组与A组相比,于术后1 d开始VEGF mRNA表达增加,3 d时表达达峰值,5 d时表达下降但仍高于A组,各时间点与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);C组各时间点均高于B组(P<0.05)。结论 BMSCs可能通过上调VEGF基因表达和增加脊髓内新生血管而促进大鼠SCI后运动功能恢复。     

葡萄糖原合成酶-3β抑制剂促进大鼠脊髓损伤后轴突再生与下肢功能恢复的研究

目的 探讨葡萄糖原合成酶-3β(GSK-3β)的抑制剂噻二唑-8(TDZD-8)对大鼠脊髓损伤后轴突再生与下肢功能恢复的影响. 方法 健康成年雌性SD大鼠108只,均制作T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型,并在L4平面蛛网膜下腔插入注药导管后随机分为3组(n=36):TDZD-8治疗组(A组)经注药导管注入1 mg/(kg·d)的TDZD-8,PBS治疗组(B组)经注药导管注入60 μL/d的磷酸盐缓冲液,C组为空白对照组.各组均在瘫痪后lh开始注射,连续注射3周.注射后2 h、4h、8h、24 h、7 d,TUNEL法观察神经元细胞凋亡的表达;注射后7、14、28 d,兔抗生长相关蛋白-43(GAP-43)的表达;注射后1、2、3、6、8、12周,Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分评估下肢运动功能恢复情况;注射后8周,采用免疫荧光法观察损伤节段轴突再生情况. 结果 脊髓损伤后2h观察到凋亡细胞,注射后2h、4h、8h、24 h、7 dA组的神经元细胞凋亡数明显低于B、C组,各组细胞凋亡表达在注射后8h达到高峰,此后逐渐减少,差异均有统计学意义(P＜0.05);注射后7、14、28 d,A组的GAP-43表达面积明显高于B、C组,各组GAP-43表达在损伤后14 d达到高峰,此后逐渐减少,差异均有统计学意义(P ＜0.05);从注射后3周开始,A组的BBB评分明显高于B、C组,差异有统计学意义(P＜0.05).A组有较多再生神经纤维穿过损伤部位,而B、C组只有少许再生神经纤维穿过损伤部位,注射后8周A组阳性标记的皮质脊髓束纤维面积明显高于B组、C组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 TDZD-8能够抑制细胞凋亡,减少继发性脊髓损伤,上调GAP-43的表达,促进轴突再生、延长,促进大鼠后肢功能恢复.     

低氧预处理骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性脊髓损伤的实验研究

目的:研究低氧预处理骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植对大鼠急性脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)治疗效果的影响并探讨其可能的机制。方法:转绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的SD大鼠10只,体重55.6±4.2(50～60)g,通过改良全骨髓贴壁法从大鼠骨髓中分离培养大鼠BMSCs并进行并进行细胞纯度和分化能力鉴定。应用0、10、50、100、200和300μM的二氯化钴(CoCl2)低氧预处理BMSCs后,通过CCK-8法检测低氧对细胞增殖的影响,细胞血清剥夺培养0、6、12和24h后,流式细胞法检测血清剥夺对细胞凋亡的影响,Transwell法检测低氧对BM-MSCs培养6、12、24h后细胞迁移的影响,流式细胞法检测低氧对细胞凋亡的影响,PCR法检测相关分子通路,找出合适的低氧处理条件。体内实验,使用Allen法垂直打击建立SCI模型,实验分为A组(假手术组)、B组(对照组)、C组(BMSCs组)和D组(H-BMSCs组)(n=20)。A组的大鼠进行外科手术,但不锤击脊髓,B、C和D组均进行锤击脊髓行SCI造模和蛛网膜下腔注射注射生理盐水和低氧预处理前后的BMSCs。通过术前,术后1、3、7、10、14、21、28天BBB评分研究大鼠的神经功能恢复,术后72h免疫荧光染色法确定移植细胞的存活情况和小胶质细胞激活情况,术后72h和28d HE染色评估脊髓组织病理损伤情况。结果:CCK-8结果表明CoCl2浓度越高对BMSCs增值能力抑制越大,100μM CoCl2培养24h可以明显降低BMSCs增殖(P0.05),提高BMSCs的凋亡(P0.05),但能够显著增强预处理后BMSCs 6和12h后的细胞迁移的数量(P0.05),显著降低细胞血清剥夺培养24h后细胞凋亡率(P0.05)。动物实验,与B组相比,C组的治疗可显著提高14d、21d和28d的BBB评分(P0.05)。D组的BBB评分在21d和28d时明显高于C组(P0.05)。HE染色结果显示,BMSC移植可以显著减少脊髓损伤部位细胞死亡,出血和炎性细胞浸润,而与C组相比,D组中的脊髓病理学损伤更轻微。细胞移植72h后,在C组和D组中均可见绿色荧光细胞,且绿色荧光的细胞数量D组(254.0±35.5)中明显高于C组(143.2±22.3,P0.05)。SCI 72h后Iba-1免疫荧光染色显示,与B组(759.0±114.3)相比,BMSC(544.8±37.1)和D组(422.4±56.0)小胶质细胞数明显减少(P0.05),且D组抑制小胶质细胞激活的能力更强(P0.05)。结论:低氧预处理BMSCs通过提高移植细胞的存活率,增强抑制小胶质细胞的激活能力,提高了SCI后大鼠神经功能的恢复,机制为低氧预处理能够增强细胞的抗损伤和迁移能力,是一种提高BMSCs移植治疗SCI疗效的有效手段。     

半乳凝素-1对脊髓损伤大鼠室管膜区细胞增殖的影响

【摘要】 目的：观察成年大鼠脊髓损伤后半乳凝素-1对室管膜区细胞增殖的影响,为进一步研究脊髓损伤后内源性神经干细胞的自身修复作用提供理论依据。方法：72只健康雌性SD大鼠,1.5月龄,体重190~220g,分为假手术组（A组）、模型组（B组）和治疗干预组（C组）,每组24只。B、C两组均在T10节段制作急性脊髓损伤模型,A组仅行椎板切除。C组术后24h经枕大池蛛网膜下腔注入20μl（0.2g/L）半乳凝素-1,单次给药;其余两组仅给予等量的生理盐水。术后1d、7d每组进行后肢运动功能BBB评分,术后7d每组行免疫组织化学方法检测脊髓室管膜区BrdU和巢蛋白（Nestin）阳性细胞的表达变化情况。结果：术后1d后肢运动功能BBB评分A组为21.00±0.00分,B组为1.65±0.05分,C组为1.59±0.14分,B、C两组比较无显著性差异（P>0.05）。术后7d后肢运动功能BBB评分,C组（12.98±0.15）、B组（6.38±0.21）与A组（21.00±0.00）比较均有显著性差异（P<0.05）;C组与B组比较有显著性差异（P<0.05）。术后7d,A组脊髓室管膜区免疫组化BrdU和Nestin阳性细胞相对值分别为0.02±0.01和0.01±0.00,仅见极少量;B组分别为0.41±0.14和0.35±0.13,与A组比较均明显增加（P<0.05）;C组分别为1.02±0.25和0.88±0.20,均比B组增加更加明显（P<0.05）。术后7d,A组脊髓室管膜区免疫组化BrdU和Nestin积分光密度值分别为17.12±3.47和10.59±2.11,B组（32.43±4.96,24.95±7.43）和C组（45.11±6.01,36.99±5.29）均高于A组（P<0.05）,但C组高于B组（P<0.05）。结论：大鼠脊髓内室管膜区细胞具有潜在的增殖和分化能力,在损伤后该功能可被激活,半乳凝素-1对室管膜区细胞的增殖和分化具有明显促进作用。     

芬苯达唑促进大鼠脊髓损伤后病理和功能恢复的实验研究

【】 目的 观察芬苯达唑对脊髓损伤大鼠CD45R阳性B细胞、IgG免疫反应以及运动功能缺损的影响。方法 将72只成年雌性SD大鼠随机分为3组：A、假手术组,B、模型对照组,C、芬苯达唑组。A、B组术前4周给予常规啮齿动物饲料喂食(含18%蛋白质的饲料),C组术前4周给予加入芬苯达唑的常规啮齿动物饲料喂食。用Allen法构建脊髓损伤模型,分别于术后第1、7 、14 、21 、28天行Basso-Beatti-Bresnahan (BBB)运动功能评估,利用免疫组化检测脊髓组织中 IgG表达水平,利用免疫荧光检测脊髓损伤部位 CD45R阳性细胞信号水平。结果 术后第7d 各组BBB评分分别为：21.00±1.35、5.36±0.37、8.45±0.52;术后第14d 各组BBB评分分别为：21.00±1.10、7.76±0.71、11.44±0.78;术后第21d各组BBB评分分别为：21.00±0.74、10.39±0.88、14.32±0.94;术后第28d各组BBB评分分别为：21.00±0.56、14.12±0.99、18.33±1.21,芬苯达唑组各个时间点BBB评分高于模型对照组 ,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化检查证实脊髓损伤后损伤部位脊髓 IgG水平显著升高,与假手术组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。第7天开始,芬苯达唑组各个时间点 IgG免疫反应水平低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。芬苯达唑组各个时间点脊髓损伤部位CD45R阳性细胞信号水平低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 芬苯达唑预处理可降低脊髓组织中 IgG表达水平及脊髓损伤部位CD45R阳性细胞信号水平,促进脊髓损伤后的神经功能恢复。     

FTY720对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的影响及相关机制

目的:观察FTY720对大鼠急性脊髓损伤(ASCI)后神经功能的影响,并探讨其相关机制。方法:168只雌性SD大鼠,随机分成A、B、C三组,每组56只,A组(假手术组)大鼠麻醉后仅切除T9椎板,不打击脊髓,缝合后立即以0.3ml生理盐水灌胃。B、C组采用Allen′s法制作T9脊髓损伤模型,B组(对照组)以0.3ml生理盐水灌胃,C组(治疗组)以FTY720按3mg/kg生理盐水稀释至0.3ml灌胃。每组取8只大鼠分别于术后1d、3d、7d、14d、21d行斜板试验及BBB评分。分别于术后6h、12h、24h、48h、72h、7d、21d处死大鼠,每个时间点每组8只,取损伤段(A组取相应部位)脊髓行超薄切片,HE染色观察各组脊髓坏死情况、炎细胞浸润情况、胶质瘢痕形成情况及脊髓空洞大小,并计数各组术后12h淋巴细胞数、术后12h与72h炎性细胞、术后7d胶质瘢痕区细胞,计算伤后21d脊髓空洞面积与脊髓面积比值;取术后6h、12h、24h、72h的切片行SP免疫组化染色观察caspase-3表达及Tunel染色观察细胞凋亡情况,计算相应时间点免疫组化染色阳性细胞比值和凋亡指数。所有数据以SPSS 13.0进行统计学分析。结果:B、C两组各时间点斜板实验及BBB评分均较A组同时间点差(P<0.05),在术后1d时B、C组之间无显著性差异(P>0.05),术后3d、7d、14d、21d时C组优于B组(P<0.05)。HE染色结果显示A组各时间点脊髓形态正常;B、C组脊髓术后6h可见脊髓内出血、血肿形成,术后12h~48h脊髓进行性水肿、损伤中心区出现液化坏死,伴有炎细胞浸润,以中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞为主,至术后72h,损伤中心区形成无组织结构空洞,空洞周围有大量炎细胞浸润,以小胶质细胞/单核细胞为主;术后12h及72h,B组炎细胞浸润程度明显重于C组(P<0.05),术后12h C组淋巴细胞浸润程度相对B组明显减少(P<0.05),术后7d,脊髓水肿减轻,空洞周围形成胶质瘢痕,胶质瘢痕细胞计数B组明显大于C组(P<0.05),术后21d脊髓空洞形成,脊髓空洞比值B组明显大于C组(P<0.05)。SP免疫组化染色和Tunel染色结果显示A组各时间点几乎见不到caspase-3和细胞凋亡表达阳性细胞,B、C组脊髓损术后6h即可见凋亡细胞,到术后24h达高峰,而后随术后时间延长而逐渐减弱,但是仍然保持在较高水平;caspase-3表达与细胞凋亡同步,各时间点C组caspase-3表达阳性细胞比值和细胞凋亡指数均显著低于B组(P<0.05)。结论:FTY720可以显著改善大鼠ASCI后神经功能,其可能是通过抑制脊髓损伤后的炎症反应,减少caspase-3的表达及神经细胞凋亡,从而减轻脊髓继发性损伤。     

胶质细胞源神经生长因子对脊髓损伤后细胞凋亡保护作用的实验研究

目的探讨胶质细胞源神经生长因子(GDNF)对损伤脊髓的修复作用。方法用24只SD大鼠半横断法制作脊髓损伤动物模型；随后随机分为单纯脊髓损伤组(对照组)和脊髓损伤加GDNF组(实验组),应用Hochesst法检测脊髓损伤后细胞凋亡的动态变化并计算凋亡指数；手术后应用行为学(BBB评分)观察损伤脊髓功能恢复情况。结果伤后1、2周实验组凋亡指数(10．86±0．99、14．32±1．27)较对照组(13．85±1．54、16．4l±1．28)降低(P＜0．01)；伤后6周BBB评分实验组(5．30±0．52)明显高于对照组(3．6±0．4),差异有统计学意义(P＜0．01)；伤后6周BBB评分实验组(5．30±0．52)明显高于对照组(3．60±0．41),差异有统计学意义(P＜0．01)。结论GDNF能抑制脊髓损伤后细胞凋亡,对成年大鼠损伤脊髓功能恢复有促进作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

【摘要】 目的：研究经蛛网膜下腔给予表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后神经功能恢复的影响及其作用机制。方法：成年雌性SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只,假手术组（A组）仅切除椎板;对照组（B组）SCI后,蛛网膜下腔注射同体积载体溶液;10mg/kg EGCG治疗组（C组）SCI后经蛛网膜下腔注射EGCG 10mg/kg;20mg/kg EGCG治疗组（D组）SCI后经蛛网膜下腔注射EGCG 20mg/kg。改良Allen法（40g·cm）制作T10节段SCI模型,L4水平蛛网膜下腔注射EGCG或载体溶液。术前、术后1d、术后3d及术后1、2、3、4周进行盲法BBB评分、斜板试验;术后4周时处死大鼠,病理学检查（Luxol fast blue染色）观察脊髓损伤部位残余髓鞘情况;免疫组化及Western blot法检测胶质细胞源性营养因子（GDNF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、Bcl-2和Bax的表达水平。结果：A组术前及术后各时间点BBB评分均为21分,斜板试验角度无明显变化;术后各时间点B、C组和D组BBB评分及斜板试验角度均小于A组（P＜0.05）;术后1d、3d时,B、C组和D组BBB评分以及斜板试验角度无统计学差异（P＞0.05）;术后1、2、3、4周时,C、D组的BBB评分及斜板试验角度均大于B组（P＜0.05）,C组的BBB评分及斜板试验角度与D组比较均无统计学差异（P＞0.05）。术后4周时,B、C、D组大鼠脊髓损伤部位的髓鞘残余面积均小于A组（P＜0.05）,C、D组明显大于B组（P＜0.05）,在损伤脊髓中心D组明显大于C组（P＜0.05）。术后4周时免疫组化检查,B、C、D组的BDNF、GDNF、Bcl-2和Bax的阳性表达强于A组,C、D组的BDNF、GDNF和Bcl-2的阳性表达强于B组,Bax的阳性表达弱于B组。术后4周时Western blot法检测,B、C、D组的BDNF、GDNF、Bcl-2和Bax的表达高于A组（P＜0.05）;C、D组的BDNF和GDNF表达明显高于B组（P＜0.05）,C组与D组无统计学差异（P＞0.05）;C、D组的Bcl-2表达明显高于B组（P＜0.05）,C组与D组比较无统计学差异（P＞0.05）;C组和D组的Bax表达明显低于B组（P＜0.05）,D组明显低于C组（P＜0.05）。结论：EGCG可有效促进大鼠SCI后的神经功能恢复,其机理可能与髓鞘的丢失减少、神经营养因子BDNF和GDNF的表达上调及细胞凋亡被抑制等有关。     

罗西格列酮对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的作用及机制

目的:观察罗西格列酮对脊髓损伤(SCI)大鼠后肢运动功能恢复的作用,探讨其作用机制。方法:75只成年SD大鼠,应用Allen改良法制作大鼠T10SCI模型,随机分为A、B、C三组,每组25只,B、C组于损伤后5min、6h、24h腹腔注射罗西格列酮,C组在腹腔注射罗西格列酮前1h给予G3335,A组于相应时间点腹腔注射等体积生理盐水作为对照组。每组取6只大鼠于伤后1d、7d、2w、4w、6w时对后肢运动功能进行BBB评分;伤后3d每组取4只动物脊髓组织行免疫组织化学染色法检测核转录因子κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的表达;伤后1、3、5、7d和2w每组取3只应用Westernblot法检测脊髓组织中凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2的表达。结果:伤后1d、7d时3组大鼠BBB评分均为0分,伤后2w开始B组BBB评分高于A组和C组,4w和6w时与A、C组比较有显著性差异(P0.05);伤后3d时三组NF-κB表达均为阳性,但B组平均光密度值明显低于A、C组(P0.05),B组与C组比较无显著性差异(P0.05);伤后各时间点B组caspase-3表达量均低于A组和C组(P0.05),而Bcl-2表达均高于A组和C组(P0.05),其差异均在伤后5d达到高峰,A组与C组同时间点比较无显著性差异(P0.05)。结论:罗西格列酮可促进SCI大鼠神经功能恢复,其机制可能与抑制炎症反应及细胞凋亡有关。     

损伤控制手术治疗兔脊髓压迫性损伤的效果

目的:探讨损伤控制手术(damage control operation)治疗兔脊髓压迫性损伤的效果。方法:应用球囊压迫法制备新西兰大白兔脊髓压迫损伤模型45只,造模术后2d随机取5只完成行为学观测、评分后取出损伤区脊髓组织进行流式细胞仪凋亡细胞检测、病理学观察、免疫组化染色检测兔损伤区脊髓组织中基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达(对照组),剩余40只随机分为两组,每组20只,一组采用损伤控制手术(A组),即减压术前先将球囊内压力减为原来一半,使椎管内有效容积增加后再自远离脊髓压迫较重的一侧进行全椎板减压;另一组直接予全椎板切除减压,减压自压迫最严重部位开始(B组),两组减压完毕后均取出球囊,并在减压术后1d、3d、7d、14d分别随机取5只实验兔完成以上检测内容。结果:对照组造模术后48h的Tarlov评分为1.20±0.45分,A、B组减压术后1d时Tarlov评分与对照组比较均无统计学差异(P0.05);A、B组减压术后1d、3d、7d时的Tarlov评分均无统计学差异(P0.05),减压术后14d时A组高于B组(P0.05)。对照组脊髓细胞凋亡率为(2.66±1.40)%,A、B组减压术后1d时脊髓细胞凋亡率均低于对照组(P0.05);减压术后1d、3d时A、B两组损伤区脊髓细胞凋亡率无统计学差异(P0.05);A、B组减压术后1d与3d、7d与14d损伤区脊髓细胞凋亡率无统计学差异(P0.05);A、B组减压术后3d与7d损伤区脊髓细胞凋亡率均有统计学差异(P0.05);减压术后7d、14d时A组损伤区脊髓细胞凋亡率均低于同时间点B组(P0.05)。病理学观察显示对照组白质轻度脱髓鞘、部分轴突空泡样变,灰质内细胞水肿,A、B组减压术后1d、3d、7d、14d白质弥漫性脱髓鞘改变及散在点状出血,灰质内细胞水肿伴神经细胞变性逐渐加重,至减压术后7d时灰质内广泛神经细胞变性,并持续到术后14d。对照组MMP-2表达阳性细胞率为(45.76±0.75)%,A、B组减压术后1d时MMP-2表达阳性率均低于对照组(P0.05);减压术后1d、3d、7d、14d时B组MMP-2表达阳性细胞率均高于同时间点A组(P0.05),A、B组减压术后1d、3d比较均无统计学差异(P0.05),3d、7d,7d、14d比较均有统计学差异(P0.05)。结论:损伤控制手术治疗兔脊髓压迫性损伤较直接减压效果好,建议对胸腰椎爆裂骨折合并脊髓压迫损伤的治疗采用损伤控制手术方案。     

BMSCs移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经功能恢复的影响. 方法 从2011年3月至7月,采用全骨髓差速贴壁培养法进行SD大鼠BMSCs的体外分离与培养;利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor)建立大鼠T11脊髓损伤模型,建模成功后将大鼠随机分为4组:对照组(A组)、电针组(B组)、BMSCs移植组(C组)、联合组(D组).SCI后1周,C组与D组大鼠自尾静脉注射移植BMSCs悬液0.1 ml,A组与B组自大鼠尾静脉注射无血清的DMEM/F12培养液0.1 ml,B组与D组接受督脉电针治疗,1次/天.于SCI后1、2、4、8周采用BBB评分法进行后肢运动功能评分;于SCI后8周采用SEP检测脊髓传导功能,采用HE染色观察脊髓空洞大小,采用免疫组化染色检测神经丝蛋白(NF200)的表达.实验中获得的数据采用单因素方差分析. 结果 SCI后2、4、8周,与A组比较,B、C、D组BBB评分均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组BBB评分升高更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,与A组比较,B、C、D组SEP潜伏期缩短、波幅增高,差异有统计学意义(p＜0.05);与R、C组比较,D组SEP潜伏期更短,波幅更高,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,4组大鼠脊髓组织损伤区均可见组织结构紊乱,细胞肿胀,空泡变性,且损伤区均可见瘢痕组织及空洞形成,其中A组脊髓空洞最大,B组和C组次之,D组最小.SCI后8周,4组大鼠脊髓组织均有NF200阳性表达,与A组比较,B、C、D组NF200阳性表达增强,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组NF200阳性表达更强,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 BMSCs移植联合督脉电针对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的促进作用更为显著,优于单纯BMSCs移植和督脉电针治疗.     

转染胶质细胞源性神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响

目的:探讨转染胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响。方法:取SD雌性大鼠的双侧股骨,冲洗髓腔分离培养得到的BMSCs,通过荧光素标记技术检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45,以确认是否得到BMSCs。构建GDNF过表达慢病毒用以感染BMSCs,加入感染分数分别为10、50、80、100、150、200的重组慢病毒悬液。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况以表达细胞数量,评价转染效果,Western blot检测转染后GDNF在BMSCs中的表达,以四唑蓝比色法(MTT)法检测转染GDNF基因的BMSCs的细胞活力。将50只SD大鼠通过Allen′s打击法制备脊髓打击伤模型,造模成功后随机分为三组:A组(20只)为单纯BMSCs组,使用微量注射器移植未转染的BMSCs;B组(20只)为BMSCs转染组,使用微量注射器移植转染GDNF基因的BMSCs;C组(10只)为模型对照组,造模后脊髓内注射DMEM培养基。于造模后7d、14d、28d对大鼠进行BBB运动功能评分。各组均于造模后7d、14d、28d各取5只麻醉处死灌注取材后行HE染色并镜下观察。A、B两组采用免疫组织化学染色观察GFAP、NSE、NF-200在脊髓内的表达,以评估神经轴突生长情况。结果:经分离培养得到的细胞呈长纺锤状,以类似成纤维细胞样集落生长。流式细胞术测定结果示所培养的细胞阳性高度表达CD29、CD90,未表达CD34、CD45,表明分离培养所得细胞为BMSCs。当MOI=100时,转染12h后,BMSCs显著表达GFP,提示转染成功。Western blot结果示GDFP表达情况良好。MTT法显示转染7d后BMSCs组细胞活力明显高于未转染BMSCs组。术后7d时,三组BBB评分无显著差异。术后14d,B组的BBB评分5.80±0.19分与A组3.60±0.18分及C组3.10±0.14分相比均有显著性差异(P0.05)。术后28d,B组的BBB评分11.90±0.28分与A组8.30±0.29分及C组5.70±0.18分相比有显著性差异(P0.05)。GFAP、NSE、免疫组化染色光密度统计结果均显示A组和B组有显著性差异,B组明显优于A组,具有统计学意义(P0.05)。NF-200神经纤维长度统计结果提示B组为89.98±28.31μm,A组为23.64±13.45μm,两组之间存在显著差异(P0.05)。结论:GDNF转染BMSCs具有较高的细胞活性,能够提升BMSCs促进神经轴突再生的能力。     

褪黑素对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的 观察褪黑素(melatonin,MT)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓组织细胞凋亡的影响,探讨其对脊髓损伤的保护作用.方法 成年Wister大鼠66只,随机分为三组Sham组(假手术组)、A组(单纯SCI组)及B组(MT治疗组).Sham组仅切除椎板未损伤脊髓;A、B两组采用改良Allen法制成大鼠SCI模型,术后立即分别腹腔注射等体积无水乙醇、褪黑素(100 mg/kg);Sham组于术后48 h、A和B组于术后8、24、48、72 h和7 d分别进行神经功能评分和测定伤段脊髓组织凋亡细胞数.结果 A组凋亡细胞百分率伤后24 h开始升高,48 h达到高峰,72 h开始下降;B组凋亡细胞百分率伤后24 h、48 h及72 h与A组相比明显减少,差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01);B组神经功能比A组有明显提高(P＜0.05).结论 SCI后应用MT可以抑制脊髓组织神经细胞凋亡,从而对脊髓损伤起保护作用.     

活性巨噬细胞移植促进脊髓损伤后功能恢复的实验研究

目的 探讨活性巨噬细胞移植对脊髓损伤修复的促进作用.方法 用改良Allen法制成大鼠脊髓损伤模型.随机分成对照组(A组),脊髓内微量注射生理盐水20μl;活性巨噬细胞移植组(B组),脊髓内注射活性巨噬细胞悬液20μl.移植后7、14、28 d采用斜板试验、脊髓运动功能BBB(Basse,Beattie and Bresnahan)评分法观察大鼠运动功能恢复情况,脊髓诱发电位检测观察神经功能恢复,HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况,免疫组化法观察移植的活性巨噬细胞的存活情况及损伤部位神经纤维的再生情况.结果 术后28 d,两组斜板倾斜角度差异有统计学意义(A组44.96°±5.70°,B组52.72°±6.51°,P＜0.05);两组BBB评分差异有统计学意义(A组6.8±1.2,B组11.8±2.2,P＜0.05).同时,两组MEP潜伏期差异也有统计学意义[A组(4.69±0.47)mg,B组(3.62±1.29)ms,P＜0.05],两组SEP潜伏期差异有统计学意义[A组(4.19±1.97)ms,B组(2.01±0.55)ms,P＜0.05].两组神经轴突计数差异有统计学意义[A组(32.8±6.1)条/mm2,B组(40.8±9.0)条//mm2 P＜0.05].实验组可见损伤区巨噬细胞存在,脊髓损伤处空洞面积减小,有明显神经纤维再生.结论 活性巨噬细胞可在脊髓损伤处存活并减轻脊髓损伤,减小脊髓损伤处空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复.     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对脊髓损伤修复的促进作用.方法 用改良Allen法制作大鼠脊髓损伤动物模型.随机分成对照组(A组),脊髓损伤9 d后脊髓内微量注射生理盐水溶液5μl;骨髓间充质干细胞移植组(B组),脊髓损伤9 d后脊髓内注射骨髓间充质干细胞悬液5μl.移植后7、14、28 d采用斜板实验、脊髓运动功能BBB评分法观察大鼠运动功能恢复情况,脊髓诱发电位的检测观察神经功能恢复,苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况,免疫组织化学法观察移植的骨髓间充质干细胞的存活及分化情况,损伤部位神经纤维的再生情况.结果 移植后28 d,两组斜板倾斜角度差异有统计学意义[A组(44.96±5.70)度,B组(53.19±6.51)度,P＜0.05];两组BBB评分差异有统计学意义[A组(6.8±1.2),B组(10.1±3.5),P＜0.05].同时,两组MEP潜伏期差异有统计学意义[A组(4.69±0.47)ms,B组(3.97±0.83)ms,P＜0.05],两组SEP潜伏期差异有统计学意义[A组(4.19±1.97)ms,B组(2.60±0.92)ms,P＜0.05].两组神经轴突计数差异有统计学意义[A组(32.8±6.1)条/mm2,B组(39.0±4.6)条/mm2,P＜0.05].实验组可见明显星形胶质细胞和神经纤维再生,脊髓损伤处的空洞面积明显减小.结论 骨髓间充质干细胞可在脊髓损伤处分化为神经元和神经胶质细胞,能够减小脊髓损伤处的空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复.     

表达VEGF的重组腺相关病毒对大鼠创伤性脊髓损伤的保护作用及其机制研究

目的探讨表达VEGF的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)对大鼠创伤性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用及其机制。方法取144只成年雄性SD大鼠(体重200～250 g)随机分为4组,每组36只。假手术组(A组)仅手术暴露脊髓。模型对照组(B组)、rAAV-绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)组(C组)、rAAV-hVEGF165-GFP组(D组)制备创伤性SCI大鼠模型,术后即刻分别予以20μL生理盐水、rAAV-GFP病毒、rAAV-hVEGF165-GFP病毒脊髓注射治疗。术后3、7 d采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能变化;术后7 d通过脊髓组织尼氏小体染色观察脊髓组织病理学变化,脊髓组织神经元透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色观察脊髓神经元凋亡,Western blot检测水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP-4)表达;术后1、3、5、7 d ELISA法检测VEGF165蛋白表达。结果 BBB评分显示术后3、7 d D组神经功能较B、C组显著改善(P<0.05)。尼氏小体染色显示术后7 d D组脊髓组织结构破坏明显轻于B、C组(P<0.05)。ELISA检测显示D组VEGF165蛋白表达呈低剂量缓释表达,术后3、5、7 d,D组VEGF165蛋白表达均高于其他3组(P<0.05)。透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色结果显示术后7 d D组脊髓神经元凋亡较B、C组显著减少,凋亡率显著低于B、C组(P<0.05)。Western blot结果显示术后7 d D组脊髓组织AQP-4蛋白表达明显较B、C组减少(P<0.05)。结论表达VEGF的rAAV通过抗神经元凋亡及减轻脊髓水肿对大鼠创伤性SCI起保护作用。