tTG小干扰RNA对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的抑制作用

目的探讨RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase,tTG)的表达对人转化生长因子β2(transforming growth factor-beta2,TGF-β2)诱导的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)转分化和细胞外基质沉积的抑制作用。方法设计并合成针对tTG的3对小干扰RNA(siRNA):tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-3,用Real-time PCR和Western blot检测转染了siR-NA后HLE-B3细胞表达tTG mRNA和tTG蛋白的变化。然后将体外培养的HLE-B3细胞分为正常对照组、TGF-β2组和TGF-β2+siRNA组。48h后,用Western blot检测各组tTG、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronec-tin,FN)和Ⅳ型胶原(collagenⅣ,Col-Ⅳ)的表达。结果转染tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-348h后,tTG mRNA的表达分别下降为空白对照组的46.60%、12.84%、66.75%(均为P<0.05);tTG蛋白的表达量分别下降为空白对照组的60.49%、27.87%、55.91%(均为P<0.01)。Real-time PCR与Western blot检测结果一致显示了tTG-siRNA-2对tTG基因的抑制效果最佳。与正常对照组相比,TGF-β2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显增加(均为P<0.01);与TGF-β2组相比,TGF-β2+tTG-siRNA-2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显减少(均为P<0.01)。结论靶向tTG的siRNA可以显著降低tTG的表达水平,同时可以明显抑制TGF-β2诱导的HLE-B3细胞合成α-SMA、FN、Col-Ⅳ。提示tTG是介导TGF-β2诱导人LEC转分化和细胞外基质沉积的重要分子。     

LY294002对人晶状体上皮细胞蛋白激酶B活化的影响

背景蛋白激酶B（Akt）与许多细胞信号转导通路密切相关，从而参与多种细胞功能活动的调控，包括细胞的增生、迁移和代谢等，其中磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）可催化Akt活性并启动各种相关的细胞信号通路。P13K抑制剂能够抑制Akt活性，但是否影响后发性白内障发生过程中残留的晶状体上皮细胞（LECs）的生物学行为尚不清楚。目的观察P13K抑制剂LY294002对人LECs中Akt活化的影响。方法对人LECs系HLEC-B3细胞进行常规培养和传代，然后接种于96孔板中，培养24h后在培养板中加入LY294002，终浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80μmol／L，继续培养24h后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组细胞的增生抑制率。在同一批接种于6孔板内无菌盖玻片上的传代细胞中加入10μg／L转化生长因子-β2（TGF—β2）为诱导组，用20μmol／LLY294002预培养1h后再加入10Ixg／LTGF—β2进行共培养为TGF—B，与LY294005共培养组，以未加入TGF，p：和LY294002的细胞作为对照组，应用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞中磷酸化Akt（p-Akt）的荧光表达情况，并用Westernblot法检测各组细胞中p-Akt表达量的差异。结果CCK-8法检测结果显示，随着LY294002浓度的增加，HLEC—B3的吸光度（A）值逐渐减小，即LY294002对HLEC—B3细胞增生的抑制作用随浓度的增加而逐渐增强，不同浓度LY294002组间HLEC—B3的A值比较差异有统计学意义（F分组=9．72，P=0．00）；随着检测时间点的延长，HLEC—B3的4值逐渐增大，不同检测时间点A值比较差异有统计学意义（F时间=1737．54，P=0．00）。激光扫描共焦显微镜观察显示，对照组细胞仅有微量的p-Akt红色荧光，诱导组p-Akt表达明显增多，并向细胞膜聚集，细胞轮廓清晰，而TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt表达的红色荧光明显减弱，细胞形态不清。Westernblot法检测结果显示，对照组、诱导组和TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt的表达量分别为0．91±0．08、1．48±0．13和0．95±0．19，3个组间差异有统计学意义（F=15．04，P=0．00）。结论LY294002能够拈抗TGF—β2诱导的Akt磷酸化激活过程，有望成为新的有效防治后发性白内障的药物。     

地塞米松对人晶状体上皮细胞核转录因子κB及其抑制蛋白α的表达和细胞凋亡的影响

背景长期全身或眼局部应用糖皮质激素可诱导皮质类固醇性白内障,但其作用机制尚不明确。目的研究地塞米松作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后对LECs中核转录因子κB（NF—κB）／NF—κB抑制蛋白κ（IκBκ）表达的影响及LECs凋亡的发生情况,了解皮质类固醇性白内障的发病机制。方法取人LECs系（HLE283）在含质量分数20％胎牛血清的DMEM中进行培养和传代。将不同浓度的地塞米松（0．01、0．1、1、10、100μmol／L）分别加入DMSO无血清DMEM培养液中作为不同浓度地塞米松组,不含地塞米松的DMSO无血清DMEM培养液培养的LECs作为空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot、流式细胞术等方法,分别在基因水平、蛋白水平检测LECs中NF—κB／IκB α浓度的改变及LECs凋亡率的变化。结果扩增的基因片段与所设计片段大小一致。地塞米松作用后NF—α核蛋白在LECs中的表达量随着地塞米松浓度的增加而下降,差异有统计学意义（F=36．077,P=0．004）;IκBα蛋白的表达随着地塞米松浓度的增加而上升,差异有统计学意义（F=35．741,P=0．002）。在同浓度地塞米松组,NF—κB核蛋白在LECs中的表达量随作用时间的不同差异有统计学意义（F=16．606,P=0．01）,与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48h时的NF—κB核蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义（P=0．002;P=0．01）。与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48hIκBα蛋白在LECs中的表达量明显增加,差异均有统计学意义（P=0．014;P=0．002）。流式细胞仪检测显示LECs的凋亡率随着地塞米松浓度的增加明显上升,与空白对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论地塞米松通过上调IκBα的表达而过度抑制了NF—κB的活性,并导致LECs凋亡,其作用呈浓度依赖性,这可能是皮质类固醇性白内障发生发展的细胞学和分子生物学机制之一。     

TGF-β2作用于人晶状体上皮细胞后Smad 4与p-Smad2／3的动态表达

目的观察转化生长因子β2（TGF-β2）作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后2类通路转导蛋白Smad4和p-Smad2／3的动态表达变化。方法体外培养的人LECs中添加10ng／mL人TGF—β2,RT-PCR方法测定不同时间点Smadg mRNA的表达,Western blot观察p-Smad2／3的表达,免疫组织化学法观察p-Smad2／3在LECs表达的特点。结果人LECs添加了外源性人TGF-β2,后1h,可出现Smad 4 mRNA表达增高,16h时达峰值（0．72±0．07）,并持续至24h。与对照组比较差异无统计学意义（P〈0．05）。p-Smad2／3在2h后逐渐增强,与对照组比较差异明显,16h达到峰值（2．53g／L）。16h有p-Smad2／3颗粒胞浆表达,24b向核内聚集。结论TGF-β2刺激LECs后,可激活膜受体激活型Smad和通用型Smad,TGF-β2对Smad通路蛋白的激活存在时效关系。TGF—β2可通过特异性激活Smad通路,将信号转导至细胞核内。     

老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体上皮细胞转化生长因子β表达及其与晚期糖基化终末产物的相关性

目的研究转化生长因子p（transforminggrowthfactor—β,TGF—β）在老年性白内障合并2型糖尿病患者中的表达变化及其可能的作用机制,为进一步阐明老年性白内障合并2型糖尿病患者发病的分子机制提供实验数据。方法分别采用点杂交和实时荧光聚合酶链反应方法定量检测和分析老年性白内障患者及老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体前囊膜上皮细胞中TGF-β蛋白、mRNA表达水平。免疫荧光方法观察晚期糖基化终末产物（advanced glycation endoproducts,AGEs）对体外培养人晶状体上皮细胞TGF-β表达的影响。结果与老年性白内障患者相比,老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体前囊膜上皮细胞中TGF-β（TGF-β／2／3）蛋白表达增加（P〈0．05）,mRNA表达变化分别为TGF—β1升高（P〈0．05）,TGF—β2降低（P〈0．01）,TGF-β3未见显著改变（P〉0．05）。AGEs与晶状体上皮细胞共培养后,细胞表面TGF—β（TGF-β1／2／3）表达上调。结论TGF—β在老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体上皮细胞中的表达上调。AEGs可诱导晶状体上皮细胞TGF—β表达上调。（中国眼耳鼻喉科杂志,2010,10：212514）     

tTG和FN在人晶状体上皮中的表达

目的研究人晶状体前囊膜（LC）中组织型谷氨酰胺转移酶（tTG）和纤维连接蛋白（FN）的表达及相互关系。方法在自内障摘除术中获得晶状体前囊膜,立即进行免疫组化染色,光镜下观察标本表达情况并结合图像分析测定染色强度。结果tTG各组标本中皮质性组与核性组、外伤性组之间统计学差异明显（P〈0．05）;FN各组标本中,皮质性组与核性组、外伤组、正常组之间统计学差异明显（P〈0．05）,其他各组间无明显统计学差异。回归分析显示人晶状体上皮中FN的表达有39．1％可由晶状体上皮细胞中tTG的不同来解释。结论tTG在皮质性白内障人晶状体上皮细胞中表达升高可某种程度促进与之关联的FN的合成。     

丝裂素蛋白激活激酶信号途径介导水杨酸钠诱导的人晶状体上皮细胞中HSP27表达

背景热休克蛋白（HSPs）是生物体在各种应激情况下产生的高度保守蛋白,HSP27与人晶状体中α-晶状体蛋白在氨基酸和基因水平上高度同源,其结构和表达的异常与白内障的形成密切相关。此研究先前的研究证实水杨酸钠对H2O2造成的人品状体上皮细胞（LECs）损伤具有保护作用。目的探讨水杨酸钠诱导的人LECs中HSP27的表达及与丝裂素蛋白激活激酶（MAPK）信号途径的关系。方法人LECs—B3系在含质量分数15％胎牛血清的DMEM中进行培养,将不同浓度的水杨酸钠（0～55mmol／L）加入培养基中刺激人LECs不同时间,然后去除刺激再分别培养。在阻断实验中,分别给予P38MAPK、ERK1／2及JNK／SAPK信号通路特异性阻断剂SB20350（10μmol／L）、PD98059（20μmol／L）及SP600125（10μmol／L）预孵育细胞1h,在给予水杨酸钠刺激后检测相关指标,采用Westernblot法检测各种处理情况下人LECs中HSP27的表达,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测HSP27mRNA的表达;免疫组织化学法检测HSP27蛋白在人LECs中的表达。结果正常人LECs仅有微弱的HSP27表达,35～55mmol／L水杨酸钠刺激人LECs1h去除刺激再培养6h后可使HSP27表达显著增加,与正常对照组比较差异有统计学意义（F=509．953,P〈0．01）;55mmol／L水杨酸钠刺激人LECsI～5h不能诱导HSP27的表达（F=2．119,P〉0．05）,而去除刺激再分别培养6h后可诱导HSP27表达,差异有统计学意义（F：452．534,P〈0．01）;55mmol／L水杨酸钠刺激人LECs1h后去除刺激再培养3h后HSP27表达明显增加,6h达到高峰,直至24h恢复到基础水平,差异有统计学意义（F=419．234,P〈0．01）。水杨酸钠刺激30min时磷酸化p38MAPK表达增加,1h表达显著,各组总体差异有统计学意义（F=865．680,P〈0．01）;磷酸化ERK1／2在水杨酸钠刺激时间内未见升高;去除水杨酸钠刺激再培养1h后开始增加,6h达到高峰,各时间点总体差异有统计学意义（F=388．840,P〈0．01）;水杨酸钠刺激1h及去除刺激再培养过程中未见到磷酸化JNK的表达;加入P38MAPK、ERK1／2特异性阻断剂预处理人LECs1h后可使水杨酸钠诱导的HSP27表达受到显著抑制,加入JNK特异性阻断剂未见对水杨酸钠诱导的HSP27表达产生影响。结论水杨酸钠可诱导人LECs中HSP27的表达,P38MAPK和ERK1／2信号途径促进水杨酸钠诱导的HSP27在人LECs中的表达。     

血清中转化生长因子2β1 和bFGF水平与糖尿病视网膜病变关系的临床研究

目的探讨糖尿病视网膜病变（DR）患者血清中转化生长因子2Kβ1（TGF2β1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）水平与糖尿病视网膜病变的关系。方法收集患有糖尿病视网膜病变自内障患者的血清样本,并以无糖尿病白内障患者的血清样本作为对照,用ELISA方法测定血清中bFGF,TCF2β1的含量。结果对照组19例血清样本bFGF含量为（31．25±7．62）ng／L,TGF2β1含量为（0．32±0.04）μg／L;单纯型DR组中17例bF-GF含量为（48．3±6．54）ng／L,TGF2βl含量为（0．41±0．05）μg／L;增生型DR组14例bFGF含量为（61．82±10．91）μg／L,TCF2β1含量为（0．77±0．06）μg／L。和对照组相比糖尿病患者血清中bFGF,TGF2β1的含量均显著增加（P〈0．01）,并且随着DR病情的进展而增高（P〈0．05）;血清中TCF2β1与bFCF之间呈正相关（r=0．379,P〈0．01）。结论TGF2β1,bFGF参与了DR的发生发展,并与DR后期新生血管形成关系密切。     

TGF—β2干预的缺氧状态下补肾活血剂对Muller细胞及谷氨酰胺合成酶活性的影响

目的观察在缺氧和（或）转化生长因子-β2（TGF—β2）干预条件对体外培养的Muller细胞活力以及谷氨酰胺合成酶（GS）的影响。方法用出生7d的SD大鼠体外培养视网膜Muller细胞，将第2代细胞在含20％胎牛血清的DMEM中培养24h后，换用无血清的DMEM孵育24h。分组为：空白血清对照组（20％正常SD大鼠血清的DMEM）；TGF—β2组（20％正常SD大鼠血清的DMEM及终质量浓度为150ng／L的TGF—β2）；模拟缺氧组（20％正常SD大鼠血清的DMEM及终浓度1．0mmol／L的连二亚硫酸钠）；TGF—β2＋缺氧组（20％正常SD大鼠血清的DMEM液、终浓度1．0mmol／L的连二亚硫酸钠和终质量浓度为150ng／L的TGF—β2）；中药血清组（20％中药SD大鼠血清的DMEM）；中药血清＋TGF—β2＋缺氧组（20％中药SD大鼠血清的DMEM、终浓度1．0mmol／L的连二亚硫酸钠和终质量浓度为150ng／L的TGF—β2）。以透射电镜观察视网膜Muller细胞超微结构、以490型酶标仪测定细胞外液乳酸脱氢酶（LDH）释放量及GS活性。结果在缺氧条件下Muller细胞的超微结构发生明显的改变，如：细胞核变形，固缩；细胞器破坏；微绒毛内糖原明显增多。与正常对照组比较，TGF-β2干预组、缺氧组、TGF-β2＋缺氧组的LDH释放量均明显增加（P〈0．05），缺氧组、TGF—β2＋缺氧组的GS活性均明显下降（P〈0．01）；与缺氧组比较，TGF-β2＋缺氧组的LDH释放量明显增加、GS活性明显下降（P〈0．05、P〈0．01）。补肾活血中药血清能降低24h及48h时正常以及TGF—β2与缺氧同时存在条件下LDH的释放量（P〈0．05），增强12h时正常条件下以及12h和24h时TGF-β2与缺氧同时存在条件下GS的活性（P〈0．05、P〈0．01）。结论TGF—β2可加重缺氧条件下Muller细胞活力与GS活性的降低；补肾活血中药含药血清能增强视网膜Muller细胞活力及GS活性。     

汉防己甲素抑制兔Epi—LASIK术后haze形成的作用机制

目的探讨汉防己甲素（Tet）对兔微型角膜刀准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术（Epi—LASIK）术后角膜上皮下雾状混浊（haze）形成的作用。方法健康新西兰大耳白兔27只,双眼行-10．00DEpi—LASIK手术,随机分为阴性对照（NC）组、Tet组、艾氟龙（FML）组,每组18只眼。于术后0．5、1、2个月在裂隙灯下进行haze分级评估。各时间点随机选取各组动物6只眼,利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫组织化学法检测转化生长因子口。（TGF—β2）的表达。结果Tet组和FML组haze分级水平在术后0．5个月、1个月均明显低于NC组（P〈0．01）,术后2个月3组间总体比较差异无统计学意义（P〉0．05）。RT—PCR检测显示,术后各时间点Tet组和FML组TGF—β2 mRNA的表达水平均明显低于NC组（P〈0．01）。免疫组织化学检测显示,术后各时间点Tet组和FML组TGF—β2的表达水平均明显低于NC组（P〈0．01）;TGF—β2的表达水平呈先上升后下降的特点,在术后1个月达高峰。结论Tet能有效抑制兔Epi—LASIK术后haze的形成,可能是通过下调角膜TGF-β2的表达而发挥作用的。     

TGF—β1基因在高危角膜移植术后对移植排斥反应的作用

目的研究高危角膜移植术后,重组腺相关病毒（rAAV）携载的TGF—β1基因（rAAV—TGF—β1）在角膜中的表达及对免疫排斥反应的影响。方法用碱烧伤的方法建立受体角膜新生血管（CNV）化模型。20只Wistar大鼠角膜为供体,40只SD大鼠为受体进行大鼠穿透角膜移植。治疗组术前将20只供体植片置于含rAAV—TGF-β1的DMEM／F12混合培养液中常温培养30min,对照组术前将20只供体植片置于DMEM／F12培养液中常温培养30min,术后裂隙灯下观察植片排斥反应及存活情况。免疫组织化学染色观察2组术后1、2、4周TGF—β1在角膜中的表达。Western blot检测2组术后1、2、4、8周TGF—β1的表达量。结果治疗组角膜平均存活时间为（17．60±2．31）d,对照组为（9．27±1．50）d,治疗组角膜植片混浊及血管化程度明显低于对照组（P〈0．01）。免疫组织化学染色显示治疗组术后1周TGF-v在角膜上皮呈弱阳性表达,术后2～4周角膜上皮及内皮细胞层呈阳性表达并高于对照组。对照组术后1～4周TGF—β1在角膜上皮及基底膜呈弱阳性表达。Western blot检测显示术后1周2组角膜TGF—β1含量差异无统计学意义（P〉0．05）,术后2、4、8周治疗组角膜TGF—β1的表达较对照组增高（P〉0．05）。结论rAAV-TGF—β1能减轻高危角膜移植的排斥反应。     

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响

背景重组水蛭素Ⅲ（rHV3）对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞（LECs）有较好的保护作用,但其分子机制尚不清楚。目的探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响。方法用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌,参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定。将培养的人LECs分为3组,培养于含质量分数10％胎牛血清（FBS）的D／F12培养液作为正常组、用含125×10^-3mol／LD一半乳糖的D／F12培养液建立人LECs株SRAOI／04损伤模型为模型组,用2000U／ml（商品单位）rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达,包括醛糖还原酶（AR）、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平,各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度（A）值与3一磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）A值的比值表达。结果与正常组比较,模型组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=3．90E一06、t=8．44E一04、t=5．15E一08,P〈0．叭）,而水蛭素干预组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显低于模型组,差异均有统计学意义（t=5．90E一06、t=1．51E．04、t=3．42E一06,P〈0．01）。与正常组比较,模型组人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值明显降低,差异有统计学意义（t=1．86E一05,P〈O．01）,与模型组相比,水蛭素干预后人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值显著提高,差异有统计学意义（t=8．56E一05,P〈0．01）。结论D一半乳糖导致人LECs损伤,rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用。     

ILK siRNA对高浓度葡萄糖诱导的人LECs增生和上皮向间质转化的抑制作用

目的探讨整合素连接激酶（ILK）对高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和转化的作用。方法将体外培养的人LECs系SRA01/04细胞分别培养在含葡萄糖5.5mmol/L（正常对照组）和30.5mmol/L（高糖组）的培养液中,用RT-PCR检测培养0、6、24h后ILK mRNA的表达;用ILK siRNA脂质体转染细胞,转染6h后,加入2组培养液处理24h,检测ILK、细胞增生核抗原（PCNA）、LECs转化指标α-SMA和FN在mRNA水平的表达。结果高糖组培养6h和24h,SRA01/04细胞ILK mRNA是正常对照组的2.48倍和2.32倍（P〈0.01）,刺激后24h,SRA01/04细胞PCNA、α-SMA、FN的mRNA表达分别是正常对照组的1.75、1.96和1.75倍（P〈0.01）。ILK siRNA干扰后,正常对照组ILK的表达是非转染细胞的30%,高糖组转染细胞ILK mRNA水平（P〈0.01）是非转染细胞的21%（P〈0.01）,转染细胞PCNA、α-SMA和FN的表达分别是非转染细胞的29%、33%和39%（P〈0.01）。结论高浓度葡萄糖可诱导LECs增生、上皮向间质转化及ILK表达上调,抑制ILK的高表达能阻止这些过程。     

小鼠角膜基质细胞分泌的转化生长因子β2及前列腺素E2对树突状细胞成熟过程的抑制作用

背景研究表明,位于角膜中央区的树突状细胞（DCs）完全处于未成熟状态,而位于角膜周边区的DCs则大多处于成熟状态。角膜内的DCs广泛参与多种角膜相关疾病以及角膜移植免疫排斥反应,研究角膜内DEs的成熟状态具有重要意义。目的探讨小鼠角膜基质细胞（CSCs）是否通过分泌转化生长因子β2（TGF—β2）以及前列腺素E：（PGE2）抑制DCs的成熟。方法获取DCs、T细胞以及CSCs培养上清液。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）测定CSCs培养上清液以及新鲜RPMI1640培养基内PGE2和TGF—β2的质量浓度。在DCs成熟过程中,应用TGF—β2中和抗体以及PGE：受体阻滞剂AH6809,并按照处理方式的不同分为对照组、CSCs培养上清液组、AH6809组、TGF—β2中和抗体组、AH6809＋TGF—β2中和抗体组。采用流式细胞技术检测DCs细胞表型CDllc、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达情况,通过葡聚糖内吞实验检测抗原吞噬功能,并通过混合淋巴细胞反应检测刺激T细胞增生的能力。结果ELISA检测结果显示,与新鲜RPMI1640培养基相比,CSCs培养上清液内含有较高质量浓度的TGF—β2和PGE2。与CSCs培养上清液组比较,TGF—β2中和抗体组DCsCD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达均升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）,葡聚糖的表达降低（P〈0．05）,刺激指数（SI）增大（P〈0．05）;AH6809组CD86和MHC-Ⅱ的表达均升高,葡聚糖的表达降低,SI增大,差异均有统计学意义（P〈0．05）;TGF—β2中和抗体＋AH6809组DCsMHC-Ⅱ的表达和SI提高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。与对照组比较,TGF—β2中和抗体＋AH6809组DCsCD80、CD86的表达和SI均较低,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论体外培养的小鼠CSCs可以通过分泌TGF—β2及PGE2抑制DCs成熟,且这两种细胞因子可发挥叠加效应。     

tTG AS-ODN抑制培养的牛眼小梁细胞表达纤维连接蛋白的研究

目的观察组织型谷氨酰胺转移酶(tTG)AS-ODN(AS-ODN)对体外培养牛眼小梁细胞(BTMCs)纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法设空白对照组、tTGAS-ODN1组和tTGAS-ODN2组。在脂质体介导下,将0.3μmol/L的tTGAS-ODN转染BTMCs,利用免疫组织化学SP染色法检测BTMCs表达FN情况,采用半定量RT-PCR和Westernblot方法检测表达的变化。结果免疫组织化学结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组灰度均值与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.91)。RT-PCR结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组FN/β-actin条带中心密度比与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.73)。Westernblot结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组FN/β-actin灰度比值与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.92)。结论tTG可以促进BTMCs表达ECM。通过tTGAS-ODN抑制BTMCs表达FN等细胞外基质(ECM),有望从基因水平上防治原发性开角型青光眼(POAG)。     

转化生长因子β受体在不同年龄大鼠晶状体上皮细胞中的表达

目的探讨转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF—β）受体在不同年龄SD大鼠晶状体上皮细胞中的表达变化及意义。方法按1、3、6个月鼠龄分为3组。采用晶状体前囊膜铺片方式。应用荧光免疫组化技术进行TGF—β受体TGF-βR1和TGF-βR2的荧光免疫组化染色，检测其蛋白水平的表达：采用剥取晶状体囊膜组织方法。应用RT—PCR技术检测TGF—βR1和TGF—βR2在转录水平的表达。结果在蛋白水平，TGF-βR1和TGF—βR2于1个月鼠龄组表达最强．IOD分别为478001±44417和778338±62596；3个月鼠龄组表达减弱。分别为360343±33196和360343±33196：6个月鼠龄组表达最弱。分别为225858±23483和274648±29801，组间差异有显著性（P〈0．05）。在转录水平，TGF—βR1和TGF-βR2mRNA表达量在1个月龄组分别为3．0±0．9和3．4±1．1；3个月龄组分别为2．1±0．6和2．6±0．8；6个月龄组分别为1．3±0．3和1．6±0．5．随着年龄的增加而减弱（P〈0．05）。结论大鼠晶状体上皮细胞中TGF—βR1和TGF-βR2的表达随年龄的增长而减弱，提示对TGF—β的敏感性与年龄呈负相关。     

慢病毒介导的TGFβ-R2shRNA抑制人LECs细胞TGFβ—R2的表达

目的：观察转化生长因子β-R2特异性短发夹 RNA （ shRNA ）对人晶状体上皮细胞TGFβ-R2表达的影响。 方法：根据小干扰RNA （ siRNA ）的设计原则,针对转化生长因子β-受体2基因序列特征构建特异性 shRNA （ RNAi ）载体,与TGFβ-R2过表达载体共转染293 T细胞,经Western blot筛选出有效RNAi载体后,进行扩增、纯化、滴度测定,并转染培养的人LECs , qPCR 检测TGFβ-R2 siRNA慢病毒载体对TGFβ-R2 mRNA表达的影响。 结果：经Western blot 筛选,TGFβ-R2/GV115RNAi＃1对目的基因的表达敲减效果最明显,慢病毒包装,滴度为8E＋8 TU/mL,感染人LECs细胞后,对TGFβ-R2基因有显著的敲减效果,达到78．1％（P＜0．05）。 结论：TGFβ-R2 RNAi载体构建成功,并且能抑制人晶状体上皮细胞TGFβ-R2 mRNA的表达。     

组织型谷氨酰胺转移酶反义寡核苷酸对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白、层粘连蛋白及Ⅳ胶原表达的影响

目的观察组织型谷氨酰胺转移酶(tissuetransglutaminase,tTG)反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASODN)对牛眼小梁细胞(bovinetrabecularmeshworkcells,BTMC)纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅳ胶原(collagen-Ⅳ,CA-Ⅳ)表达的影响。方法在脂质体介导下,将0.3μmol·L-1的tTG-ASODN转染BTMC,无血清DMEM培养基为空白对照组。24h后,制作细胞爬片,利用免疫组化SP染色法检测tTG-ASODN对BTMC表达FN、LN、CA-Ⅳ的影响。结果空白对照组和A-SODN转染组FN、LN和CA-Ⅳ免疫组化染色均为阳性。通过对细胞爬片进行图像统计学分析,与空白对照组相比,ASODN1和ASODN2组中FN、LN、CA-Ⅳ的表达均明显下降(P<0.01),而ASODN1和ASODN22组之间没有显著性差异(P>0.05)。结论进一步证明了tTG可以促进BTMC表达细胞外基质。通过tTG-ASODN抑制BTMC表达FN、LN、CA-Ⅳ,从而有望从基因水平上防治原发性开角型青光眼。     

c—myc反义寡核苷酸抑制半乳糖性白内障晶状体上皮细胞凋亡的机制

目的研究c-myc反义寡核苷酸（ASODN）对半乳糖性白内障晶状体上皮细胞（LECs）凋亡的影响。方法将Wistar大鼠按随机数字表法分为生理盐水组、半乳糖组和半乳糖＋c-myc ASODN组,每组36只。半乳糖组及半乳糖＋c—mycASODN组每日球后注射O．2mL20％半乳糖,制作大鼠半乳糖性白内障模型,半乳糖＋c—mycASODN组球后注射半乳糖4h后加注Lipo—mycASODN复合液0．2mL,隔日1次。分别于给药后7、14、24d处死动物,取出晶状体,检测LECs的凋亡情况,采用TUNEL法检测c—mycASODN对半乳糖诱导LECs凋亡的影响,透射电镜下观察LECs超微结构的改变。结果各组在7、14、24d的LECs凋亡率比较,差异均有统计学意义（F7 days=3418．495,P〈0．01;F14 days=1137．555,P〈0．01;F14 days=2198．871,P〈0．01）;24d时半乳糖组LECs的凋亡率为56．57±3．20,生理盐水组为0．37±0．11,差异有统计学意义（P〈0．01）;半乳糖＋c．mycASODN组细胞凋亡率为29．35±1．63,较半乳糖组明显降低（P〈0．05）。透射电镜下观察发现,半乳糖组可见LECs呈凋亡细胞的早期改变;随着高糖诱导时间的延长,凋亡细胞逐渐增多;生理盐水组几乎未见到凋亡细胞;半乳糖＋c—mycASODN组凋亡细胞数量较同期半乳糖组少。结论在白内障形成过程中半乳糖能诱导LECs凋亡,c．mycASODN能够抑制半乳糖诱导的LECs凋亡。     

密蒙花提取物治疗兔去势所致干眼症

目的观察密蒙花提取物对去势所致的干眼症雄免基础泪液分泌量，泪腺局部炎症因子转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor—α，TNF—α）的影响，探讨密蒙花提取物抗雄激素水平下降所致的干眼症的作用机制。方法将30只日本大耳雄兔随机分为空白组（A）、模型组（B）、1倍剂量密蒙花提取物治疗组（C）、2倍剂量密蒙花提取物治疗组（D）和染料木黄酮治疗组（E），每组6只，对B、C、D、E组行雄激素去势术建立动物模型，对C、D、E组分别以密蒙花提取物1倍剂量和2倍剂量以及染料木黄酮连续灌胃1个月，对全部实验兔行Schirmer I试验．采用免疫组织化学方法，对兔泪腺组织中炎症因子TGF-β1、IL-1β、TNF—α进行检测。结果C、D、E组SchirmerI试验测量值明显高于B组（P〈0．01），在泪腺导管及腺泡上皮细胞中．IL-1β、TNF—α．阳性表达的细胞数均明显低于B组，而TGF—β1阳性表达的细胞数均明显高于B组（P〈0．01）。以上检测结果C、D组均优于E组（P〈0．05）。结论密蒙花提取物中主要成分为黄酮类物质，可显著抑制雄激素水平降低后兔干眼症的发生。其作用机制可能与黄酮类物质化学结构与雄激素类似，可起到拟雄激素效应，从而调节泪腺局部炎症反应有关。密蒙花提取物可能成为治疗干眼症的新途径。