ARDRA技术快速鉴别四种致病曲霉的实验研究

目的:建立检测侵袭性曲霉感染病原菌ARDRA方法。方法:用烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉的标准株建立PCR技术和RFLP技术相结合的扩增rDNA限制性分析(ARDRA)方法,然后对16株临床株进行ARDRA分析。结果:ARDRA技术可以较好地鉴别引起侵袭性曲霉感染的四种常见菌种,从DNA提取到酶切分析结束可以在一个工作日中完成;16株临床株酶切图谱与对应标准株图谱相同。结论:ARDRA技术是一种能够快速鉴别侵袭性曲霉感染病原菌的有效方法。     

应用PCR技术快速鉴定申克孢子丝菌的实验研究

采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,用申克孢子丝菌种特异性引物分别对21株申克孢子丝菌的基因组DNA进行PCR扩增.成功提取21株申克孢子丝菌基因组DNA,并用申克孢子丝菌种特异性引物分别从21株申克孢子丝菌基因组DNA中获得长度为320 bp的扩增产物.以申克孢子丝菌特异引物为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌简便、快捷、特异,可用于临床诊断.     

聚合酶链反应快速检测丝状真菌

目的　建立并评价一种新的丝状真菌的快速PCR检测方法。方法　将 13种培养的不同丝状真菌菌种经匀浆器研磨处理后直接放入一个新建立的PCR体系 ,用 2对真菌通用引物进行PCR扩增。结果　 13种不同的丝状真菌菌种均在 2h内通过该PCR方法成功地获得了靶DNA的扩增 ,无需任何DNA抽提步骤 ,可用于直接扩增处于任何生长期的未经处理的丝状真菌DNA。结论　此法简便、快速 ,敏感性、特异性均高 ,对丝状真菌引起的深部真菌感染的早期诊断将具潜在意义。     

菌落PCR在快速鉴定头癣病原菌中的临床应用北大核心CSCD

目的评价菌落PCR在快速鉴定头癣病原菌中的可靠性及临床实用性。方法于2016年1月至2017年3月在无锡市第二人民医院皮肤科门诊收集儿童头癣病例17例,采用菌落PCR技术检测病原菌,同时与常规PCR及形态学鉴定结果进行比较,评价菌落PCR应用于头癣病原菌鉴定的可靠性。结果17例儿童头癣患者临床标本经培养收集菌种、菌落PCR均扩增成功,从断发或皮屑标本中取材至DNA模板制备成功耗时（3．82±0．50）d,较传统形态学鉴定（14d）明显缩短。以常规PCR鉴定结果为标准,菌落PCR菌种鉴定正确率为100％,优于传统的形态学鉴定（正确率88．2％）。结论菌落PCR可用于临床头癣病原菌的检测,是一种快速、经济、可靠的分子检测技术。     

应用PCR技术快速检测淋球菌

自淋球菌４．２Ｋｂ质粒ｐＪＤｌ基因序列选择一对引物序列合成引物，ＰＣＲ扩增产物为２３０ｂｐ片段。经３０次循环后，最低可检出１０ＣＦＵ。特异性试验结果表明，这对引物与白念珠菌有部分同源性，ＰＣＲ扩增产物小于７５ｂｐ。与脑膜炎奈瑟菌及其他１３种常见的细菌、４种念珠菌、沙眼衣原体、解脲支原体、正常女性宫颈分泌物中的细菌均无同源性。临床标本检测结果表明，与涂片法和培养法相比较，阳性检出率可达１００％。试验表明，应用本方法可直接快速检测分泌物中的淋球菌。     

PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

常见致病性丝状真菌总RNA的快速提取

近年来 ,随着分子生物学的长足发展 ,许多ＲＮＡ的提取方法已经建立起来。这些方法均用到ＲＮａｓｅ的抑制剂如胍盐、酚、氯仿、ＤＥＰＣ、ＳＤＳ等。常用于动植物组织或细胞中未降解ＲＮＡ的提取。从丝状真菌中提取ＲＮＡ的方法国内报道较少[1] 。最近 ,我们建立了一种提取常见致病性丝状真菌总ＲＮＡ的方法 ,发现该方法操作简便、需时较短 ,ＲＮＡ降解少、纯度高 ,而且产量丰富 ,特报告如下 :1　材料与方法1 .1　受试菌株　须癣毛癣菌ＢＭＵ0 0 2 5 2及ＢＭＵ0 0 2 93各 1株 ,波氏假性阿利什霉ＢＭＵ0 0 488及ＢＭＵ0 0 491各 1株 ,茄病镰…     

应用PCR技术快速诊断马尔尼菲青霉

采用特异性引物和聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术,检测６株临床分离的马尔尼菲青霉、２株竹鼠体内分主了的马尔尼菲青霉,及其它致病真菌、细菌、人白细胞系ＤＮＡ。结果（１）８株马尔尼菲青霉的２５℃菌丝相、３７℃酵母相ＤＮＡ均可扩增３４７ｂｐ的特性片段,而其它致病真菌、细菌、人白细胞ＤＮＡ无特性片段扩增。（２）５株马尔尼菲青霉２５℃连续传１０代,其中一株发生变异,５０株马尔尼青霉均可扩增出特性片段。（３）敏感性     

一种丝状真菌DNA提取方法的介绍

由曲霉、毛霉、镰刀菌、青霉等丝状真菌引起的人类感染日益多见.研究丝状真菌致病的分子机制以及进行临床快速基因诊断已成为热点.而这些工作的前提就是获取足量高质稳定的供分析用的DNA分子.丝状真菌的生长周期、菌丝形态、孢壁成分等均与酵母样真菌有相当差别,其DNA的提取有一定难度.我们经过反复摸索、比较,找出一个较为简便、经济、可靠的方法,现介绍如下.     

红色毛癣菌菌落产色变异的实验研究

红色毛癣菌菌落产生红色是该菌重要鉴定特征之一，但常遇到不产生红色的菌株。了解这种产色变异的范围和频率以及影响因素，对提高鉴定正确性、更好地指导治疗有重要意义。方法：对２００株不同地区来源的临床株进行初代分离和传代培养，并观察１％葡萄糖玉米粉吐温琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂对产色的恢复作用；比较不同培养条件对产色变异的影响，对有关数据进行统计学处理。结果：初代产色消失率为３４％，传代诱导消失率为４９％，稳定消失率达２４％。大多数传代消失为可逆的，而大多数初代变异为不可逆的；较高的ｐＨ和较低的培养温度不利于产色。北方分离株产色消失率显著高于南方分离株。结论：红色毛癣菌产色消失率发生较高，已对其鉴定产生影响，其确切的发生机理，有待深入研究     

PCR检测部分病原真菌的实验研究

为探讨和评价ＰＣＲ技术在检测和鉴定病原真菌方面的作用,重点是引物的选择。首先比较了来自ｒＤＮＡ基因序列的通用引物的通用性,并用３对种特异性引物进行２次套式扩增。结果表明３对通用引物均能扩增出预期的靶ＤＮＡ带,平均大小分别为６２０ｂｐ,４８５ｂｐ和５８０ｂｐ;３对种特异性引物分别扩增出白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉ＤＮＡ,并提高了敏感性。说明用通用引物和种特异引物进行ＰＣＲ扩增可以用于病原真菌的检测和     

多重RT-PCR诊断甲真菌病的体外模拟研究

目的:拟建立多重RT-PCR诊断甲真菌病的方法。方法:采用Trizol提取真菌的RNA;选择3对引物(真菌通用引物,皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立3重RT-PCR体系,采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性;并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果:(1)所采用的真菌通用引物28srDNA、皮肤癣菌特异性引物ACT和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性;(2)在适宜的反应条件下,无论对单模板,还是多模板,该反应体系均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;(3)该反应体系对模拟临床标本的检测灵敏度为102cfu/mL。结论:多重RT-PCR技术可在较短时间内检测出皮肤癣菌、酵母和霉菌等,并可判断菌的活力,将为临床快速诊断和及时、合理地治疗甲真菌病和其他真菌性疾病提供参考。     

Detection of mycobacterial DNA in cervical granulomatous lymphadenopathy from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue by PCR

Cervical tuberculous lymphadenitis is the most common form of inflammatory neck mass in Korea. The diagnosis of tuberculosis requires proof of the presence of Mycobacterium tuberculosis by acid-fast staining or bacterial growth in culture. However, these are often difficult in cervical tuberculous lymphadenitis. The aim of this study was to investigate the value of the polymerase chain reaction (PCR) technique for detection of mycobacteria in routinely processed tissue sections of cervical granulomatous lymphadenopathy. In this retrospective study, twenty formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy specimens from clinically and/or histopathologically diagnosed cervical granulomatous lymphadenopathy were analyzed for mycobacterial DNA by PCR. Two different primers to amplify mycobacterial-common 383-base pair (bp) DNA and Mycobacterium tuberculosis-complex-specific 123-bp DNA were used. Positive PCR products were sequenced directly. Mycobacterial-common DNA (383-bp positive) was found in 10 of the 20 cases. Among them, 7 cases were PCR positive with both primer sets. These seven cases can be considered as tuberculosis. The other three cases indicated possible atypical mycobacteriosis. PCR is a useful technique for the demonstration of mycobacterial DNA fragments in patients with clinically suspected cervical tuberculous lymphadenitis who have acid fast-negative histology and/or unsuccessful mycobacterial cultures.     

多点培养法分离培养150例甲真菌病病原菌

目的 比较多点培养法和常规培养法在甲真菌病病原菌分离中的差别;获取甲真菌病病原菌流行病学资料.方法 150例病甲标本同时采用多点培养法和常规培养法分离菌种并作菌种鉴定.结果 多点培养法与常规培养法的培养阳性率和菌种构成差异有统计学意义(P<0.05).女性、手指甲、近端甲下型和低临床指数评分者病原菌以酵母菌为主;男性、足趾甲、远端侧位甲下型和高临床指数评分者病原菌中皮肤癣菌占优势.结论 多点培养法阳性率高,能发现更多酵母菌.     

阴道拭子PCR检测诊断女性淋病的研究

目的：评估阴道拭子标本PCR检测在诊断女性淋病的效果和依从性。方法：选择了242例患者,取宫颈拭子和尿道拭子各1个,取阴道拭子2个。其中一个阴道拭子行淋球菌培养,其余标本均行PCR检测。以宫颈拭子和尿道拭子PCR结果为标准判断阴道拭子PCR的检测效果。结果：19例宫颈拭子PCR阳性患者的阴道拭子PCR均阳性,5例尿道拭子PCR阳性者中有4例阴道拭子PCR阳性。阴道拭子PCR的敏感性为95．8％,优于宫颈拭子PCR及阴道拭子培养。结论：无创伤性阴道拭子PCR检测是诊断淋病较理想的方法。     

PCR法扩增角鲨烯环氧化酶鉴定白念珠菌的研究

目的：通过扩增角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,进行PCR来鉴定白念珠菌。方法：根据白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因的开放读框中编码1MSSVKY^6的序列设计上游引物5‘－ATGAGTTCAGTTAAGTATG－3‘,编码^492NEIVR^496的序列设计下游引物5‘-CTATCTTACAATCTCGTTC-3‘,对白念珠菌ATCC11006,22株临床分离株,7株其它致病性念珠菌,8株致病性丝状真菌,1株新生隐球菌及1份人的基因组DNA进行了PCR扩增,并对PCR产物用酶切方法鉴定,结果：所有23株白念菌均可获得约1．5kb大小的PCR产物,16株其它致病性真菌及人的DNA标本均无扩增产物,PCR产物经BamHI酶切,产生两个大小分别约为1．0kb和500bp的片段。结论：利用设计的引物,扩增角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,可以特异地鉴定白念珠菌。     

多重PCR快速诊断甲真菌病

目的探讨多重PCR技术从临床标本中检测甲真菌病病原真菌的方法。方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法处理临床标本，从中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引物NS，皮肤癣菌特异性引物CHS1和酵母特异性引物ACT1同时进行PCR扩增检测，并与直接镜检和培养法作对比。结果共收集104例临床标本，PCR检测、直接镜检和培养的敏感度分别为93．3％、100％和64．4％，特异度分别为100％、86．4％和100％，阳性预测值分别为100％、84．9％和100％，阴性预测值分别为95．2％、100％和78．7％。PCR方法在24小时内即可完成从标本处理至结果判读的全过程。结论多重PCR检测具有较好的特异性和准确性，可初步将甲真菌病的三大类病原菌区分开，且比培养缩短了近2周的时间，为临床快速诊断和及时、合理地治疗甲真菌病提供参考。     

巢式-实时PCR检测梅毒初诊患者不同样本中梅毒螺旋体靶DNA

目的 探讨巢式-实时PCR(NR-PCR)检测初诊梅毒患者不同样本中梅毒螺旋体(Tp)靶DNA的可行性及应用前景.方法 以Tp polA为靶基因,用NR-PCR检测梅毒患者初诊时皮损拭子、血清、全血、脑脊液、末梢耳垂血等样本中的靶DNA,用统计软件SPSS.13分析结果.结果 NR-PCR检测Tp polA靶DNA的极限为2个Tp/ml,总体阳性率为71.7%,检测不同类样本的阳性率从高到低依次为:耳垂血92.0%>脑脊液90.2%>拭子74.3%>血清66.9%>全血64.2%.NR-PCR结果与血清学检查结果的一致性为76.0%(152/200).进一步分析显示:一期、二期梅毒拭子DNA阳性率(63.2%比87.5%)差异无统计学意义(χ2=2.62,P>0.05);血清样本中,二期梅毒DNA阳性率高于一期梅毒(χ2=3.6,P=0.06);全血样本中,二期梅毒DNA阳性率高于其他各类型梅毒;神经梅毒耳垂末梢血阳性率与脑脊液比较,P=0.06.隐性梅毒血清(RPR)滴度≥1:8组的Tp DNA阳性率高于RPR≤1:4组.结论 NR-PCR方法检测梅毒患者不同样本中Tp DNA是可行的,不同类型梅毒、不同类型样本以及其血清RPR滴度水平都影响Tp DNA阳性率.     

自身淬灭探针荧光定量PCR检测淋病奈瑟菌

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒pGEM-11Zf-CPPB作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系,并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为101～109拷贝/μL,灵敏度为10拷贝/μL,特异性为100%。天间变异系数(CV)为2.38%,批内CV为1.32%,批间CV为2.75%。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的淋病奈瑟菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对淋病的早期快速诊断有较高价值。