miR-21在UVB照射的人角质形成细胞和人表皮鳞癌细胞中的差异表达

目的 方法 研究miR-21在紫外线B(UVB)照射的人角质形成细胞HaCaT和人表皮鳞癌细胞A431中的差异表达。方法 50 J/m² UVB照射HaCaT细胞和A431细胞后,通过实时荧光定量RT-PCR检验miR-21的表达水平;利用在线数据库PicTar等预测靶基因并用Gostat软件对靶基因基因进行功能分类。结果 miR-21在表皮鳞状细胞癌中的表达是正常角质形成细胞的4倍多;miR-21在经UVB照射后HaCaT细胞中,在2～4 h内,其表达水平是升高的,在随后的8 h,其表达水平与对照相比降低了2倍,到12 h后表达水平就不再变化;在照射后的A431细胞中,miR-21的表达水平没有明显改变。在对其靶基因预测后用Gostat进行功能分类发现,PIK3R1、BCL2、E2F3等基因参与细胞的分化及细胞的周期进程。结论 miR-21可能参与表皮鳞状细胞癌的致病机理,并可能在UVB诱导的损伤机制中发挥作用。     

紫外线对角质形成细胞的细胞因子分泌的影响

目的　观察紫外线 (ultraviolet,U V)对体外培养的角质形成细胞株 (Ha Ca T细胞 )细胞因子分泌的影响。方法　 UV照射佛泊脂和脂多糖 (PMA/L PS)刺激的 Ha Ca T细胞 ,用 EL ISA法检测细胞培养上清液中细胞因子 IL - 1α、IL - 2、IL - 6和 IL - 8的含量。结果　正常 Ha Ca T细胞有 IL - 1α、IL - 2、IL -6和 IL - 8的自发性分泌。 PMA和 L PS刺激 Ha Ca T细胞 ,其 IL - 1α分泌量下降 (P<0 .0 5 ) ,IL - 6和 IL - 8分泌量明显增加 (P<0 .0 1)。正常 Ha Ca T细胞经 U V照射 ,IL - 1α、IL - 2、IL - 6的分泌无明显变化 (P>0 .0 5 ) ,IL - 8分泌量升高 (P<0 .0 5 )。 PMA和 L PS刺激的 Ha Ca T细胞经 UV照射 ,其 IL - 1α、IL - 6和 IL -8的分泌量明显增加 (P<0 .0 1)。结论　 U V对不同状态下 Ha Ca T细胞的作用是不同的     

miR-193b在HepG2细胞中下调K-Ras蛋白表达

目的探讨microRNA-193b（miR-193b）在HepG2细胞中对K-Ras蛋白表达的调控作用。方法 Tar-getScan软件预测获得miR-193b调控候选靶基因K-ras;构建包含预测miR-193b作用靶位点的K-rasmRNA3′UTR野生型和突变型荧光素酶报告基因载体pGL-KRAS和pGL-Mu-KRAS,检测转染HepG2细胞的荧光素酶活性;合成miR-193b的dsRNA,转染HepG2细胞,实时定量PCR和Western印迹检测对K-rasmRNA和蛋白表达的影响。结果与结论 miR-193b可以与K-rasmRNA3′UTR结合。在HepG2中,miR-193b在mRNA和蛋白水平下调K-ras基因表达。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

miR-182调控RECK信号通路在非小细胞肺癌进展中的作用

目的探讨miR-182在非小细胞肺癌(NSCLC)发展中的作用及其相关机制。方法采用实时定量PCR检测NSCLC细胞系以及30组配对的NSCLC患者癌组织和癌旁组织样本中miR-182的表达水平。在NSCLC细胞株A549和H1299中过表达miR-182后,测定细胞增殖活性及侵袭转移能力。利用荧光素酶活性实验鉴定miR-182的预测靶基因(RECK)。采用qRT-PCR和Western blotting分别检测转染miR-182类似物和miR-182抑制物后RECK mRNA和蛋白的表达水平。结果miR-182在NSCLC细胞系和癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,在伴淋巴结转移的肺癌患者癌组织中的表达水平明显高于不伴淋巴结转移者,差异有统计学意义(P<0.01)。过表达miR-182可增强NSCLC细胞株A549和H1299的增殖、侵袭和迁移能力。双荧光素酶实验结果表明,RECK的翻译水平受miR-182直接调控。qRT-PCR和Western blotting 检测结果表明,转染miR-182类似物后,RECK表达水平降低,转染miR-182抑制物后,RECK表达水平升高。结论miR-182可调控RECK的表达,促进NSCLC的进展。     

miRNA分子miR-24的研究进展

mRNA又称microRNA、微小RNA,是一类22个碱基左右的非编码单链小分子RNA,最初于1993年由研究人员在研究果蝇发育的时序性调控过程中发现.最先发现的miRNA为lin-4和let-7,最近十多年来,越来越多的miRNA被发现[1-2].     

Let-7和miR-24在紫外线B诱导的细胞凋亡中的作用

目的 研究let-7和miR-24在紫外线B(UVB)诱导的细胞凋亡中的可能作用。方法 NIH3T3细胞受50 J/m²UVB照射后,用Hoechest 33342/PI染色观察其凋亡情况;RT-PCR检测let-7和miR-24的表达水平。利用在线数据库PicTar等预测它们的靶基因,并用GOstat软件对这些靶基因进行功能分类。结果 荧光显微镜下,NIH3T3细胞经UVB照射后可见典型的凋亡和坏死细胞;let-7和miR-24在UVB照射组的表达水平较对照组明显增加。用GOstat进行功能分类后发现,casp3、bcl2l2、map3k1和cdk5等基因同时也是UVB诱导的细胞周期调节的靶基因。结论 let-7和miR-24可能参与UVB诱导的细胞凋亡。     

p53在细胞自噬发生中的双重调节作用

细胞自噬是一种进化上比较保守的分解代谢过程,不仅参与细胞的许多生理过程,而且与多种病理状态包括癌症相关,因此其调节机制也相当精确且复杂.越来越多的研究表明,抑癌基因p53在细胞自噬反应发生中具有双重调节作用,这主要取决于其亚细胞定位.该文就p53对自噬反应的正、负调节作用及机制作一综述.     

miR-195重组腺病毒表达载体构建及在细胞中的表达

目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195.     

人源性角质细胞生长因子(KGF)的克隆及其表达分析

目的：克隆出正确的人源性角质细胞生长因子（KGF）并探讨影响其表达的因素。方法：应用RT－PCR技术克隆出KGF基因，并用pBV220表达质粒对其进行表达，然后用RNAdraw对其RNA进行分析。结果：带有信号肽的KGF基因在pBV220中表达量为10％左右，而去掉信号肽的KGF基因在pBV220中表达量估计只有1％－2％；利用RNAdraw分析的结果表明前者RNA前端没有形成茎环结构，而后者则形成了茎环结构，结论：KGF基因在细菌中表达量较低，信号肽是影响其表达量的重要因素。     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

移植肾慢性排斥反应的miRNAs差异表达研究

目的通过microRNAs芯片技术,探讨microRNAs（miRNAs）在移植肾慢性排斥反应中的差异表达情况。方法纳入4例慢性排斥反应患者肾穿组织为实验组,3例病理检查正常的肾组织皮质为对照组。采用miRNA芯片筛选出差异表达显著的微小RNA,并用实时定量PCR技术验证芯片结果可靠性。结果紫外分光光度法和变性电泳法证明所提取样本总RNA质量良好,可用于后续的芯片实验。芯片实验结果显示CR组中出现差异表达显著的miRNAs 63个,其中表达显著上调35个,表达显著下调28个。其中有9个miRNAs集中在3个miRNAs基因簇位点：14q32.31,22q11.21,xq27.3。随机选择显著差异表达的miRNAs（hsa-miR-637,hsa-miR-648,hsa-miR-516-5p）进行实时定量PCR验证实验,其CR/NC结果（0.034,2.670,7.846）与芯片结果（0.035,2.660,7.857）相符,证明了芯片结果的可靠性。结论miRNAs在慢性排斥反应患者中出现显著差异表达,深入研究miRNAs在慢性排斥反应中的作用机制将为其预防和治疗提供新途径。     

负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人miR-29a前体全长cDNA（pre-miR-29a）的复制缺陷型腺病毒载体（Ad-miR29a）。方法将pre-miR-29a全基因合成后,插入腺病毒穿梭质粒pDC315,与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE13、Cre共转染人胚肾293细胞（HEK293）,包装重组慢病毒Ad-miR29a,扩增、收集并纯化。对纯化后的Ad-miR29a进行滴度测定、感染性鉴定及PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×109 pfu/ml。PCR鉴定Ad-miR29a可扩增出pre-miR-29a特异片段,而对照Ad-LacZ不能扩增出pre-miR-29a特异片段。Ad-miR29a感染人胃癌SGC-7901细胞后,可明显提高miR-29a的表达丰度。结论成功包装了负载miR-29a的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究microRNAs在肿瘤发生发展中的作用,以及miR-29a在肿瘤治疗中的价值奠定了基础。     

miRNA-33a抑制人结肠癌细胞HCT-116增殖的机制研究

目的 探讨miRNA-33a抑制人结肠癌细胞HCT-116增殖的机制.方法 化学法合成miRNA-33a mimics、miRNA-33a inhibitor及阴性对照(NC)序列,然后转染至HCT-116细胞.转染后48h,采用Real-time PCR检测细胞中miRNA-33a含量的变化,Western blotting检测细胞中Twist蛋白含量的变化;转染后24、48、72h,采用CCK-8的检测肿瘤细胞增殖活性的变化.采用信息学软件预测miRNA-33a与Twist的结合位点,并通过荧光素酶报告基因法证实预测的结合位点.结果 miRNA-33a mimics及miRNA-33a inhibitor转染后可明显上调或下调HCT-116细胞内miRNA-33a的相对含量(P＜0.05),而NC转染组细胞miRNA-33a含量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);miRNA-33a mimics及miRNA-33a inhibitor转染后可明显下调或上调HCT-116细胞内Twist蛋白的表达,与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05),而NC转染组细胞内Twist含量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);miRNA-33a mimics及miRNA-33ainhibitor转染后可明显下调或上调HCT-116细胞对数生长期的增殖活性,转染后48h和72h与对照组比较差异均有统计学意义(p＜0.05),而NC转染组细胞增殖活性与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).荧光素酶实验显示,miRNA-33amimics和miRNA-33a inhibitor转染可以抑制或促进野生型报告基因荧光素酶活性(P＜0.05),而对突变型报告基因荧光素酶活性无明显影响(P＞0.05).结论 miRNA-33a可以通过抑制其靶基因Twist的表达抑制HCT-116细胞的增殖活性.     

乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究

目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制.     

基于microRNA差异表达的精神分裂症与抑郁症共病研究

目的 观察精神分裂症(SZ)患者中差异表达的microRNA(miRNA),从miRNA表达水平上分析SZ与抑郁症的关系.方法 通过基因芯片筛选在SZ患者中差异表达的miRNA.采用实时定量PCR(qRT-PCR)在40例SZ患者外周血单核细胞中验证芯片筛查结果,并进行精神分裂症阳性和阴性症状量表(队NSS)评定,同时检测抑郁症中差异表达的5种miRNA(miR-1972、miR-26b、miR-4485、miR-4498、miR-4743)的表达改变及其与SZ中差异表达的miRNA及PANSS评分的相关性.结果 与正常人相比,SZ患者中33种miRNA存在差异表达(32种表达上调,1种表达下调),且其中8种上调的miRNA(miR-1273d、miR-1303、miR-3064-5p、miR-3131、miR-3687、miR-4428、miR-4725-3p、miR-5096)表达差异有统计学意义(P＜0.05).在抑郁症中差异表达的5种miRNA在SZ患者中差异表达也有统计学意义(P＜0.05),且与SZ中差异表达的8种miRNA呈中、高度相关(r=0.607～0.909,P＜0.01),其中miR-1972与PANSS量表阳性症状得分呈显著正相关(r=0.339,P＜0.05),miR-26b与复合量表因子分呈显著正相关(r=0.342,p＜0.05).结论 SZ与抑郁症不仅具有某些共同的临床表现,二者在分子遗传学方面也可能有共同的病理基础.     

miR-29a抑制胃癌细胞内靶基因VEGF-A的表达及意义

目的 验证胃癌细胞株SGC-7901内miR-29a对靶基因VEGF-A的直接调控作用.方法 采用负载miR-29a的腺病毒载体（Ad-miR29a）感染人胃癌细胞株SGC-7901,上调SGC-7901细胞内miR-29a的表达丰度后,采用RT-qPCR及Western blot法分别检测SGC-7901细胞内VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达;进一步采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-29a是否通过结合在VEGF-A 3＇UTR而直接抑制靶基因表达.结果 与感染阴性对照Ad-LacZ的SGC-7901细胞相比,感染Ad-miR29a的SGC-7901细胞内VEGF-A蛋白表达下降（0.42±0.02 vs.0.91±0.03,P＜0.01）,且VEGF-A mRNA水平亦下调（0.75±0.21 vs.1.15±0.25,P＜0.05）;荧光素酶实验显示,与阴性对照相比,转染miR-29a mimic后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性明显下降（0.56±0.13 vs.0.93±0.06,P＜0.05）;而在VEGF-A 3＇UTR与miR-29a的结合位点被突变之后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性得以恢复.结论 miR-29a通过结合于VEGF-A 3＇UTR相应位点,直接抑制VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达.miR-29a可能成为胃癌基因治疗的有效靶标.     

角质细胞生长因子及其受体在葡萄胎恶性变中的作用

目的探讨角质细胞生长因子(KGF)及其受体(KGFR)在葡萄胎组织发生、发展及预后中的意义和作用。方法收集葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌组织,采用免疫组化、原位杂交法分别从蛋白质、mRNA水平检测KGF和KGFR在良恶性葡萄胎组织中的表达,染色强度及阳性细胞数进行统计分析。结果良性葡萄胎组织滋养细胞中KGF和KGFRmRNA、蛋白均有一定程度表达,定位于细胞滋养细胞、合体滋养细胞胞质。恶性葡萄胎组织KGF表达与良性葡萄胎无差异,但KGFR在合体滋养细胞中表达明显高于良性葡萄胎,两者之间有显著性差异(χ2=12·775,P<0·01)。KGFR在侵蚀性葡萄胎及绒癌组织中的表达也明显高于良性葡萄胎(χ2=19·542,χ2=24·723,P<0·001)。结论KGF及KGFR的表达与滋养细胞肿瘤转移密切相关,在葡萄胎恶性变及浸润、转移中起重要作用。     

人神经生长因子在CHO细胞中的高效稳定表达

神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)是神经系统重要的营养因子[1 ] 。NGF的主要生物学效应是维持外周交感、感觉神经元和中枢胆碱能神经元的存活和发育 ,促进神经系统损伤后修复 ,同时还参与调节免疫和造血等非神经系统的功能[2 ] 。NGF在治疗神经损伤、早老性痴呆和外周神经病等方面具有广阔的临床应用前景[3] 。基因工程方法是获得人神经生长因子 (hNGF)的重要手段之一 ,大肠杆菌表达的hNGF ,其体外折叠困难 ,复性后的蛋白生物比活性低。而在哺乳动物细胞中可产生具有较高生物学活性的类似天然蛋白的人神经生长因子。国内尚未有h…