核仁素对小鼠糖尿病性心肌病心肌肥大与纤维化发生的影响

目的:阐明核仁素在小鼠糖尿病性心肌病中的作用。方法:前期研究中我们采用了心肌特异性过表达核仁素转基因小鼠制备了Ⅱ型糖尿病性心肌病模型;实验分为野生型对照组、转基因对照组、野生型糖尿病组及转基因糖尿病组。采用麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)荧光染色检测小鼠心肌肥大情况;采用Masson三色染色检测小鼠纤维化情况;采用Power Lab system检测小鼠心肌功能变化。结果:与对照组比较,转基因糖尿病组小鼠的血糖值变化不明显,心肌细胞肥大显著减轻,胶原纤维生成显著减少,血流动力学指标±dp/dtmax、左室舒张末压、左室峰压和心率均有不同程度的改善,且差异具有统计学意义。结论:核仁素可能通过减轻糖尿病性心肌病小鼠心肌细胞肥大及纤维化的发生,从而改善糖尿病性心肌病小鼠的心功能。     

HBD-2转基因小鼠的建立及鉴定

人β防御素2（Human beta defensin 2，HBD-2）是人体抗菌肽的重要分子，体外试验研究证明具有广谱抗微生物活性，为开展其在整体水平上的功能研究，建立HBD-2转基因小鼠模型。用分子克隆方法构建了带CMV启动子的HBD-2全长cDNA真核重组表达质粒pCDNA3．1-HBD2，以此为摸板，PCR扩增出带CMV启动子和BGH polyA尾的HBD-2基因片段，用显微注射技术将此微基因导入小鼠雄原核中，于M16培养液培养后经输卵管移植到受体鼠体内让其怀孕产生子代小鼠。PCR法检测外源基因在小鼠基因组中的整合，RT—PCR和免疫组化法检测HBD-2在小鼠组织的表达。PCR检测结果显示17只F1代转基因鼠中4只检测到阳性信号，RT—PCR和免疫组化检测显示HBD-2在其F1代转基因小鼠生殖道、呼吸道、泌尿道以及血管内皮等组织部位广泛表达。实验表明HBIN2基因已整合到小鼠基因组且广泛表达，为进一步研究HBD-2的生物学功能及基因调控提供了有用的整体动物模型。     

核仁素的表达定位和定量与前列腺癌演变的关系

目的探讨前列腺癌和非癌组织中核仁素表达定量和定位的差异,及核仁素表达的增高和核外迁移对鉴别诊断前列腺癌和非癌组织的价值。方法用免疫组化SP法检测50例前列腺癌组织和50例非癌组织中核仁素的表达,分析前列腺癌组织和非癌组织中核仁素表达定量和定位的差异,并比较核仁素与p504S和p63在前列腺癌中表达的相关性,分析前列腺癌中核仁素表达定量与癌组织Gleason评分的关系。结果前列腺癌和非癌组织中细胞核均表达核仁素;前列腺癌胞质和胞膜核仁素的阳性表达率(90%)明显高于癌旁正常前列腺组织(5%)、前列腺增生症(13%)和前列腺上皮内瘤变(20%)(P<0.01)。Allred半定量分析显示,前列腺癌组织中核仁素表达量(7.7±0.3)高于癌旁正常前列腺组织(3.9±0.2)、前列腺增生症(4.0±0.4)和前列腺上皮内瘤变(5.5±0.2)(P<0.01)。在前列腺癌中,核仁素胞质阳性表达与癌细胞p504S的阳性表达呈正相关,与基底细胞p63的阳性表达呈负相关(P<0.01)。前列腺癌中核仁素表达定量与Gleason评分呈正相关(P<0.01)。结论前列腺在癌变过程中核仁素表达增高,并出现核外迁移;核仁素的核外迁移...     

小鼠转基因的可诱导表达

转基因小鼠是研究基因表达调控及表达产物生物学效应的最佳体系之一。小鼠转基因可诱导表达系统的研究和应用为实现对转基因表达在时间和空间上进行严格调控 ,深入研究单一基因在生物体不同发育阶段、不同生理条件和不同病理状态下不同组织中的功能作用提供了有力的手段 ,并为进一步阐明人类生理机能和疾病的分子机制及基因治疗的研究开辟了新的前景     

双重引物PCR鉴定APPSWE转基因小鼠

本实验旨在探讨一种简单易行,能有效识别APPSWE转基因小鼠基因检测中假阴性结果的方法。在PCR体系中设计两对引物,一对为APP基因特异性引物,另一对为根据其内源性管家基因β-actin设置的参照引物。利用同一个PCR反应体系,对两对引物进行扩增。结果显示,双重引物PCR扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合,利用该法检出的转基因阳性率高于单引物PCR检出的转基因阳性率。本方法简单易行,能够有效识别以往利用单一PCR检测出现的假阴性结果,并且具有很好的特异性和灵敏性,值得在转基因小鼠鉴定实验中推广。     

ACE/ACE2在AGT-REN双转基因高血压小鼠肾组织的表达变化及意义

目的: 观察血管紧张素原(AGT)-肾素(REN)双转基因高血压小鼠肾脏组织病理改变及血管紧张素转化酶(ACE)/血管紧张素转化酶2(ACE2)的表达变化,探讨ACE和ACE2在高血压肾损伤中的作用。方法: 实验分为4组,随机选择10月龄野生型、AGT转基因、REN转基因以及AGT-REN双转基因雄性C57小鼠各6只。每组动物颈动脉插管检测平均动脉压(MAP),1 h后处死小鼠;左侧肾脏置于10%中性甲醛固定,常规HE染色方法观察肾脏组织病理改变,免疫组化法观察肾脏ACE及ACE2的表达变化;右侧肾脏取出后放入蛋白裂解液中,提取蛋白,进行Western blotting实验,观察肾组织中ACE和ACE2蛋白表达。结果: 与野生型小鼠相比,AGT转基因小鼠MAP无明显变化(P>0.05),REN转基因小鼠MAP降低约15 mmHg(P<0.05);AGT-REN双转基因小鼠MAP明显升高约30 mmHg(P<0.05)。与野生型小鼠相比,AGT转基因和REN转基因小鼠肾组织未见明显病理改变,AGT-REN双转基因小鼠肾组织可见肾小动脉内膜及管壁显著增厚、管腔狭窄、纤维素样坏死、玻璃样变等典型恶性高血压肾损伤病理改变。免疫组化结果显示,与野生型小鼠相比,AGT转基因和REN转基因小鼠肾组织ACE和ACE2表达无明显差异(P>0.05),AGT-REN双转基因鼠肾组织ACE表达明显增高(P<0.05),而ACE2表达明显降低(P<0.05)。Western blotting结果显示:与野生型小鼠相比,AGT转基因鼠肾组织ACE和ACE2表达无明显变化;REN转基因鼠肾组织ACE表达无明显变化,ACE2表达稍降低(P<0.05);双转基因鼠肾组织ACE蛋白表达明显增强, ACE2蛋白表达水平显著降低,ACE/ACE2表达显著失衡。结论: AGT-REN双转基因可致小鼠恶性高血压,导致肾脏严重损伤;ACE/ACE2的表达失衡与血压改变密切相关,降低ACE或提高ACE2的表达可能对防治高血压具有重要意义。     

细胞膜表面核仁素的功能

核仁素(又称C23)是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质,具有多种生物学功能,包括调控核糖体的生物合成与成熟、参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制、核仁的发生以及抗细胞凋亡作用。核仁素可作为多功能穿梭蛋白穿梭于细胞浆和细胞核之间,甚至表达在细胞膜上,如肿瘤细胞、免疫细胞以及血管内皮细胞等,这种细胞膜表面核仁素可充当多种蛋白分子、细菌、病毒的受体或共受体,并介导这些配体的生物学效应及病原微生物对宿主细胞的入侵。     

核仁素在肿瘤发生发展中的作用

核仁素是细胞核中一种高度保守的多功能蛋白,又称为C23,其在核仁中高度表达并参与多种生物学过程.近几年来,核仁素在肿瘤发生发展中的作用引起人们的广泛关注.核仁素通过作用多种致瘤基因(如Akt)间接或直接影响细胞周期促进细胞增殖,稳定抗凋亡因子IL-9和bcl-2等减少肿瘤细胞凋亡,激活自噬相关途径的基因诱发自噬.在肿瘤进展中,核仁素促进血管生成素的分泌活化内皮细胞(endothelial cells,EC),并且激活趋化因子信号通路提高肿瘤细胞的迁移和侵袭.近来适配子、多肽、免疫剂在核仁素治疗研究中取得了进展.核仁素作为独立预后标志物具有重要的价值.进一步探讨核仁素与肿瘤的关系以及肿瘤发生发展的分子机制,为肿瘤的治疗提供潜在的生物学作用靶点.     

转基因小鼠高表达的FasL对Sertoli细胞免疫调节功能的影响

目的 :研究转基因小鼠高表达的FasL对Sertoli细胞在睾丸局部感染时的免疫调节作用的影响。方法 :将溶脲脲原体 (UU)分别注入FasL转基因及野生型小鼠膀胱 ,模拟上行性感染的途径。分别在感染后 1、2和 3wk处死小鼠 ,分离睾丸组织观察其病理变化 ,并用免疫组化染色法比较UU感染前后 ,Ser toli细胞上FasL和TGF β、IL 1α、IL 6的表达及分泌格局的差异。从野生型小鼠睾丸组织中分离高纯度的Sertoli细胞 ,与未感染UU的对照组相比 ,观察UU感染后FasL Sertoli细胞介导Fas Jurkat细胞的凋亡能力的变化。结果 :UU感染组的转基因小鼠 ,睾丸组织发生的病理改变比野生型更为明显 ;两种小鼠感染后Sertoli细胞分泌的调节因子变化格局不同 ;感染后Sertoli细胞对Jurkat细胞的杀伤能力增强。结论 :在抗感染免疫中 ,转基因表达的FasL可影响Sertoli细胞分泌细胞因子的格局 ,进而影响睾丸局部的免疫平衡。过高表达的FasL对机体的抗感染应答并非一定有利。     

小鼠白蛋白基因的特异性调控及其在转基因动物中的应用

白蛋白是肝脏表达的血清蛋白 ,其组织特异性表达的基础在于白蛋白基因存在特异性调控序列如启动子、增强子 ,可与肝脏富含的转录因子如 HNF1、C/ EBP及 e H- TF等特异性结合 ,刺激基因高效转录。自 1 989年 Izban克隆并提交了小鼠白蛋白调控序列 ,其在转基因动物及基因治疗中得到了广泛的应用 ,实现了基因转移的器官靶向性。近年的研究发现 ,与其他启动子如 CMV、PGK相比 ,白蛋白启动子引导的基因转移引起的免疫反应较轻 ,并可克服因启动子失活而导致的转基因沉默现象 ,相信随着转基因技术的不断发展 ,其将有越来越广泛的应用     

MagA转基因小鼠模型的建立

目的建立MagA转基因小鼠,为活体MRI成像系统提供重要的实验动物模型。方法采用显微注射法．将MagA基因导入小鼠受精卵,再培育成转基因小鼠并繁殖传代。利用PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。结果酶切和DNA测序分析证实MagA基因准确克隆表达载体设计位点,目的基因序列与GenBank中MagA序列完全一致。通过PCR分析,进行转基因整合检测。目前转基因小鼠已稳定传代至第5代。结论MagA基因在转基因小鼠中整合,成功建立了MagA转基因小鼠。MagA转基因小鼠将成为MRI影像系统的重要实验动物模型。     

Mito-cpYFP cDNA转基因小鼠的建立及其自由基分布规律的初步探讨

目的:利用可实时动态测量超氧阴离子自由基的环状排列黄色荧光蛋白(circularly permuted yellow fluorescent protein,cpYFP)构建可实时动态监测活体动物体内自由基的转基因动物模型。方法:应用转基因技术将载有可定位于线粒体内的cpYFP(mitochondria-targeted cpYFP,mito-cpYFP)的载体pRP(Exp)-CAGGmitocpYFP注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,采用PCR及RT-PCR的方法鉴定阳性小鼠,通过荧光观察自由基的分布并辅助鉴定阳性小鼠。结果:PCR、RT-PCR及荧光观察结果表明mito-cpYFP cDNA转基因小鼠构建成功。通过与野生型C57BL/6小鼠交配,得到F1、F2和F3代的新生幼鼠共计494只,其中,阳性幼鼠为255只,阳性率为51.6%。转基因阳性鼠体内出现了绿色荧光,其解剖伤口、肠道、脑部及口腔黏膜等荧光明显,而肾脏、肝脏及胸腺等荧光则较弱,耻骨联合部和膀胱出现绿色荧光,但约0.5 h后消失。结论:我们成功制备了可稳定表达并遗传mito-cpYFP的转基因小鼠品系。在活体动物体内,自由基在黏膜层含量较多。此模型可研究自由基在生物体内的含量及分布规律,为后续生物自由基作为信号分子在机体内传导途径的研究提供有效的工具。     

肝脏特异HPPCn转基因小鼠的建立及表型分析

目的建立高表达HPPCn转基因小鼠,为研究该基因在肝癌发生发展中的功能提供研究模型。方法显微注射外源基因pGEM-A1b/his-HPPCn至FVB/N小鼠原核,注射受精卵移植到假孕受体出生个体。PCR和Southern blot鉴定转基因小鼠基因型,Western blot和Realtime-PCR检测转基因阳性和阴性小鼠肝脏HPPCn蛋白表达情况,HE染色和透射电镜观察肝脏病理改变。结果经检测,显微注射共产生2只首建鼠,转入的重组HPPCn基因能在肝脏中特异表达,并能够稳定遗传。转基因小鼠肝脏内HPPCn含量明显增高。转基因后并未对小鼠造成不良影响。结论 HPPCn参与了肝癌发生发展的过程,其在体内的高水平表达,为在体内研究该基因的功能提供了工具。     

APPSWE转基因鼠的繁育及子代鉴定的研究

目的:探讨老年性痴呆(AD)转基因模型鼠(TgAPPSWE2576杂合子鼠,Tg2576)的优化繁育方法,鉴定APPSWE基因阳性的子代鼠,为下一步AD研究奠定基础。方法:(1)用3种不同的交配方式观察子代鼠的存活率及APPSWE基因阳性的比率;(2)从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,用PCR方法扩增APPSWE基因片段,电泳后观察结果;(3)PCR产物装入pGEM-T easy载体中,测序证实其基因序列。结果:雄性和雌性Tg2576互交,所产4窝子鼠,2 d内全部死亡。雄性Tg2576和雌性C57BL交配所产子鼠存活率81%,APPSWE基因的阳性率为43.3%。雌性Tg2576和雄性C57BL交配存活率82.4%,APPSWE基因的阳性率21.9%。经秩和检验两种繁育方式所产子鼠的存活率无显著差异(P＞0.05),APPSWE基因的阳性率有显著差异(P＜0.05)。琼脂糖电泳显示PCR产物分子量为428 bp,与目的基因片段相对分子质量大小一致;DNA序列测定证实PCR产物基因序列和APP片段基因序列一致,并存在APPSWE(K670N,M671L)突变。结论:雄性Tg2576和雌性C57BL品系小鼠交配是繁育APPSWE基因阳性子鼠的较好方法;本实验所用PCR方法能够精确鉴定APPSWE基因阳性子鼠,为AD的实验研究提供了较理想的动物模型。     

实时荧光定量PCR检测转基因小鼠外源基因拷贝数方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量PCR方法检测CaMKⅡα-Cre转基因小鼠外源基因拷贝数的方法。方法以CaMKⅡα-Cre转基因首建鼠及其仔代阳性鼠为研究对象,利用绝对定量的实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠的拷贝数,并筛选出纯合子小鼠再经遗传育种方法以确定为纯合子小鼠。结果绝对定量标准曲线公式为:△Ct=-2.402log5N(拷贝数)+8.654,相关系数为0.9999,扩增效率为95.4%。三只CaMKⅡα-Cre首建鼠的拷贝数分别为19、7、5;三个转基因小鼠品系均成功获得纯合子小鼠。结论成功建立了检测转基因小鼠外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法,该方法可用于检测各种转基因小鼠中外源基因的拷贝数。     

四环素调控的小鼠LAIR-1/CD305转基因小鼠的初步建立

目的：建立四环素调控的小鼠LAIR-1/CD305转基因小鼠,为进一步研究mLAIR-1分子的体内功能奠定基础.方法：构建pBI-5-mLAIR-1载体,显微注入B6D1F1受精卵,PCR检测新生小鼠基因组DNA中LAIR-1与荧光素酶（Luciferase）基因.将mLAIR-1和荧光素酶双阳性小鼠耳成纤维细胞转染含rtTA的pUHD17.1质粒,用含盐酸强力霉素（Dox）的培养基进行培养,检测细胞裂解液中荧光素酶活性.将荧光素酶表达依赖Dox小鼠与C57BL/6交配,采用PCR对子代鼠进行检测.结果：共获得9只首建鼠,其目的基因表达高度依赖Dox,并得到其中5只首建鼠的F1代小鼠.结论：获得了四环素调控的小鼠LAIR-1转基因小鼠,可用于该分子体内功能的研究.     

核仁素在甲状腺乳头状癌中表达的临床意义

目的 探讨核仁素（NCL）在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组织化学SP染色法检测60例正常甲状腺组织与甲状腺乳头状癌中NCL、趋化因子受体-7（CCR7）与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达,分析NCL、CCR7与MMP-9的表达与性别、年龄、肿瘤大小与
有无转移的关系以及核仁素与CCR7、MMP-9表达的相关性。结果 NCL在正常甲状腺及甲状腺乳头状癌中的总阳性率分别为0、 100%。NCL在伴随转移组癌组织中表达于细胞核、细胞质与细胞膜;NCL在无转移组癌组织中仅表达于细胞核,差异有统计学意义（P<0.05）。不同年龄、性别、
肿瘤大小的NCL表达率间的差异无统计学意义(P>0.05)。核仁素细胞核外阳性表达与CCR7与MMP-9的阳性表达呈正相关（P<0.01）。结论 NCL在甲状腺乳头状癌中表达,表达部位在转移与非转移组明显不同,且与CCR7、MMP-9表达有密切关系。核仁素可作为区别癌转移与非转移的标志。     

四环素调控的PTA1/CD226转基因小鼠的初步建立

为研究小鼠PTA1分子在体内的功能,建立四环素调控的小鼠PTA1/CD226转基因小鼠,我们构建了pBI-5-mPTA1载体,显微注射入B6D1F1受精卵,使用PCR检测新生小鼠基因组DNA中的PTA1与荧光素酶(luciferase)基因。将mPTA1和荧光素酶双阳性小鼠耳成纤维细胞转染含rtTA的pUHD17.1质粒,用含有盐酸强力霉素(Dox)的培养基进行培养,检测细胞裂解液中荧光素酶的活性。将荧光素酶表达依赖Dox的小鼠与C57BL/6小鼠交配,采用PCR对子代鼠进行检测。最终共获得7只首建鼠,其目的基因表达高度依赖Dox,并得到了其中2只首建鼠的F1代小鼠。     

阿尔茨海默病转基因小鼠海马结构NIX的变化

目的观察阿尔茨海默病转基因小鼠海马结构NIX的变化。方法以Morris水迷宫检测野生型和突变型转基因小鼠学习记忆能力,免疫组织化学和共聚焦激光扫描显微技术观察转基因小鼠海马结构促凋亡蛋白NIX的变化结果野生型和突变型小鼠逃避潜伏期中位数分别为29.00 s和38.00 s,差异无统计学意义,P>0.05;野生型和突变型小鼠搜索策略相比,突变型较野生型使用的搜索策略减少,差异有统计学意义,P<0.05;野生型和突变型小鼠NIX免疫反应阳性物灰度值中位数分别为103.83和128.85,差异有统计学意义,P<0.05;野生型和突变型小鼠海马结构NIX平均荧光强度分别为92.18±7.81和103.07±14.94,差异有统计学意义,P<0.05;野生型和突变型小鼠海马结构NIX与线粒体共定位的数目分别为240.94±169.48和544.18±336.44,差异有统计学意义,P<0.05。结论阿尔茨海默病转基因小鼠出现学习记忆障碍,海马结构促凋亡蛋白NIX的量增多,且NIX与线粒体共定位的量增多,提示NIX在阿尔茨海默病病理改变过程中可能起到一定的作用。