金属蛋白酶9在隐球菌性脑膜炎小鼠模型脑组织中的表达

目的:观察基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在鼠脑组织中的表达并探讨其意义.方法:雌性C57BL/6小鼠行股静脉插管后实验各组分别注入新生隐球菌菌悬液以及菌悬液加抑肽酶,8 h后应用免疫组织化学技术检测MMP-9在小鼠脑组织中的表达情况;同时观测小鼠脑组织匀浆后菌落计数(CFU),并与免疫组织化学结果进行对照分析. 结果:注入新生隐球菌菌悬液小鼠脑组织中的MMP-9显著升高,与正常对照组比较,有显著统计学差异(P＜0.01);菌悬液加抑肽酶小鼠脑组织中MMP-9与正常对照组比较无明显统计学差异(P＞0.05);MMP-9的染色强度与小鼠脑组织中的菌体负荷量正相关. 结论:隐球菌性脑膜炎小鼠脑组织中存在MMP-9过表达,MMP-9可能导致血脑屏障开放程度提高.     

尼莫地平对胶质瘤U251 MG细胞生长的影响

目的:研究钙通道阻滞剂尼莫地平(ND)对人脑多形性胶质母细胞瘤U251MG细胞生长的影响.方法:将U251MG细胞配成1×105ml-1的细胞悬液,接种孵育24 h,细胞贴壁后吸除原培养基,分别加入含不同浓度rhT-GF-α(12.5 pg/L、25.0 pg/L、50.0 pg/L)、不同浓度ND(1.0×106mol/L、1.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L)加rhTGF-α(12.5 pg/L)的无血清DMEM继续孵育3 d.然后MTT法测定各组细胞的生长情况.以体积分数10%小牛血清为对照.结果:rhTGF-α对U251MG细胞有促生长增殖作用,且该作用呈一定的量-效依赖关系.不同浓度ND加12.5 pg/L rhTGF-α联合作用后,细胞生长受抑,且抑制作用随ND浓度的增加而增强.结论:尼莫地平可能通过抑制细胞钙离子的内流与释放,阻断rhTGF-α对肿瘤细胞的生长刺激效应,从而抑制了肿瘤细胞生长增殖.     

白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型的建立

目的建立白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型。方法采用对裸小鼠腹部注射白念珠菌及隐球菌菌悬液的方法,观察记录1～2d内裸小鼠的毒性反应情况和死亡分布,并进行病理检查。根据寇氏法设计测定半数致死量(LD50),并检测感染前后脾脏自然杀伤(NK)细胞活性的变化。结果分别观察白念珠菌和新生隐球菌菌悬液对裸小鼠的急性毒性;检测到裸小鼠腹腔注射白念珠菌菌悬液的LD50为1.6×107cfu/ml,注射新生隐球菌菌悬液的LD50为2.0×107cfu/ml。白念珠菌、新生隐球菌感染裸小鼠时,脾脏组织NK细胞的活性下降。结论建立了白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型,为讨论在T细胞为主的细胞免疫缺失的情况下,以B细胞NK细胞为主的体液免疫系统如何应对白念珠菌和新生隐球菌感染提供了一个极好的实验动物模型。     

用荧光钙指示剂喹2测定人血小板胞浆游离钙浓度的方法

我们采用荧光钙指示剂喹2,建立了测定人血小板胞浆游离钙浓度的方法,简报如下。 导入喹2的血小板悬液(QPS)的制备:将富含血小板血浆与10 μmol/L 喹2/AM混匀,置22℃水浴20 min,加入1μmol/L PGE_1,室温下430×g 离心 15 min,弃上层液。用1ml含1 μmol/L PGE_1和10μmol/L EGTA的HEPES无钙台氏缓冲液(HTB)使血小板悬浮并移至10ml体积已用HTB(含10 μmol/L EGTA)50ml平衡过的2％琼脂糖胶柱上,用相同缓冲液洗脱。过柱后将血小板悬液调至1×10~8血小板/ml和Ca~(2+)浓度至1 mmol/L,置22℃备用。对照血小板悬液(CPS)的制备:用等体积     

大鼠生精细胞体外培养条件的研究

目的:寻找一个最适合生精细胞体外培养的培养体系,为进一步培养人类生精细胞提供技术基础.方法:用单一酶-研磨-Percoll法制备15 d龄雄性大鼠生精细胞混悬液用于体外培养.①设计两种不同的培养条件:DMEM/F12和改良人类输卵管液(HTF)作为基础培养液,分为两组.每组根据添加不同浓度的激素分为6小组.添加的睾酮(T)和FSH浓度分别为:对照组H0(T 1 μmol/L,FSH 0 IU/L)、H1组(T 1 μmol/L,FSH 10 IU/L)、 H2组(T 1 μmol/L,FSH 25 IU/L)、H3组(T 1 μmol/L,FSH 50 IU/L)、H4组(T 1 μmol/L,FSH 100 IU/L)、H5组(T 0 μmol/L,FSH 50 IU/L). ②通过BRDU标记和流式细胞仪检测所有实验的生精细胞倍体的变化来判断其发育,进一步确认本研究使用培养条件的可靠性.结果:在生精细胞与支持细胞共培养过程中以改良人类输卵管液作为基础培养液,添加T 1 μmol/L ,FSH 50 IU/L或100 IU/L都适宜生精细胞体外培养;另通过BRDU标记及流式细胞仪检测均表明,在本研究条件下体外培养生精细胞能从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段.结论:改良人类输卵管液作为基础培养液,添加浓度为50 IU/L或100 IU/L的FSH及T 1 μmol/L,最适合生精细胞的体外成熟培养.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外的诱导分化及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性. 方法:利用密度为1.073 kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞,体外培养与扩增MSCs;取生长良好的第3代细胞,用成骨细胞分化培养液培养21 d,Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶(AKP)组化染色;分别以浓度为5,10和15 μmol/L的Brdu溶液标记MSCs,孵育12,24,48,72和96 h后免疫组化检测Brdu,确定最佳标记量和最佳标记时间. 结果:诱导分化第21日, AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性. 10 μmol/L Brdu标记MSCs的效果最好,随着孵育时间的延长,Brdu标记率逐渐增高,标记72 h后标记率在90%以上. 结论:MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞,用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10 μmol/L,最佳时间是72 h.     

氟砷单独及联合对正常人淋巴细胞增殖及IL-2分泌情况的影响观察

目的:观察氟、砷单独及联合作用对正常人淋巴细胞的增殖及IL-2分泌情况,为探讨氟、砷单独及联合作用对机体免疫功能的影响规律及其作用机制提供科学依据.方法:采用体外细胞培养,应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)、酶联免疫吸附试验(ELISA)法,观察0.1、1.0 μmol/L亚砷酸钠(NaAsO2)及10、50 μmol/L氟化钠(NaF)对正常人淋巴细胞的生长抑制及细胞因子分泌的影响.结果:人淋巴细胞在经浓度为0.1、1.0 μmol/L的NaAsO2及浓度为10、50 μmol/L的NaF染毒后,其MTT吸光度值与对照组相比,均呈下降趋势,且有统计学意义(P均＜0.05);浓度为1.0 μmol/L的NaAsO2及浓度为50 μmol/L的NaF与淋巴细胞作用,可抑制白细胞介素-2(IL-2)的分泌,但未发现氟砷联合作用对人淋巴细胞的作用呈现交互作用(P＞0.05).结论:氟、砷对人淋巴细胞存在明显的生长抑制作用,并与NaAsO2及NaF在体外对人淋巴细胞IL-2分泌的抑制作用结果相吻合.提示氟、砷对免疫细胞的生长抑制作用可能是砷、氟对机体免疫系统损伤的重要因素之一.     

四川地区隐球菌临床分离株基因型和耐药性分析

目的 了解四川地区隐球菌临床分离株基因分型及体外临床常用抗真菌药物敏感性情况.方法 采用针对URA5基因PCR产物的限制性片段长度多态性(RFLP)方法对收集自我校华西医院的92株隐球菌临床分离株进行基因分型;采用E-test法检测临床常用抗真菌药物两性霉素B(AMB)、氟胞嘧啶(FC)、氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)和伏立康唑(VRC)对隐球菌分离株的最低抑菌浓度(MIC)范围,并计算其MIC50、MIC90.结果 92株隐球菌中,91株为新生隐球菌VN Ⅰ型,1株为格特隐球菌VGⅡ型.5种抗真菌药物对92株隐球菌临床株的MIC值范围、MIC50、MIC90值分别如下:两性霉素B为＜0.002～2 μg/mL0.19 μg/mL和0.75 μg/mL;氟胞嘧啶为0.5～＞32 μg/mL、4μtg/mL和8 μg/mL;氟康唑为0.5～32 μg/mL、3 μg/mL和8 μg/mL;伊曲康唑为0.064～2 μg/mL、0.5 μg/mL和1.5 μg/mL;伏立康唑为0.004～0.19 μg/mL、0.047 μg/mL和0.094 μg/mL.其中3株(3.3％)对两性霉素B耐药,4株(4.3％)对氟胞嘧啶耐药,25株(27.2％)对伊曲康唑耐药,未发现对氟康唑耐药的菌株,所有菌株对伏立康唑敏感.格特隐球菌(1株)对氟胞嘧啶耐药,对氟康唑剂量依赖敏感.不同时间段隐球菌对5种抗真菌药物的MIC值比较,差异均具有统计学意义.随时间推移,两性霉素B及氟胞嘧啶的MIC值有所升高,唑类药物MIC值变化无规律.结论 四川地区隐球菌以新生隐球菌VN Ⅰ型为主,存在格特隐球菌VGⅡ型.除伊曲康唑外,隐球菌对其他抗真菌药物敏感性高,仅少数菌株对两性霉素B及氟胞嘧啶耐药.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

重组人透明带蛋白3诱导精子的顶体反应

目的：在体外条件下检测重组人透明带蛋白诱导的顶体反应。 方法：体外采集已生育健康男子精液,采用非连续密度梯度法分离精子,将获能的精子悬液分成阴性对照组(C组,200 μL精子悬液加1 μL DMSO)、阳性对照组(A组,200 μL精子悬液加A23187至终浓度为10 μmol•L^-1)和ZP3组(200 μL精子悬液加ZP3至终浓度为10 mg•L^-1),考马斯亮蓝染色法检测重组人ZP3蛋白诱导的顶体反应。结果：C组、A组和ZP3组发生顶体反应的精子百分率分别为(5.00±1.70)%、(46.10±7.49)%和(13.20±2.70)%,各组间比较差异有显著性(P<0.05)。 结论：重组人透明带蛋白能够诱导人精子发生顶体反应。