肝癌中c-fms癌基因异常表达及意义

通过观察人肝癌和癌旁肝组织中ｃ ｆｍｓ癌基因异常表达规律及结构变化 ,探讨其异常激活机制与点突变在肝癌中的关系及意义。一、材料与方法1.取病理学证实的同一人份肝癌及癌旁肝组织 30例 ,其中男 2 5例 ,女 5例 ,平均年龄 32 .5岁。正常肝组织 5例 ,胎肝组织 5例。2 .选择ｃ ｆｍｓｃＤＮＡ第 386～ 40 8位氨基酸间亲水性密集片段 ,以固相法合成多肽 ,经高效液相色谱仪纯化后 ,致敏新西兰兔 ,制备抗ｃ ｆｍｓ癌基因抗体 ,免疫印迹法检测抗体效价为 1∶12 0 0。3 .按免疫组化法 (ＡＢＣ法 )进行组织标记。4.提取免疫组化阳性表达的肝癌及…     

反义与正义HSP70mRNA真核表达载体的构建

生物细胞在受热或其它理化因素(如乙醇、氨基酸类似物、DNA损伤、缺氧、重金属离子、病毒感染、胞内出现变性、结构改变蛋白质等)应激时,可启动热休克基因,合成热休克蛋白(heat shock proteins,HSP).按分子量大小,HSP分成五大家族.在大多数生物中,HSP_(70)系含量最多的HSP.HSP70具有     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )-GFP，并观察其在Hep2细胞中的表达情况。方法据已知的EGFP基因序列，设计合成1对引物，并引入HindⅢ和EcoR V酶切位点。应用PCR技术，从含有EGFP的pAdTrack-CMV中扩增EGFP编码基因。通过TA连接将其克隆人pGEM-T easy载体，经PCR及限制性内切酶鉴定后，插入真核表达质粒pcDNA3．1( )中，转化Escherichia coli DH50感受态细胞，于Amp^ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经HindⅢ和EcoR V双酶切、PCR鉴定，将该载体转染入喉癌细胞Hep-2后48h观察EGFP表达情况。结果 成功构建了含EGFP编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )GFP，并成功转染Hep2细胞，在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。结论 获得可产生绿色荧光的EG-FP，能方便地用作报告基因和筛选标记。     

重组单纯疱疹病毒-胸苷激酶和人白介素-2基因痘苗病毒真核表达载体的构建

目的 松建含单纯疱疹病毒-胸苷激酶（HSV-tk）和人白介素-2（hIL-2）基因的痘苗病毒真核表达载体pMJ601,为进一步实施胃癌的基因治疗作必要的准备。方法 利用目的的基因与载体的连接、感受态细胞的制备及转化、质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、DNA序列分析等多种基因工程技术,将纯化回收的HSV-tk和hIL-2分别与pMJ601进行连接、转化并鉴定。结果 分别用BamH I-HindⅢ和Sal I-BamH I酶切位点,将HSV-tk与hIL-2DNA成功地克隆到pMJ601真核表达载体。结论 重组HSV-tk hIL-2基因PMJ601的构建,为进一步研究胃癌的基因治疗打下坚实的基础。     

核心蛋白聚糖真核表达载体及逆转录载体的构建及鉴定

目的：通过获取核心蛋白聚糖（ｄｅｃｏｒｉｎ,ＤＣＮ）基因,构建ＤＣＮ真核表达载体和ＤＣＮ逆转病毒载体,以探索今后肾脏疾病基因治疗的途径。方法：从大鼠肾脏组织中抽取ＲＮＡ,经逆转录－ＰＣＲ方法,扩增核心蛋白聚糖ｃＤＮＡ,并经序列测定正确后,将ＤＣＮ插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导将ｐｃＤＮＡ３－ＤＣＮ转染真核细胞ＣＯＳ－７细胞,并于转染后４８、７２和９６ｈ用ＥＬＩＳＡ     

HBV.CP—β—IFN真核表达载体的构建及鉴定

目的 扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,将其与β－干扰素基因进行连接,以构建真核表达载体,为下一步研究表达打下基础。方法 ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,产物经ＤＮＡ自动测序正确后,与表达干扰素的ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ质粒进行粘端连接,并对构建真核表达载体进行限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析。结果 扩增出ＨＢＶ,ＣＰ,序列与报告资料基本一致;与ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ真核表达载体。     

表达HSV-TK痘苗病毒真核表达载体pMJ601的构建与鉴定

目的：构建含自杀基因（HSV－TK）的痘苗病毒真核表达载体pMJ601，为进一步实施胃癌的基因治疗作必要准备。方法：利用目的基因与载体的连接，感受态细胞的制备及转化、质粒抽提、琼脂糖 凝胶电泳、酶切等多种基因工程技术将胶纯化回收的HSV－TK与p MJ601进行连接、转化及鉴定。结果：克隆在X－pPNT质粒上的HSV－TK DNA成功地被克隆到经BamH I-HindⅡ双酶切的pMJ601载体上。结论：重组HSV－TK痘苗病毒真核表达载体pMJ601的构建，为胃癌自杀基因的基因治疗打下坚实的基础。     

乙型肝炎病毒preS1基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建含preS1基因真核表达质粒，探讨乙型肝炎病毒preS1基因在HBV入胞机制中的作用。方法：PCR法扩增含EcoR I与Pst I酶切点的preS1基因序列，PAS2-1载体及preS1基因PCR产物双酶切，经T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒经序列测定，命名为PAS 2—1—preS1。经乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母茵AH109，Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒PAS2—1-preS1经序列测定合有完整的preS1基因片段，转入酵母后经Western Blot证实酵母细胞正确表达preS1-BD融合蛋白。结论：PAS2—1—preS1的构建为通过酵母双杂交体系筛选体内与preS1蛋白相互作用的preS1相关蛋白，为进一步深入探讨preS1在HBV致病机制中的作用奠定了基础。     

分泌性内皮抑制素真核质粒治疗小鼠肝癌的初步研究

目的 构建并表达分泌性内皮抑制素真核表达质粒,以此对肝癌进行基因治疗。方法 人工合成Ig κ信号肽序列,和内皮抑制素编码序列一起克隆入pcDNA3.1质粒。重组质粒转染上清液作用于ECV304内皮细胞,MTT法检测内皮细胞的增殖。局部注射重组质粒治疗接种在小鼠腿部肌肉内的H_(22)肝癌瘤株,疗程结束后解剖称取瘤重。结果 构建的内皮抑制素真核表达质粒转染上清液可以抑制内皮细胞的增殖抑制率为29.2％。经质粒裸DNA注射治疗后,治疗组瘤重[(1.34±0.96)g]比空载体组[(2.70±0.82)g]和生理盐水组[(3.73±1.41)g]明显减小(P<0.05)。结论 分泌性内皮抑制素真核表达质粒用于H_(22)肝癌的基因治疗有一定效果。     

肝癌C-fms癌基因甲基化水平与临床病理关系

目的：观察肝癌发生过程中c-fms癌基因甲基化水平的变化。以阐明c-fms(CSF-1R)（集落刺激因子－1受体）在肝癌组织中的异常高表达机制。方法 采用限制性内切酶HpaⅡ/Msp Ⅰ酶切30例肝癌及配对的癌旁肝组织基因组DNA,Southern杂交法检测基甲基化状态。比较肝癌及癌旁肝组织中c-fms癌基因甲基化水平,判断其与临床病理学的关系。结果 36．7％（11／30）肝癌组织及13．3％（4／30）癌旁肝组织中c-fms癌基因甲基化水平降低.c-fms癌基因在肝癌组织中的低甲基化发生率高于癌旁肝组织。Edmondson分级与肝癌组织中c-fms癌基因低甲基化发生率有显著性意义。Ⅲ-Ⅳ级发生率明显高于Ⅰ～Ⅱ级。结论 c-fms癌基因低甲基化改变导致CSF－1R异常高表达,可能是促使肝癌发生和发展的重要分子生物学机制。     

小鼠IL-4真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-4(murine interleukin-4,mIL-4)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠IL-4基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,利用电泳和测序鉴定重组质粒的大小、序列。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-4转入293T细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其表达。结果经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-4构建成功,并在293T细胞中成功表达。结论 pcDNA3.0-mIL-4可在真核细胞中成功表达,为进一步研究其在炎症性肠病(IBD)动物模型中的生物学功能提供了条件。     

MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物．进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)．先将扩增产物克隆至pGEM—T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中．然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3．1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamHⅠ和HindⅡ)鉴定．证实其中有目的片段完整插入．插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

携带GDNF基因转移的真核表达载体的构建及表达

目的 构建pcDNA3.1( )GDNF真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法 将GDNF逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）产物克隆至pcDNA3.1( )真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以Fu Gene 6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性。结果 酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白。结论 以Fu Gene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒转染真核细胞为基因治疗帕金森氏病奠定了一定基础。     

肝细胞癌高表达基因TPT1真核报告表达载体的构建及鉴定

目的构建TPT1真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1,为进一步研究其功能奠定基础.方法通过PCR和酶切的方法获取具有黏性末端的TPT1基因的全长开放读码框,将其定向连入真核表达载体pEGFP-N3绿色荧光报告基因的氨基侧,构成pEGFP-N3TPT1的真核报告表达载体,通过酶切和测序鉴定TPT1的正确插入.结果酶切和测序均证实TPT1正确插入了真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1中.结论成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1.     

KAI1复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响。方法 用Ad—EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法，构建Ad—KAI1腺病毒载体，并在293细胞中包装、扩增和纯化，用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达。结果 构建的Ad—KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANCl，并检测到感染Ad-KAI1的PANCl细胞中KAI1的高表达；同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANCl的迁移。结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移，为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据。     

甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒，并研究其在真核细胞中的表达。方法 根据Genbank（NCBI ISDN13425）中查得的M2e编码序列，设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端，退火后使之互补结合成为M2e编码序列；然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2ef经酶切和DNA测序鉴定后，转染HEK293细胞。用免疫荧光技术检测pcD—NA3．1（＋）-M2e在HEK293细胞的表达。并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链，插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3．1（＋）-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上，转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖，表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2e，表达的M2e蛋白不仅存在于绳胞膜上，也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。     

NDRG2截短体真核表达载体的构建

目的：构建稳定表达N-MYC下游调节基因2（NDRG2）截短体的真核表达载体。方法分别用PCR方法扩增NDRG2的截短体NDRG21～178aa和NDRG21～257aa ，以BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，以SolutionⅠ连接酶反应体系将NDRG2截短体片段装载入pCDNA4．0表达载体中，并通过蛋白免疫印迹（Western blotting）验证载体的表达。结果 NDRG2截短体在pCDNA4．0表达载体中正确表达。结论成功构建了NDRG2截短体的真核表达载体。