BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

干扰素调节因子3 rs2304204野生型及突变型重组质粒的构建及活性分析

目的构建干扰素调节因子3（IRF-3）rs2304204野生型及突变型重组质粒并比较二者启动子活性。为进一步研究IRF-3对HBV感染的影响打下基础。方法以人全血DNA为模板,扩增含rs2304204位点的IRF-3启动子区1355bp目的序列,插入pGL3-Basic载体中,构建rs2304204野生型的重组质粒（wIRF-3）。以wIRF-3为模板,利用基因定点突变试剂盒构建rs2304204突变型重组质粒（mIRF-3）。wIRF．3、mIRF-3和pGL3-Basic质粒分别转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,并计算荧光素酶相对活性单位（RLU）。结果成功构建IRF-3rs2304204野生型及突变型重组质粒,且wIRF-3质粒转染组RLU明显高于mIRF-3质粒转染组（P〈0．005）。结论野生型重组质粒的启动子活性明显高于突变型重组质粒,启动子活性的不同可能进而影响机体抗HBV感染的临床结局。     

SLC2A4基因启动子区rs5418位点变异对基因表达的影响

目的: 研究葡萄糖转运蛋白4(SLC2A4)基因启动子区rs5418多态位点G→A变异对基因表达的影响。方法: PCR法扩增SLC2A4基因核心启动子区序列。采用基因重组、定点突变等技术,构建rs5418位点含有不同等位基因的SLC2A4基因启动子重组表达载体。脂质体转染法将重组质粒转入HEK293T细胞,采用双萤光素酶报告系统,观察携带不同等位基因的重组质粒中下游报告基因的表达活性。结果: PCR扩增获得长度为716 bp的SLC2A4基因核心启动子序列,成功构建pGL3-SLC2A4-prom(A)和pGL3-SLC2A4-prom(G)重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,携带A等位基因的载体启动下游报告基因表达的相对活性(19.49±4.41)比携带G等位基因的载体(13.04±4.45)强,两者存在显著差异(P<0.05)。结论: SLC2A4基因启动子区rs5418位点的G→A突变能显著增强启动子活性,从而影响SLC2A4基因表达活性。     

人BAFF-R基因启动子活性的初步研究

目的以B淋巴细胞刺激因子受体BAFF-R基因5'上游区序列为研究对象,初步鉴定、分析该基因的启动子所在区域。方法克隆BAFF-R基因5'侧翼区1823 bp序列,构建8个含有不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-B1～B8,将这8个序列缺失重组质粒与psv-β-gal质粒共转染细胞,检测荧光素酶的相对活性,确定启动子所在区域。结果8个重组质粒中pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6启动子的活性较低;pGL3-B7启动子的活性最强,pGL3-B8启动子活性最低。结论BAFF-R基因5'端-288～-430、-712～-868和-1420～-1562三个区段可能存在转录沉默子元件,-617～-712和-1277～-1420区段存在转录增强子元件,BAFF-R基因的核心启动子可能位于-1420～+261区域。     

pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景：Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。 目的：构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。 方法：设计和合成包含5’非转录区的约2 000 bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coli DH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组：对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1 promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。 结果与结论：重组质粒DNA测序结果采用NCBI blast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强 (P < 0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响。方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327)。将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性。结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P0.05)。结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控。     

Prohibitin启动子中胆固醇活性作用位点研究

 目的：验证抑制素（prohibitin,PHB）基因启动子胆固醇敏感活性作用位点,为PHB在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法：采用PCR分段扩增PHB启动子,克隆入pGL3-Basic萤光素酶报告基因载体。将构建的重组质粒用脂质体转染至人前列腺癌PC-3细胞,再分别培养于低胆固醇培养基和普通胆固醇培养基中,检测PHB启动子各分段重组质粒萤光素酶活性的变化。限定PHB启动子约200 bp的胆固醇敏感启动区域,找出其中的固醇调节元件（sterol regulatory element,SRE）同源位点并进行点突变,证实PHB基因的胆固醇敏感调控位点。结果：PHB启动子和各分段产物构建质粒完整。与转染完整PHB启动子（pPHB-1192）的PC-3细胞比较,转染pPHB-179 (-35/+138)的PC-3细胞萤光素酶活性显著降低（P<0.05）。点突变位于PHB启动子上的-117到-108 bp的SRE可能位点后,与转染pPHB-1192的PC-3细胞比较,转染SRE点突变的PC-3细胞萤光素酶活性显著降低（P<0.05）。结论：PHB启动子在人前列腺癌PC-3细胞中的活性受胆固醇调节。PHB启动子中对胆固醇敏感的作用位点位于-117到-108 bp的SRE同源位点。PHB可能成为前列腺癌靶向基因治疗的有效工具。     

TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

目的:构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法:设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的引物,扩增回收片段,将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒,经双酶切和测序鉴定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果:成功构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-△ERE突变质粒,激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析,pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒均具有基础转录活性,与对照组比较(P0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的启动子转录活性(P0.01),而对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的活性无影响(P0.05)。结论:本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子质粒,发现非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(AP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发挥决定性作用。     

错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建与鉴定

 目的：构建含hMLH1启动子片段的萤光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素诱导下的转录活性。方法：以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增hMLH1启动子片段（-1953/+53）,插入萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic,将重组质粒转入HEK293细胞,检测在有和无雌激素诱导下萤光素酶的活性变化。结果：酶切和测序结果证实重组萤光素酶报告基因载体pGL3-Promoter1-luc构建成功。转染pGL3-Promoter1-luc后,雌激素诱导的萤光素酶活性为7.45±0.81,显著高于无水乙醇组的3.28±0.19 (n=3,P<0.001)。结论：hMLH1启动子片段存在与雌激素相关的调控序列。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455~ 55bp)、pGL3-417(-417~ 55bp)、pGL3-280(-280~ 55bp)、pGL3-202(-202~ 55bp)、pGL3-81(-81~ 55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47~ 55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47~ 55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81~ 55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47~ 55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81~-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。     

重组法国梧桐花粉过敏原2( rPla a2) 对诱导型一氧化氮合酶( NOS2)基因启动子活性及基因表达的影响

目的:构建人诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因启动子区,对NOS2 启动子序列进行鉴定并分析其活性;探索重组法国梧桐花粉过敏原2(rPla a2)对人NOS2 基因启动子活性及基因表达的影响。方法:利用PCR 扩增、限制性内切酶双酶切、DNA 连接酶连接、大肠杆菌转化等方法将NOS2 基因启动子区克隆至pGL3-Basic 载体上,将所构建重组报告质粒转染至人胚肾(HEK293T)细胞中,利用双荧光素酶活性分析检测该重组报告质粒启动子活性及检测rPla a2 对人NOS2 基因启动子活性的影响;用实时荧光定量PCR 法检测rPla a2 对人NOS2 基因mRNA 水平的影响。结果:成功构建含有NOS2 启动子的重组报告质粒,与对照(pGL3-Basic) 组相比,含NOS2 启动子区的重组质粒转染组荧光素酶活性显著增高;与不加刺激(NOS2)组相比,加入rPla a2 刺激后含NOS2 启动子区的重组报告质粒转染组荧光素酶活性显著增高,加入rPla a2 刺激后NOS2 mRNA 相对表达水平显著增高。结论:rPla a2 可增强人NOS2 基因启动子活性,并增加其基因表达。     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

小鼠BCMA基因启动子活性研究

目的:探索B淋巴细胞成熟抗原(BCMA)基因5′上游序列的启动子活性, 为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据.方法:构建由BCMA基因5′上游-820～ 145、 -607～ 145、 -359～ 145、 -157～ 145、 -93～ 145 5个片段驱动的荧光素酶报告载体pGL3-B820、 pGL3-B607、 pGL3-B359、 pGL3-B157、 pGL3-B93, 通过转染J558L、 293T、 HeLa细胞检测荧光素酶的表达, 观察荧光素酶相对活性.结果:5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3-B157>pGL3-B607>pGL3-B359>pGL3-B93>pGL3-B820.pGL3-B157在3种细胞中的转录激活能力为J558L>HeLa>293T, 且在J558L中的转录激活能力明显强于Hela和293T细胞.结论:BCMA基因5′上游序列"-820 bp～ 145 bp"具有启动子活性, 核心启动子可能位于-93～ 145区域中.     

特异性hTERT启动子在肿瘤细胞中启动效率研究

目的证明人端粒酶亚单位（hTERT）启动子可以引导目的基因在肿瘤细胞中表达。方法先使用RT-PCR检测各细胞系中hTERT mRNA的表达,再使用PCR方法扩增hTERT启动子基因的不同长度片段,并构建重组质粒,使用BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒并测序。最后使用Dual-Glo Luciferase Assay System激发荧光检测各细胞系中重组质粒中hTERT启动子的启动效率。结果 pGL3-204、pGL3-378、pGL3-1375重组质粒中的hTERT启动子序列与预期一致,质粒构建成功。hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒在H460中启动效率最强可以达到SV40启动子的80%,而在FRO、U251中启动效率可以达到SV40启动子的30%左右。hTERT全长启动子序列的启动效率在ARO细胞系中比pGL3-204、pGL3-378中的启动子片段启动效率强,而在FRO、H460和U251细胞系中pGL3-204中的启动子片段启动效率最强。结论 hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒,可以实现只在肿瘤细胞系中表达,但在正常细胞中不表达的效果。     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探

目的：构建NOx4荧光素酶报告基因质粒载体,探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作,采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列（533bp）,插入质粒DGL3-basic载体,构建重组质粒pGL3-NOX4,重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3-NOX4转染A549细胞,通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激,结果显示NOx4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。     

HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性

 目的 探讨HCV 核心蛋白对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响。方法 以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27bp, -837～-27bp, -1202～-27bp, -1619～-27bp, -2029～-27bp),以pGL3-Basic为载体分别构建SFRP1启动子区截短报告质粒。将构建好的质粒与pRL-TK共转染HEK293细胞,确定启动子区活性最强区域;分别用编码HCV 核心蛋白的腺病毒或GFP对照腺病毒感染已转染重组报告质粒的SK-Hep1细胞,观察AdCore对SFRP1启动子活性的调控作用。结果 SFRP1启动子区域-407～-27bp片段活性最强;与pGL3-Basic对照组相比较,相对荧光素酶活性增加了37.31±4.45倍(P<0.01),pGL3-S2～S5的活性分别增加了28.74±2.47、13.56±2.52、12.97±0.87和8.29±0.09倍(P<0.01);HCV Core蛋白能够抑制SFRP1基因启动子区活性,其对pGL3-S1的抑制作用最强,与GFP对照组相比较,抑制率为63.8%±1.0% (P<0.01)。结论 HCV核心蛋白通过抑制SFRP1启动子区活性下调SFRP1基因的表达,可能参与Wnt/β-catenin信号通路的活化,并与原发性肝癌的发生密切相关。