一种改良的大鼠胰岛分离方法

目的 寻找并建立一种改良的、实用可靠的大鼠胰岛制备和培养方法。方法 采用胰管内顺行灌注胶原酶溶液，静态消化，Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛，手挑法捡出全部胰岛。分离后胰岛在37℃、体积浓度95％O2和5％CO2下培养1周，通过测量培养液的胰岛素含量观察胰岛功能变化。结果 355～875个胰岛／胰腺，捡出后胰岛纯度可达：100％，活率≥95％。本方法制备胰岛体外培养后可以测出功能良好。结论 本法胰岛制备技术已趋于完善，效果满意，获得的胰岛体外培养后实验证明其功能良好。     

T细胞疫苗诱导异种胰岛移植免疫耐受的实验研究

目的体外制备供体特异性T细胞疫苗（T cell vaccine）,探讨T细胞疫苗免疫（T cell vaccination）诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的作用。方法腹腔注射链脲佐菌素诱导建立Balb／c小鼠Ⅰ型糖尿病模型,用酶消化法和密度梯度离心法无菌分离纯化Wistar大鼠胰岛细胞。制备Balb／c小鼠针对Wistar大鼠的T细胞疫苗：实验随机分为三组,G1：糖尿病小鼠对照组;G2：胰岛细胞移植组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞移植＋1640培养液（对照组）;G3：胰岛细胞移植加T细胞疫苗免疫组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞＋T细胞疫苗（实验组）,于d1,d7,d14,d21实验组Balb／c小鼠接种TCV（1×107／mL）,对照组用1640替代。接种前和每次接种后第5d分别进行混合淋巴细胞反应。胰岛细胞移植：将Wistar大鼠的胰岛按1200。1500IEQ／kg经肝门静脉导入小鼠体内,移植后观测血糖和体重变化。结果异种胰岛细胞移植可以诱导I型糖尿病小鼠血糖降至正常水平且维持一段时间,对照组小鼠移植后（5．12±1．36）d即发生排斥,实验组移植物存活时间达（20．25±3．45）d。结论TCV能够有效延长异种胰岛移植物的存活时间,是一种潜在诱导异种胰岛移植免疫耐受的方法。     

多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

目的：采用不同的分离或消化方法，探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。方法：将25只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为5组；（1）A组：胆总管灌注胶原酶P；（2）B组：胆总管灌注Hanks液；（3）C组：胆总管不灌注液体；A，B，C＜3组胰腺直接分次消化；（4）D组：胆总管不灌注，胰腺剪碎后分次消化；（5）对照组：胆总管灌注胶原酶P，胰腺直接单次消化，将分离的且经岛沉淀物用Ficoll-400纯化并培养，再把胰细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。结果：纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组，而D组最低；A，B和D3组的纯度均高于对照组或C组；在胰岛成活率方面，A，B，C3组均高于对照组或D组，移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。结论：经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获,纯度和活性。     

胰岛培养后胸腺内移植的实验研究

【目的】观察胰岛培养后胸腺内移植对移植物存活时间的影响。【方法】以C57BL/ 6小鼠为受体 ,BALB/c小鼠为供体。胸腺内胰岛未培养组分为单纯移植和移植的同时加腹腔内 1次性注射兔抗小鼠胸腺细胞血清 (ATS)两组。胸腺内胰岛培养组分为 2 4℃培养后单纯移植和移植时加用ATS两组。【结果】未培养胰岛单纯胸腺内移植后平均存活期为 (19 5±10 1)d ,加用ATS后 ,可延长至 10 0d以上 ,其中 6只受体 (6 / 8)胸腺内移植物长期存活 ,并且诱导了受体对供体的特异性无反应性。胰岛经 2 4℃培养后单纯胸腺内移植或移植后应用ATS ,均可获长期存活 (分别为 >92d ,>10 0d) ,但未能诱导受体对供体的特异性无反应性。【结论】胸腺可能为胰岛移植的免疫特许部位 ,新鲜分离胰岛中的抗原在维持免疫耐受中具有重要的作用。     

成人胰岛细胞的分离与纯化

目的 探讨体外分离与纯化成人胰岛细胞的方法与可行性,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法获取的成人胰腺组织称重后,采用V型胶原酶消化法分离;再用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化;在DTZ染色显微镜下,评价胰岛细胞的数量、纯度;并用体外培养、放射免疫测定胰岛素法鉴定胰岛细胞活性。结果成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量（3600±447）个／g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,胰岛平均收获量（2140±207）个／g胰腺,纯度〉70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,测定其培养液中基础胰岛素浓度（mIU·L^-1·100^-1）分别为（3．302±1．63）、（3．504±1．10）、（2．921±1．13）。结论胶原酶消化法、Ficoll间断密度梯度离心纯化法分离纯化成人胰岛是有效的方法。     

胰岛移植物的制备和保存

目的：胰岛移植是治疗I型糖尿病较为理想的方法，而胰岛移植物的合理制备和保存是保证胰岛移植成功的首要条件。目前，胰岛的分离、纯化有多种方法，主要包括人工分离法和机械自动分离法，分离纯化后的细胞经过鉴定后，可以直接应用，或冷藏、冷冻保存，以确保较高纯度和活力的胰岛细胞，由此提高胰岛移植的成功率。     

小鼠胰岛细胞分离纯化后门静脉注射肝内移植模型的建立

目的建立高效。高纯度小鼠胰岛细胞分离纯化，经小鼠门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内移植方法。方法动物手术放大镜下，采用小鼠胆总管内灌注胶原酶方法消化，非连续梯度离心液离心，纯化胰岛，立体显微镜下用将胰腺外分泌组织、腺泡、淋巴结、导管组织吸走，胰岛计数后门静脉注射移植到同种异体受体小鼠肝内。结果胰岛分离时间约180min，纯化后每只小鼠可获200个胰岛。同系胰岛移植后1～2d，糖尿病小鼠血糖下降至11．1mmol／L以下。结论小鼠胰腺采用胆总管灌注胶原酶方法消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性，采用门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内可明显降低糖尿病小鼠血糖值，这一模型的建立可为今后进行人胰岛小鼠移植提供有价值的实验依据。     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

免疫抑制药物对成人胰岛移植物毒性作用的体外研究

胰岛移植是治疗1型糖尿病的有效途径之一。临床开展同种异体胰岛移植面临的主要问题包括：胰岛分离、纯化以及手术操作存在一定难度；胰岛寄居部位的非特异性炎症反应；同种异体以及自身免疫反应攻击植入的胰岛；移植后使用的免疫抑制药物引发的胰岛毒性作用。本研究以成人胰岛为试验对象，探索免疫抑制药物的毒性作用，旨在为临床制定胰岛移植免疫抑制方案提供依据。     

大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

一种简易高效的大鼠胰岛分离纯化方法

目的探索一种高效、高纯度大鼠胰岛分离纯化方法,并研究纯化后的胰岛细胞在体内外环境中的基本生物学功 能状况。方法采用 Ｈａｎｋｓ液经胰管内注射法机械性扩张破坏大鼠胰腺的腺泡组织点后将其剪碎置于含 １ｇ／Ｌ胶原酶 的 Ｈａｎｋｓ 液中,于 ３７℃中静止消化 ２５～３０ｍｉｎ后移入含 １０％胎牛血清的 ＲＭＰＩ－１６４０完全培养液中,２４℃短期培养, Ｆｉｃｏｌｌ－４００非连续密度梯度液离心纯化胰岛,纯化后的胰岛进行异种移植。结果经Ｆｉｃｏｌｌ－４００纯化后,平均每只成年 Ｗｉｓｔａｒ大鼠胰腺能获得 ９２０～ｌ ２３０个胰岛,纯度可达 ９８％以上;在葡萄糖刺激下胰岛素释放量约为基础分泌水平的 ２．２ 倍（Ｐ＜０．００１）纯化后的胰岛异种移植可逆转实验性糖尿病ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的高血糖平均达（８．７±１．６）ｄ。结论胰腺消化 物经短期培养后再进行胰岛纯化的方法具有耗酶量少、技术难度小、胰岛纯度和产率及活率高的特点,是一种简便易行 的高效分离纯化方法．     

人脐静脉内皮细胞培养方法的改进及其优势

目的：改进血管内皮细胞培养方法。方法：用胰酶消化、分离脐静脉内皮细胞，用含20%人AB血清的RPMI 1640完全培养液，于37℃、5%CO2条件下培养细胞，以1:2传代。以传统的20%胎牛血清+基础培养液培养方法（对照组1）和20%胎牛血清+生长因子+基础培养液培养方法（对照组2）作为对照，比较三种方法对细胞活力、培养细胞数量、实验费用等方面的影响。结果：以改良方法培养的脐静脉内皮细胞，呈典型内皮细胞外观，特征性地表达内皮细胞标志，与对照组相比，改良法培养的细胞数量和细胞活力明显优于对照组1，所需实验费用明显少于其它两组。结论：以改良法培养血管内皮细胞，更加简便、经济、可收获大量细胞，可满足大规模内皮细胞实验研究。     

阻断ICOS对小鼠移植胰岛功能影响的实验研究

目的：在小鼠胰岛移植模型基础上，通过阻断可诱导共刺激分子（ICOS）。探讨ICOS单克隆抗体（ICOSmAb）对移植胰岛功能的影响。方法：供体为近交系昆明小鼠，受体为C57小鼠。受体小鼠随机分成5组，每组10只。假手术组：受体小鼠仅行开腹手术，不行胰岛移植；对照组：单纯胰岛移植，不给ICOS mAb；实验1、2、3组：分别于胰岛移植后1、3、5d腹腔内注射ICOSmAb50、100、200μg/kg。观察小鼠胰岛移植后移植物存活时间和移植胰岛病理改变，流式细胞仪检测ICOS在T淋巴细胞上的表达。结果：实验2组小鼠移植胰岛存活时间和实验3组相同，统计学分析无显著性差异，而较对照组及实验1组明显延长（P〈0．05）。ICOS在移植术后7d受体小鼠T淋巴细胞上表达明显上调。结论：ICOS分子在小鼠同种异体胰岛移植排斥反应中表达上调。参与了排斥反应的发生。ICOSmAb通过阻断ICOS共刺激信号途径，诱导小鼠同种异体胰岛移植免疫耐受，减轻排斥反应，延长移植胰岛有功能存活时间。ICOS mAb的最佳给药剂量为100μg/kg。     

大鼠胰岛的分离和钙化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅵ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％－１     

内皮细胞促进胰岛的成活与功能

目的：探讨内皮细胞对胰岛细胞活性与功能的支持作用。方法：内皮细胞和胰岛分别被分离纯化,在共
培养中评估胰岛细胞活性与功能;体内试验分为单纯胰岛移植组、胰岛-内皮共移植组、内皮细胞移植组和PBS对照
组,测定血糖和胰岛素水平,免疫组织化学染色及电镜下观察组织细胞形态、结构及细胞标志物鉴定。结果：培养
7 d,超过90%的胰岛细胞显示正常形态。共培养组中的胰岛素释放水平显著高于胰岛培养组(P<0.05)。移植3 d后,各
移植组的血糖和胰岛素水平明显不同(P<0.05)。胰岛-内皮共移植组和单纯移植组间比较,胰岛存活时间差异有统计
学意义(P=0.001)。结论：与内皮细胞在体外共培养能改善分离的大鼠胰岛细胞活性与功能,同内皮细胞共移植能够
有效地延长糖尿病大鼠胰岛移植物存活期。     

人胰岛的分离纯化和功能评价

目的 应用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化人的胰岛,并进行功能和安全性的评价.方法 获得6例成人尸体胰腺组织供体,采用胶原酶消化法及密度梯度离心法分离和纯化胰岛,并分析胰岛的数量、纯度和活力.采用免疫荧光法分析胰岛内分泌细胞的组成和分布;检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛移植后的动物血糖水平.并对分离胰岛的安全性指标进行评价.结果 分离纯化后的胰岛数量为(22.9±3.1)万IEQ,纯度为(59.0 ±8.9)%,活力为(89.0±3.0)%.免疫荧光显示,胰岛由4种内分泌细胞组成并呈正常分布.葡萄糖刺激胰岛素释放的刺激指数为8.1 ±4.0.胰岛移植于糖尿病裸鼠后,血糖在3 d后降至正常水平并维持超过30 d.分离胰岛样本的各项安全性指标在规定范围之内.结论 采用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化的胰岛在形态、结构、数量、纯度、活力、体内外功能以及安全性方面都达到临床胰岛移植的标准,为开展临床胰岛移植奠定了基础.     

链脲霉素对猪胚胎前胰岛作用的研究

将体外分离培养的猪胚胎前胰岛和大白鼠胚胎胰岛,分别放入含2.2mmol/L,4.4mol/L链脲霉素和无链脲霉素对照培养液中作用30min后,放入新鲜培养液中培养1周。经光镜检查证明,链脲霉素组大白鼠胚胎胰岛全部消失,对照组大白鼠胚胎胰岛保持半透明桔黄色完整结构。处理组和对照组猪胚胎前胰岛的形态学无显著变化,均呈半透明桔黄色,且对高浓度葡萄糖加氨茶碱的刺激有释放胰岛素的反应,体内试验证明,链脲霉素不影响移植在裸鼠体内的猪胚胎前胰岛的衍化发育及其逆转糖尿病的功能。本研究证明了链脲霉素对猪胚胎前胰岛无毒性作用,为胚胎前胰岛移植研究提供了新的实验模型。     

改良的新生猪胰岛细胞体外培养

介绍一种通过细胞分离及体外培养获得大量新生猪胰岛细胞团的方法，新生猪胰腺经0．5－1mg.ml^-1的V型胶原酶消化8－12min，再经体外培养7d，可获大量纯化的胰岛细胞团，同时，新生猪胰岛内的B细胞不仅胰岛素分泌功能良好，而且其超微结构正常，提示新生猪胰岛细胞可作为异种移植治疗1型糖尿病重要的供体来源。     

应用淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的实验研究

目的：建立一种简便、易行和高效的胰岛分离纯化方法，以减少对胰岛细胞的损伤，获得高质量的胰岛组织。方法：选用SD大鼠经胆总管原位灌注胶原酶液，分离消化胰腺组织，用淋巴细胞分离液(histopaque-1077)纯化胰岛细胞。结果：可收获大量的高纯度胰岛，纯度达95％以上，体外葡萄糖刺激实验表明胰岛对刺激反应良好，将胰岛移植于糖尿病小鼠体内可短期纠正其高血糖状态。结论：应用单一密度淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的方法是一种操作简单、价格低廉、重复性好的大鼠胰岛纯化方法。     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅺ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％—１６％—１４％—９％梯度所获得胰岛的纯度＞９０％。胰岛移植于糖尿病小鼠可使其血糖从移植前的（２６．７０±２．５３）ｍｍｏｌ／Ｌ降低至（１３．９８±３．９２）ｍｍｏｌ／Ｌ，维持２～３ｄ。结论：所改进的制备方法可获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。