痘苗病毒介导白细胞介素-2基因转染C6胶质瘤细胞体外生物学特性的改变

目的研究痘苗病毒介导白细胞介素-2(rVV-IL-2)基因转染C6胶质瘤细胞体外生物学特性.方法扩增痘苗病毒载体,按重复感染度(MOI)=0.251、0.51、11、51、101、201转染C6胶质瘤细胞,分别检测转染后2、4、6、8、12、24 h白细胞介素-2(IL-2)的表达;应用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法对照检测转染细胞(MOI=11、51、101)及未转染细胞增殖能力的变化.结果扩增后病毒滴度为1.0×109pfu/ml;rVV-IL-2转染细胞后2 h可有IL-2明显表达(MOI=11),8 h后可达200U/ml,MOI＜11时IL-2表达量随接种病毒量的增加而提高,MOI＞11时增加病毒细胞比IL-2表达量无明显增加;病毒转染对体外C6胶质瘤细胞增殖能力无影响.结论rVV-IL-2可体外转染C6胶质瘤细胞并高效表达.     

肝癌自杀基因治疗与基因体内导入方法和途径的实验研究

我们采用携带单纯疱疹病毒胸苷激酶 (ＨＳＶ ｔｋ)基因的质粒型ＥＢ病毒(ＥＢＶ)复制子表达载体ｐＤＲ2 /ｔｋ ,研究其转染人肝癌细胞 (ＳＭＭＣ 772 1)后对更昔洛韦 (Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ )和阿昔洛韦(ＡＣＶ)的敏感性 ,包括杀伤作用和“旁观者效应”。在此基础上 ,根据肝脏的血供及肝癌手术治疗特点 ,利用携带人ＩＬ 2基因的ＥＢＶ复制子表达载体ｐＤＲ2 /ＩＬ 2 ,研究肝癌基因治疗中接近临床应用的最佳体内直接基因转移方法和途径。1.材料和方法 :表达载体ｐＤＲ2 /ｔｋ和ｐＤＲ2 /ＩＬ 2在中国预防医学科学院病毒所国家重点实…     

PTEN基因治疗鼠C6胶质瘤的体内实验研究

目的 探讨PTEN基因在动物体内对脑胶质瘤的生长作用。方法 将大鼠C6胶质瘤细胞（对照组）和转染PTEN cDNA的C6细胞（转染组）种植于SD大鼠右侧尾状核。荷载C6脑胶质瘤鼠用PTEN cDNA原位治疗（治疗组）。并以空载体治疗作为对照（空载组）。每组10只。观察大鼠的一般情况、生存期、肿瘤体积变化以及肿瘤病理组织学与细胞生物学特征变化。结果 对照组和空载组大鼠均于3周内死亡。而转染组5只大鼠和治疗组6只大鼠观察60d内无自然死亡，生存期较对照组明显延长（P〈0．01）。结论 PTEN基因在动物体内可以抑制脑胶质瘤的生长。可以成为恶性胶质瘤基因治疗的优选靶之一。     

阻断白细胞介素-6自分泌基因表达对膀胱癌细胞的影响

我们采用反义寡核苷酸阻断白细胞介素 (ＩＬ) 6自分泌基因表达 ,为探讨膀胱肿瘤治疗新途径提供可行性依据。一、材料与方法1 .反义脱氧寡核苷酸 (ＯＤＮ)设计合成 :ＩＬ 6反义ＯＤＮ设计参阅文献[1 ],由Ｃｙｂｅｒｓｙｎ公司合成并硫化修饰。反义ＯＤＮ转染Ｔ2 4用Ｆｕｇｅｎｅｔｍ6转染试剂 (德国Ｒｏｃｈｅ公司产品 )。2 .反义ＯＤＮ对膀胱癌细胞的影响 :( 1 )反义ＯＤＮ对Ｔ2 4细胞ＩＬ 6基因表达的影响 :Ｔ2 4细胞按 5× 1 0 6 个 /瓶接种于培养瓶中 ,分为Ｔ2 4对照组、正义ＯＤＮ组 ( 1 0 μｍｏｌ/Ｌ)、反义ＯＤＮ组 ( 1 0 μｍｏｌ/…     

反义AKT2 RNA逆转C6胶质瘤的细胞恶性表型

目的研究反义AKT2RNA逆转C6鼠脑胶质瘤细胞恶性表型。方法将逆转录病毒LXSN为载体的反义AKT2构建体脂质体复合物直接转染人脑胶质瘤细胞系TJ905和鼠脑胶质瘤细胞系C6,LXSN载体转染组为空载对照。随机筛选阳性克隆并应用蛋白印记和原位杂交鉴定转染。MTT法和TUNEL法评价细胞的增殖活性和凋亡,Transwell法分析侵袭能力,划痕实验研究细胞迁移能力,流式细胞法分析细胞周期,并进行GFAP的表达分析。结果转染ASAKT2cDNA后C6细胞AKT2表达显著抑制。与C6对照组和LXSN空载组比较,转染反义AKT2后C6细胞存活率均明显下降(P<0.01),凋亡指数增加(0.33vs13.67,P<0.01),侵袭能力和细胞迁移能力抑制,诱导细胞出现G0/G1细胞周期阻滞,上调GFAP的表达。结论反义AKT2RNA基因治疗通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭与迁移并使G0/G1细胞周期阻滞逆转其恶性表型,AKT2可作为基因治疗胶质瘤的重要优选靶的。     

超微载体介导反义端粒酶RNA抑制胶质瘤细胞生长的研究

目的　研究用体内可降解的聚乳酸 (PLA)和o 梭甲基壳聚糖 (CMC)制成的超微载体介导端粒酶RNA(hTR)反义寡核苷酸在体外对TJ90 5人脑胶质瘤细胞的作用。方法　用PLA和CMC制成超微载体 ,并用其介导hTR反义寡核苷酸在体外转染TJ90 5细胞 ,通过噻唑兰比色法(MTT)、改良端粒重复序列扩增法 (TRAP)、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对细胞转染情况作检测。结果　超微载体在体外能有效转染hTR反义寡核苷酸 ,48h后细胞存活率为 46.84% ,hTR、端粒酶催化亚基mRNA和端粒酶的活性水平分别为 0 .3 16、0 .0 2 4、5 1.40 0 ,明显受到抑制。结论　hTR可作为胶质瘤基因治疗靶点 ,超微载体能有效转染基因药物 ,可替代病毒载体。     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 探索用腺病毒作载体对脑胶质瘤进行基因治疗。方法 构建含ＣＭＶ启动子的ＨＳＶ－ｔｋ基因的重组腺病毒载体，将ＨＳＶ－ｔｋ基因转移至人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ４４，用ＭＴＴ方法测定ＧＣＶ对肿瘤细胞的杀伤效果。结果 转染ＨＳＶ－ｔｋ基因的ＳＨＧ４４细胞以ＧＣＶ的敏感性增高８０倍，ＭＯＩ为１００时，５ｍｇ／Ｌ的ＧＣＶ能完全杀伤肿瘤细胞，并存在旁观者效应，一个转基因细胞能引起的１０倍的亲本细胞对ＧＣＶ敏感。结     

表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体.方法 根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为pGC-FU-Cdh1.对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定.将293T细胞按完全随机法分为实验组(每组3只)及对照组(每组3只),分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞,倒置荧光显微镜观察后,Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况,慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定. 结果 重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中;转染293T细胞后,Western blot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1 -GFP的表达(每组3只),对照组无Cdh1-GFP的表达(n=0)(P=0.014);慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,Reahime PCR法测定滴度为2E+8 TU/ml. 结论 成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1,并包装为慢病毒,为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础.     

连接蛋白43联合自杀基因治疗胶质瘤的研究

我们在体内、外研究了连接蛋白(Connexin ,Cx) 43基因与自杀基因联合治疗胶质瘤 ,以期提高胶质瘤自杀基因治疗的疗效。一、材料与方法1.通过同源重组获得复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV tk)。Southern杂交鉴定。空斑法测定腺病毒滴度。2 .脂质体介导Cx43cDNA的转染见文献 [1]。3 .原位杂交 :采用地高辛标记的TK( 1.8kb)和Cx43( 1.39)探针[1] 。4.体外实验 :96孔板每孔接种 4×10 3C6Cx/C6细胞 ;按重复感染率 (MOI)= 0 ,10 (CG10 /G10 ) ,10 0 (CG10 0 /G10 0 ) ,加入AdCMV tk孵育 12h ;加入浓度为 0 ,10 -3 ～ 10 3 mg/L更昔洛韦…     

携带tk基因的EB病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导、杀伤和旁观者效应

目的　研究携带ｔｋ 基因ＥＢ病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导、杀伤和旁观者效应。方法　设更昔洛韦（ＧＣＶ）组、阿昔洛韦（ＡＣＶ） 组和对照组共３ 组,脂质体包裹质粒转染人肝癌细胞后分别加入不同浓度药物;已转染基因的细胞与未转染的细胞不同比例混合,每孔分别加入ＧＣＶ。样本７２ 小时后ＭＴＴ比色法检测杀伤和旁观者效应。结果　ＧＣＶ 或ＡＣＶ 均在０ ．２μｍｏｌ／Ｌ浓度即可对转染ｔｋ 基因的肝癌细胞产生杀伤作用并依浓度呈梯度变化。ＧＣＶ 在转染／未转染肝癌细胞１∶５ 的混合比率时即可产生明显的旁观者效应。结论　ＥＢ 病毒复制子载体适合携带ｔｋ 自杀基因用于肝癌基因治疗。     

转染人Angiostatin K(1-3)基因的C6细胞在大鼠脑内的致瘤性研究

目的研究人 AngiostatinK(1-3)IAK(1-3)I对大鼠C6脑胶质瘤的抑瘤效应.方法构建真核表达载体 pcDNA3-SAK(1-3),用脂质体法导入C6细胞后,与正常C6细胞对照,分别接种于Wistar大鼠脑内,进行生存期及脑内瘤灶大小的比较,脑标本行苏木素-伊红(HE)及Ⅷ因子血管染色.结果接种转基因C6细胞的大鼠脑内无肉眼可见的瘤灶,其生存期明显长于接种正常C6细胞的大鼠(P<0.01),HE及Ⅷ因子染色只可见显微大小的无血管瘤灶.结论旁分泌形式作用于瘤内血管内皮细胞的人 AK(1-3),可明显抑制瘤内血管生成,进而抑制肿瘤生长.     

p16基因对大鼠肝癌生长抑制作用的研究

1 .材料与方法 :大鼠肝癌细胞系CBRH 7919来自中科院上海细胞生物研究所。Wistar大鼠 30只 ,体重 (15 0± 2 0 )g ,雌雄不限 ,购自天津市医学实验动物中心。pcDNA3 0 /p16真核表达质粒转染CBRH 7919细胞后MTT法检测细胞增殖 ;流式细胞仪检测细胞周期 ;双层软琼脂培养观察细胞克隆形成能力 ;大鼠原位肝癌基因治疗观察其体内成瘤能力。结果用统计软件SPSS行t检验。2 .结果 :(1)重组质粒转染CBRH 7919细胞P16蛋白免疫组化显示有P16蛋白表达。 (2 )流式细胞仪分析pcDNA3 0 /p16质粒转染 7919细胞细胞周期结果 (表 1)。 (3)双层软琼…     

携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体的筛选

目的:筛选能够显著抑制自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因表达的携带ROCK2基因siRNA的慢病毒载体。方法:设计并合成4个靶向ROCK2的siRNA片段,构建并包装成慢病毒载体。随机将5只SHR阴茎海绵体平滑肌细胞分为6组,每组每个样本3×104个细胞,每组5个样本,分别为:A组(未转染对照组)、B组(携带慢病毒转染组)、C~F组(分别携带靶向ROCK2基因siRNA 1~4号靶点的慢病毒转染组),以感染复(MOI)=80转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后48 h荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况,并用RT-PCR检测各组被转染细胞ROCK2 mRNA的表达。结果:荧光显微镜下观察各组细胞转染效率均50%。与A组相比,B组ROCK2 mRNA的表达无明显改变(P﹥0.05);C、D、F组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组极显著下降(P0.01),抑制效率分别达到(43.91±8.19)%、(47.15±6.64)%、(25.7±6.03)%;E组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组显著下降(P0.05),抑制效率为(16.81±5.94)%。结论:本研究构建的4种携带ROCK2基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因的表达,其中有1种慢病毒载体抑制作用最强。     

干细胞移植入鼠胶质瘤模型体内后的生物学观察

目的 体外培养扩增大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)及骨髓基质细胞(BMSCs),并移植入大鼠胶质瘤模型体内,观察细胞生物学特性改变及其对胶质瘤的影响.方法 取孕15 d的大鼠海马区神经干细胞及大鼠股骨骨髓基质细胞,体外培养扩增;建立胶质瘤模型,待肿瘤生长至3周和4周时,分别随机抽取5只大鼠行MRI检测;分不同时间段大鼠灌注取材,分别做苏木素一伊红(HE)染色及BrdU免疫组织化学染色,观察细胞存活情况及对胶质瘤的影响.结果 两种细胞移植人胶质瘤模型体内均能够大量存活.BMSCs组、NSCs移植组、对照组模型平均生存时间分别为4.03、4.28、3.88周;3周及4周时肿瘤的平均直径分别为(6.4mm/7.6mm、5.4mm/6.0mm、7.2mm/8.0mm).BrdU染色示两种细胞均对胶质瘤细胞有定向靶向作用.结论 神经干细胞对胶质瘤细胞的生长有抑制作用,能够延长大鼠模型的生存期.骨髓基质细胞对胶质瘤生长无抑制作用.两种细胞均对胶质瘤细胞有定向靶向作用,能够作为生物载体转染目的 基因治疗胶质瘤.     

腺相关病毒介导人含脑源性神经营养因子基因在体外成纤维细胞中表达的研究

腺相关病毒 (ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ ,ＡＡＶ)是感染人类的缺陷微小病毒。有研究表明 ,重组腺相关病毒 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡＡＶ ,ｒＡＡＶ)载体能有效转导脑和脊髓神经元细胞 ,使外源基因持续表达而不产生毒性反应[1] 。我们制备含脑源性神经营养因子 (ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ ,ＢＤＮＦ)基因的重组腺相关病毒 ,并进行了体外转染表达的实验 ,以期为ＡＡＶ介导转神经营养因子基因治疗中枢神经系统疾病的研究奠定基础 ,现报道如下。一、材料和方法1.重组人ＢＤＮＦ腺相关…     

转染连接蛋白基因对胶质瘤细胞细胞间隙连接通讯及其生长变化的研究

目的　研究连接蛋白 (Cx)基因对C6胶质瘤细胞的增殖抑制及细胞间隙连接通讯(GJIC)的作用 ,探讨以Cx43基因治疗胶质瘤的可行性。方法　将含Cx43cDNA的质粒以Lipofec tamine介导转染Cx43表达缺失的C6胶质瘤细胞 ,通过Northern印迹杂交、原位杂交及免疫组织化学染色检测Cx43mRNA及蛋白表达 ,划痕标记荧光染料示踪技术 (SLDT)检测GJIC ,MTT法测定细胞增殖率 ,核仁组成区嗜银蛋白 (AgNOR)染色检测细胞增殖活性 ,TUNEL法检测细胞凋亡。结果　转染后C6细胞有不同程度的Cx43mRNA及蛋白表达和GJIC恢复。表达Cx43的克隆细胞增殖明显下降 ,培养 2～ 6d时 ,每天除C6组与空载组差异无显著性外 ,其余各组差异均有非常显著性 (P <0 .0 1) ,但细胞凋亡并未增加。结论　Cx43基因及GJIC在恶性胶质瘤的发生发展过程中起重要作用 ,可能成为恶性胶质瘤基因治疗的优选靶的之一。     

白细胞介素-4和γ-干扰素基因联合治疗胶质瘤

目的 探讨逆转录病毒载体介导的白细胞介素(IL)-4和γ-干扰素(IFN)基因联合治疗胶质瘤的作用。方法构建携带IL-4或IFN-γ基因的逆转录病毒载体，将其导入逆转录病毒包装细胞；将携带IL-4和IFN-γ基因的逆转录病毒包装细胞分别或联合注射到脑内荷瘤大鼠的肿瘤组织中，观察其治疗作用。结果成功获得携带治疗基因的逆转录病毒包装细胞PA317IFN-γ和PA317IL-4，所产病毒滴度分别为2x10^6cfu／ml和2．5x10^6cfu／ml。包装细胞瘤内注射能够诱导大鼠产生抗肿瘤免疫反应，杀伤肿瘤细胞，联合应用具有协同治疗作用。结论携带IL-4或IFN-γ基因的逆转录病毒包装细胞瘤内注射是一种有效的胶质瘤基因治疗方法，两者联合应用具有协同治疗作用。     

腺病毒介导p16基因转染对胃癌细胞作用的研究

目的　观察以腺病毒为载体介导 p16基因转染对胃癌细胞 (MGC80 3)生长的影响。方法　重组腺病毒Ad p16感染胃癌细胞 ,观察胃癌细胞生长情况 ;用Ad p16感染胃癌细胞接种于大鼠体内 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠接种的阳性率 ;用重组腺病毒Ad p16作用于胃癌大鼠模型 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠肿瘤的生长情况。结果　p16可以抑制胃癌细胞生长 ,促进胃癌细胞的凋亡 ,经Ad p16感染的胃癌细胞肿瘤发生率明显下降 (由 90 %降至 2 0 % )。腺病毒介导 p16基因作用胃癌大鼠模型 2周后肿瘤的重量 ( 2 .2 1± 0 .2 6 )g明显低于对照组 ( 5 .6 4± 0 .5 3)g ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。应用免疫组织化学检查可见肿块有明显的淋巴细胞侵润。结论　腺病毒介导 p16基因对胃癌细胞有明显的抑制作用。     

Smad 6和Smad 7基因治疗对肾小管间质纤维化进程的影响

目的 观察腺相关病毒(rAAV)介导的Smad6和Smad7基因治疗对单侧输尿管梗阻性(LIUO)肾小管间质纤维化进程的影响。方法 构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体，再将此病毒颗粒通过肾动脉途径转移到UUO模型。30只Wistar大鼠随机分为假手术组、梗阻组、LacZ AAV转染组、Smad6 AAV转染组和Smad7 AAV转染组(n=6)，于术后第3周处死大鼠。采用β-半乳糖苷酶染色和免疫组化观察外源基因的定位，Western印迹法观察外源基因、胞内磷酸化Smad2、PAI-1和α-SMA的表达；底物酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性，分光光度法测定肾组织羟脯氨酸含量。结果 Smad6和Smad7成功地转染到外髓的肾小管间质区，定位在肾小管和集合管细胞，而血管细胞、肾小球或间质细胞均未见有AAV转移基因的表达。Smad7基因治疗可显著降低肾组织PAI-1、α-SMA的表达和肾组织羟脯氨酸含量，增加MMP-2和MMP-9活性，这些作用与Smad7阻断Smad2磷酸化有关。相反，Smad6没有这样的治疗作用。结论 Smad7基因转移能有效缓解单侧输尿管梗阻肾小管间质纤维化，AAV介导的Smad7基因转移有望成为治疗肾小管间质纤维化的方法之一。     

腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。