黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达的影响

目的:观察黄芪甲苷对原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达影响,初步探讨黄芪甲苷防治膝骨关节软骨退变的作用机制。方法:原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞,用第三代细胞进行试验。将5个不同浓度的黄芪甲苷,分别作用于关节软骨细胞4、8、24、48、72h后,采用Real Time-PCR法检测细胞中Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)、蛋白多糖基因(ACAN)的mRNA表达。结果:黄芪甲苷浓度为25~75mmol/L,作用于退变关节软骨细胞24~72h时,软骨细胞Col Ⅱ和ACAN mRNA的表达量均较对照组显著增加。结论:黄芪甲苷可延缓膝骨关节炎关节软骨细胞的退变,促进软骨细胞ColⅡ及ACAN mRNA的表达可能是其作用机制之一。     

黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨IL-1β表达的影响

目的 研究黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨IL-1β表达的影响.方法 取膝骨关节炎患者手术后的退变膝关节软骨,进行细胞培养,将培养的软骨细胞分离传代后,取第三代细胞,通过HE、Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行软骨细胞鉴定,并进行IL-1 β免疫荧光染色.观察软骨细胞退变情况后分为6组(A组:软骨细胞+DMEM对照组;B组:软骨细胞+25 mmol/ L黄芪甲苷;C组:软骨细胞+50 mmol/L黄芪甲苷;D组:软骨细胞+75 mmol/L黄芪甲苷;E组:软骨细胞+100 mmol/L黄芪甲苷;F组:软骨细胞+500 mmol/L黄芪甲苷),取4、8、24、48、72 h采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测各组退变软骨细胞内IL-1βmRNA的表达情况.结果 ①形态观察.原代细胞中梭形细胞和多角形细胞并存,细胞核偏于细胞的一侧而贴近细胞膜,细胞纤丝较长.HE染色细胞质为红色,胞膜呈蓝色;甲苯胺蓝染色细胞质和胞膜均呈深蓝色;Ⅱ型胶原染色阳性为绿色荧光,细胞核采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚复染,在不同波段荧光激发下,胞浆和胞膜可见清晰绿色荧光,细胞核区域未见明显绿色荧光,证明培养细胞表达特征性基因Ⅱ型胶原,主要分布在胞浆和细胞膜上,证明所培养的细胞为软骨细胞.IL-1 β免疫荧光染色可见清晰绿色荧光,软骨细胞以多角形多见.②IL-1 βmRNA表达.不同时间点间软骨细胞IL-1βmRNA表达水平有差异(F=13.236,P＜0.01);不同组间软骨细胞IL-1βmRNA表达水平有差异(F=98.762,P＜0.01),A组高于B组、C组、D组、E组(P＜0.05～0.01),F组高于A组、B组、C组、D组、E组(P＜0.05～0.01);时间因素和组间因素存在交互效应(F=7.262,P＜0.01).结论 一定浓度的黄芪甲苷能通过抑制退变软骨细胞合成IL-1 β,延缓软骨细胞退变;浓度过高则会促进退变软骨细胞合成IL-1 β,加速软骨细胞退变.     

香豆雌酚对膝骨关节炎患者软骨细胞OPG/RANKL及MMP-1、MMP-3表达的影响

目的:研究香豆雌酚(coumestrol)对膝骨关节炎患者软骨细胞OPG/RANKL及MMP-1、MMP-3表达的影响,初步探讨其对骨关节炎的治疗机制。方法:分离、培养因膝骨关节炎行膝关节置换患者的膝关节软骨细胞,运用Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行软骨细胞鉴定。用不同浓度(10-9、10-8、10-7mol·L-1)香豆雌酚干预第3代细胞,并设0浓度为空白对照组,分别于培养后3、7 d用real-time PCR法测定细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)mRNA的表达。结果:干预3 d,10-8mol·L-1组OPG及RANKL mRNA表达均增加,其OPG/RANKL相对表达是空白对照组的2.59倍(P<0.05);干预7 d,10-9和10-8mol·L-1组OPG mRNA表达均增加,10-7mol·L-1组RANKL mRNA表达增加,10-8mol·L-1组OPG/RANKL相对表达是空白对照组的3.85倍(P<0.05)。干预3 d,10-8mol·L-1组MMP-1 mRNA表达减少(P<0.05);干预7 d,10-8mol·L-1组MMP-1和MMP-3 mRNA表达均减少(P<0.05)。结论:香豆雌酚能增加膝骨关节炎患者关节软骨细胞OPG表达及OPG/RANKL值,减少其MMP-1、MMP-3表达,具有一定的软骨保护作用。     

超声波治疗兔膝骨关节炎对MMP-1和MMP-13表达的影响

目的探讨兔膝骨关节炎模型软骨基质金属蛋白酶(MMP)-1、-13超声波治疗前后在软骨组织中的表达及其作用机制。方法 30只新西兰大白兔随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)和超声波治疗组(C组),每组10只。B、C组骨关节炎造模后6周,C组实施超声波治疗,8周后取各组软骨予HE染色,免疫组化行MMP-1和MMP-13分析,观察软骨HE改变、MMP-1和MMP-13表达的变化。结果 HE染色结果采用Mankin′s评分比较,A组与B组、B组与C组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。软骨免疫组化MMP-1、-13测定,A组与B组、B组与C组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论超声波能有效治疗膝OA,其作用机制可能是减少软骨MMP-1、-13的含量,降低Ⅱ型胶原的降解、促进新的Ⅱ型胶原的生成,从而有利于软骨细胞外基质的合成,有利于软骨细胞的修复。     

MMP-1、TIMP-1在兔实验性膝骨关节炎中的表达

目的 观察基质金属蛋白酶1(MMP-1)及其抑制剂(TIMP-1)在兔实验性骨关节炎中的表达,探讨骨关节炎的发病机制是否与MMP-1及TIMP-1的异常表达有关.方法 20只日本大耳白兔随机分为2组:A组正常对照组,B组模型组.B组用1.6%木瓜蛋白酶膝关节腔内注射,建立兔膝骨关节炎模型,4周后观察软骨组织形态学的变化及软骨中MMP-1、TIMP-1的表达.结果 B组软骨病理损害程度重于A组(P<0.01),MMP-1表达明显高于A组(P<0.01),TIMP-1表达高于A组(P<0.05).结论 MMP-1与TIMP-1与骨关节炎软骨退变有关,其异常表达在骨关节炎关节软骨退变的病理过程中发挥关键作用.     

医用臭氧对骨关节炎病理过程中软骨细胞的影响

目的   观察不同浓度医用臭氧(O3)对白介素-1β(IL-1β)损伤关节软骨细胞的影响,探讨临床使用O3的浓度范围。方法   在无菌环境下消化得到7月龄新西兰白兔膝关节软骨细胞,培养并传代,用传代软骨细胞作为实验用细胞。随机分为8组：正常软骨细胞组(N组),模型细胞组即软骨细胞加IL-1β(M组),对照组即软骨细胞加不同浓度O3(20、40、60μg/mL)组,实验组即IL-1β(10ng/mL)干预的软骨细胞加不同浓度O3(20、40、60μg/mL)组,共同孵育24h后观察细胞形态。酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 测定软骨细胞培养液上清液中丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的含量。结果   20、40μg/mL浓度医用臭氧干预软骨细胞后,对照组和实验组细胞的形态与正常软骨细胞相似,有少量核固缩,MDA、TNF-α、MMP-3的含量比模型细胞组降低(P＜0.05);60μg/mL医用臭氧干预软骨细胞后,细胞损伤严重,呈凋亡形态,且MDA、TNF-α、MMP 3的含量比模型细胞组增高(P＜0.05)。结论   20、40μg/mL浓度医用臭氧通过降低细胞培养液中炎症因子的浓度对骨关节炎软骨细胞有保护作用,60μg/mL医用臭氧对正常软骨细胞和骨关节炎病理过程中的软骨细胞均有损伤作用。     

黄芪甲苷对小鼠实验性心室重构及基质金属蛋白酶表达的影响

目的： 研究黄芪甲苷对小鼠实验性心室重构的保护作用并从基质金属蛋白酶方面探讨其作用机制。 方法： 采用连续皮下注射异丙肾上腺素14 d诱导小鼠心室重构模型,同时以黄芪甲苷(40,80 mg/kg)和阳性对照普萘洛尔(40 mg/kg)灌胃给药;超声心动图检测左室舒张末期直径(LVIDd)、左室收缩末期直径(LVIDs)、左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS);HE染色光镜下观察心肌组织的病理学改变;RT-PCR法检测基质金属蛋白酶MMP2、MMP9及其抑制剂TIMP1、TIMP2的mRNA表达,明胶酶谱法分析MMP2、MMP9的活性。 结果： 与正常对照组相比,模型组LVIDd、LVIDs均显著升高,EF、FS均明显降低,心肌有纤维化样损伤,表明发生了左室重构;另外,模型组MMP2、MMP9 mRNA表达和酶活性均显著增高,而TIMP1、TIMP2 mRNA表达在各组均无明显变化。与模型组相比,黄芪甲苷可显著降低LVIDd、LVIDs,增加EF、FS,减轻心肌损伤,下调MMP2、MMP9 mRNA表达和酶活性。 结论： 黄芪甲苷可通过抑制MMP2、MMP9表达及活性,有效逆转心室重构,改善心功能。     

黄芪多糖通过JAK2/STAT3通路调控人膝骨关节炎软骨细胞增殖与凋亡

目的 研究黄芪多糖(APS)对人膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及JAK2/STAT3通路的影响.方法 无菌分离人膝骨关节炎软骨细胞,设空白对照组,APS低、中、高剂量(25、50、100mg/L)组和塞来昔布(20mg/L)组.药物干预48h后,MTT法检测细胞增殖活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋...     

TRPV4通道在膝骨关节炎软骨细胞中的功能表达*

目的 基于瞬时感受器电位离子通道家族（TRP）香草素受体亚家族成员Ⅳ型（TRPV4）的特点,探讨其在人类软骨细胞中的功能性表达,以及对于膝骨关节炎（KOA）的意义。方法 人类KOA软骨细胞原代培养。分别用浓度为0、1、10和100?ng/ml,以及浓度为1和10?μg/ml的脂多糖（LPS）全培孵育24?h,或用浓度为1?μg/ml的LPS全培分别孵育0、4、8、12、24和48?h,qRT-PCR检测软骨细胞TRPV4的基因表达。软骨细胞分为空白组、LPS组、LPS+TRPV4抑制剂组,行实时荧光钙成像观察各组钙离子内流情况,并提取培养上清液,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3及MMP-13水平。结果 浓度为1、10、100?ng/ml和1?μg/ml的LPS均能增加人类软骨细胞TRPV4通道的基因表达（P?<0.05）;实时荧光钙成像分别观察20、40和60?s的荧光强度发现：LPS组荧光强度较空白组增加（P?<0.05）,LPS+TRPV4抑制剂组荧光强度较LPS组降低（P?<0.05）;此外,LPS组的MMP-1、MMP-3及MMP-13水平高于空白组（P?<0.05）,而LPS+TRPV4抑制剂组低于LPS组（P?<0.05）。结论 在KOA的炎症环境下,TRPV4不仅存在表达量升高,还存在功能表达增强。TRPV4通道可能通过影响MMP-1、MMP-3及MMP-13的表达水平参与KOA软骨降解的过程。     

黄芪甲苷对苯并芘诱导RAW264.7细胞MMPs表达的保护作用

目的 观察黄芪甲苷（astragaloside IV,ASIV）对苯并芘（benzopyrene,Bap）诱导RAW264.7巨噬细胞MMPs表达的保护作用,探讨腹主动脉瘤防治的可能新策略。方法 应用Western blot法观察Bap对RAW264.7巨噬细胞基质金属蛋白酶-9/12（MMP-9、MMP-12）、NF-κB、TNF-α等表达的变化及黄芪甲苷的作用,利用流式细胞仪观察黄芪甲苷对巨噬细胞ROS表达的影响。结果 Bap能够诱导RAW264.7巨噬细胞MMP-9、MMP-12等金属蛋白酶的表达升高和NF-κB、TNF-α等炎性指标的活化。黄芪甲苷具有降低RAW264.7巨噬细胞因Bap诱导而表达升高的MMP-9、MMP-12、NF-κB、TNF-α,同时具有清除ROS的作用。结论 黄芪甲苷能够降低Bap刺激RAW264.7巨噬细胞引起的MMP-9、MMP-12、NF-κB、TNF-α的表达升高,并具有清除ROS的作用。     

Expression of miRNA-140 in Chondrocytes and Synovial Fluid of Knee Joints in Patients with Osteoarthritis

Objective To investigate the expression of miRNA-140 in chondrocytes and synovial fluid of osteoarthritis (OA) patients, and explore the relationship between the miRNA-140 expression and OA severity.
Methods This study enrolled 30 OA patients who underwent total knee arthroplasty for chondrocytes sampling and 30 OA patients who underwent intra-articular injection for synovial fluid sampling. All OA patients were grouped intomild [Kellgren and Lawrence (KL) grade 1-2], moderate (KL grade 3) and severe (KL grade 4), with 10 in each subgroups for each sampling purposes. 7 non-OA patients and 10 patients with knee injury were collected for cartilage and synovial fluid sampling respectively as control groups. Chondrocytes were isolated from the cartilage tissue and culturedin vitro. Quantitative real time PCR for miRNA-140 in chondrocytes and synovial fluid were performed, and the U6 snRNA was used as internal control. The expression difference of miRNA-140 among groups and correlation between the expression and the KL grade of OA were analysed using one-way ANOVA and Spearman test respectively.
Results The expression of miRNA-140 in chondrocytes of knees in OA patients was reduced than that in normal knees, and the between-group difference was statistically significant (F=305.464,P<0.001). miRNA-140 could be detected in synovial fluid of both normal knees and OA knees, its relative expression level was reduced in synovial fluid of OA group compared with normal group, and the between-group difference was statistically significant as well (F=314.245,P<0.001). The relative expression level of miRNA-140 in both chondrocytes and synovial fluid were negatively correlated with the KL grade of OA(r=-0.969,P<0.001;r=-0.970,P<0.001).
Conclusion miRNA-140 could be detected in chondrocytes and synovial fluid of OA patients, and its expression was negatively correlated with the severity of OA.     

阳和汤对膝骨性关节炎患者血清和关节滑液中基质金属蛋白酶-3的影响

目的：观察阳和汤对膝骨性关节炎患者血清和关节滑液中基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3,MMP-3）的影响。方法：60例膝骨性关节炎患者予阳和汤治疗8周,治疗前、后分别测定患者血清和关节滑液中MMP-3的水平。结果：经阳和汤治疗后,膝骨性关节炎患者血清和关节滑液中MMP-3水平与治疗前比较显著下降（P〈0.01）。结论：阳和汤可通过调节MMP-3水平,抑制软骨细胞外基质中胶原的降解而发挥治疗骨性关节炎的作用。     

MMP-1、13 mRNA和DDR2表达与关节软骨退变的关系

目的探讨关节软骨基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）-1、13mRNA及盘状结构域受体（discoidin domain receptor,DDR2）三者与关节软骨退变的关系。方法对58例关节软骨标本应用反转录-多聚酶链反应法（RT-PCR）测定MMP-1、13mRNA的表达,免疫组化法显色DDR2表达,进行图像分析研究。结果在轻度退变关节软骨中MMP-1、13呈低表达,在中重度退变软骨中MMP-1、13表达显著增高,在重度退变软骨中MMP-1,13有相对的下降,DDR2表达也呈现出与MMP-1、13相同的表达特点。结论MMP-1、13的过表达导致软骨Ⅱ型胶原的降解是软骨退变的重要原因,Ⅱ型胶原降解片段诱导DDR2表达增高进一步介导MMP-1、13的表达形成一个放大效应而加速了关节软骨退变。     

HPLC-ELSD法测定肺痨灵合剂中黄芪甲苷的含量

目的:建立HPLC-ELSD法测定肺痨灵合剂中黄芪甲苷含量的方法。方法:采用高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为Agilent XDB C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-水(33:67),流速为1.0 m L/min,进样量为10μL。ELSD参数:漂移管温度为101℃,氮气流速为2.7 L/min。结果:黄芪甲苷线性范围是1.326~9.282μg,r为0.9981,平均加样回收率为98.20%,RSD为0.88%。结论:HPLC-ELSD法灵敏、简便,准确,重现性好,可用于肺痨灵合剂的定量分析与质量控制。     

高效液相色谱—蒸发光散射法测定糖肾（浓缩）丸中黄芪甲苷含量

目的：建立糖肾（浓缩）丸中黄芪甲苷含量测定的方法。方法：采用HPLC-ELSD法,十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈—水（33∶67）为流动相;柱温：25℃;流速：1.0mL/min;检测器为蒸发光散射检测器;蒸发光散射检测器参数：漂移管温度：50℃,气体流速：3.0L/min;检测温度：40℃。结果：黄芪甲苷浓度在20.40~224.40μg/mL范围内线性关系良好,其平均回收率99.27%,RSD为0.79%（n=6）。结论：本方法准确、快速、方便。     

槲皮素和黄芪甲苷对多药耐药铜绿假单胞菌抗菌活性的研究

目的：测定槲皮素和黄芪甲苷对多药耐药铜绿假单胞菌是否具有抑菌活性。方法微量稀释法药敏试验TTC染色用于定量检测中药单体对多药耐药铜绿假单胞菌的体外最低抑菌浓度MIC。结果槲皮素MIC为63．5μM,黄芪甲苷对铜绿假单胞菌无明显抑制作用。结论槲皮素对于耐药铜绿假单胞菌具有良好的抑菌活性,且呈浓度依赖性。对于槲皮素的进一步开发利用,在临床治疗和新药研制方面都具有深远意义。     

肺癌患者肺组织MMP-2、MMP-7和TIMP-2表达及意义

目的探讨肺癌组织中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7,MMP-7)和组织金属蛋白酶-2(tissne inhibitor of matalloproteinase-2,TIMP-2)的表达及其意义.方法采用免疫组化(S-P)法检测74例肺癌组织、20例癌旁正常肺组织中MMP-2、MMP-7和TIMP-2的表达及其与肺癌类型及预后的关系.结果癌组织中MMP-2和MMP-7表达均显著高于癌旁正常肺组织(P＜0.01,P＜0.05).MMP-2表达在有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(P＜0.01),MMP-7表达与有无淋巴结转移无明显关系(P＞0.05).肺癌TIMP-2表达在有淋巴结转移者低于无淋巴结转移者(P＜0.05).肺癌MMP-2和TIMP-2的表达呈负相关(P＜0.05).单变量分析显示MMP-2表达阳性者生存率低于MMP-2阴性者(P＜0.01),TIMP-2阳性者生存率高于TIMP-2阴性者(P＜0.01).结论 MMP-2和TIMP-2表达与肺癌侵袭转移密切相关,可作为判断肺癌预后的有用指标,MMP-7表达在肺癌侵袭转移中作用不显著.