人类疱疹病毒6型感染U251细胞及其生物学功能的研究

目的:研究人类疱疹病毒6型(HHV-6)感染人星形胶质瘤细胞U251,及感染后对其生物学功能的影响。方法:HHV-6感染U251细胞建立HHV-6体外感染模型,倒置显微镜观察细胞病变。PCR法检测HHV-6u22基因。间接免疫荧光(IFA)检测HHV-6即刻早期蛋白(IE1)和晚期蛋白(gB)的表达。MTT法检测U251感染HHV-6后细胞增殖的改变。流式细胞术(FCM)检测U251细胞周期改变。结果:在感染3天后U251出现典型细胞病变,细胞肿胀增大数倍,透亮,呈多形性。PCR检测到HHV-6u22基因。IFA检测到HHV-6IE1蛋白和gB蛋白的表达。MTT法显示HHV-6能增强U251细胞的增殖能力。FCM检测表明,HHV-6感染后U251细胞周期发生改变,感染组和对照组相比,前者G1期的细胞减少,S期和G2期细胞增多。结论:HHV-6能感染U251细胞引起细胞病变,促进细胞的增殖,使细胞周期发生改变。本研究结果提示人类疱疹病毒6型可能参与人神经胶质瘤的发生、发展,对其机制尚不清楚。     

人类疱疹病毒6A对神经细胞的嗜性及细胞周期的影响

目的:研究人类疱疹病毒6A对神经细胞嗜性及细胞周期的影响。方法:HHV-6A GS株感染神经细胞,倒置显微镜观察细胞病变。PCR法鉴定神经细胞中HHV-6A U22基因,实时荧光定量PCR法测定神经细胞中HHV-6A U22基因的相对含量。免疫细胞化学和Western blot检测神经细胞中HHV-6A糖蛋白gB的表达。神经细胞感染HHV-6A后MTT法测定细胞增殖的改变,流式细胞仪检测神经细胞周期的改变。结果:HHV-6A GS株感染5天后,U373细胞形态无明显变化,SK-N-SH和SHG44细胞聚集,折光性降低,细胞发生明显病变。PCR法检测到U373、SK-N-SH和SHG44细胞中均含有HHV-6A U22基因,实时荧光定量PCR法发现随着感染天数的增加,HHV-6A DNA在细胞中含量逐渐降低。免疫细胞化学和Western blot结果显示病毒糖蛋白gB在细胞中表达,其中在U373细胞和SHG44细胞中的表达量高于SK-N-SH细胞。MTT法显示HHV-6A促进U373细胞和SHG44细胞的增殖,抑制SK-N-SH细胞的增殖。流式细胞仪检测细胞周期,结果显示U373和SHG44细胞感染组与对照组相...     

人疱疹病毒6B感染对Molt3细胞增殖和细胞周期的影响

目的 :研究人疱疹病毒(human herpesvirus,HHV)6B感染T淋巴细胞系Molt3后对其细胞增殖和周期的影响。方法 :HHV-6B感染Molt3细胞后,倒置显微镜观察细胞形态变化,PCR鉴定Molt3细胞中HHV-6 U22基因,间接免疫荧光及Western blot检测HHV-6蛋白表达;MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化,荧光定量PCR检测细胞周期相关蛋白m RNA水平变化。结果:HHV-6B感染48 h后,Molt3细胞出现典型细胞病变。PCR检测到感染组细胞中含有HHV-6 U22基因,间接免疫荧光及Western blot均检测到HHV-6蛋白表达。MTT显示HHV-6B能明显抑制Molt3细胞的增殖。HHV-6B感染后Molt3细胞周期发生改变,与对照组相比,感染组细胞G1期增多,S期和G2期减少。实时荧光定量PCR表明HHV-6B感染后cyclin E1m RNA水平降低,p53 m RNA水平升高。结论:HHV-6B能够有效感染Molt3细胞引起典型的细胞病变效应,HHV-6B感染使细胞周期阻滞在G1期从而抑制细胞增殖。     

Mig-7通过MEK/ERK信号通路抑制胶质瘤U251侵袭及血管生成拟态

目的研究迁移诱导基因7（Mig-7）通过MEK/ERK信号通路抑制人脑胶质瘤细胞株U251体外血管生成拟态（VM）形成能 力和迁移、侵袭能力的影响。方法采用RNA干扰技术将特异性针对Mig-7基因的sh-Mig-7 转入人脑胶质瘤U251细胞中,并 观察感染效率;用携带有sh-Mig-7和阴性对照（sh-NC）的慢病毒感染U251 细胞后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中 Mig-7的表达水平;采用体外三维培养和Transwell小室侵袭实验观察Mig-7基因沉默对各组U251细胞VM 形成能力和侵袭能 力的影响。采用western-blot检测各组细胞中MEK/ERK的蛋白表达水平。结果携带有sh-Mig-7和sh-NC的慢病毒成功感染 U251细胞,并获得稳定低表达Mig-7基因的U251细胞株;与感染sh-NC慢病毒和未感染病毒的的细胞相比,sh-Mig-7感染组 U251细胞中Mig-7的表达水平以显著降低（P均<0.01）;与空白对照组和sh-NC感染组相比,sh-Mig-7 感染组U251细胞的侵袭 能力明显下降（P<0.01）,并且sh-Mig-7 感染组U251 细胞VM形成能力明显下降（P<0.05）。与空白对照组和sh-NC感染组相 比,sh-Mig-7感染组U251细胞的MEK、ERK蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。结论沉默Mig -7 基因的表达,可能通过 MEK/ERK信号通路抑制U251 细胞的VM 形成及侵袭能力,提示Mig -7 基因在人脑胶质瘤细胞的VM 和侵袭中发挥重要 的作用。     

人类疱疹病毒6型引起的细胞融合机制

目的：观察人类疱疹病毒6型（HHV-6A）引起的细胞融合不依赖于病毒的复制（FFWO）。 方法：细胞用10^3-4TCID₅₀ HHV-6感染1 h,在感染后2~3 d用HE染色,观察细胞融合现象。Vero细胞用10^3-4TCID₅₀ HHV-6感染1 h后培养液中加入磷甲酸（PFA）（终浓度300 mg•L^-1）和环已酰亚胺（CHX）（终浓度100 mg•L^-1）,分别在感染后2 h和24 h经HE染色鉴定以确定是否产生FFWO。 结果：HHV-6A感染细胞2 h后可观察到细胞融合现象,加入CHX时这种现象亦可观察到,提示HHV-6A感染可引起FFWO;这种细胞融合现象的出现依赖于HHV-6的受体CD46表达于靶细胞表面。结论：HHV-6A通过其受体CD46在多种人类细胞引起FFWO。     

人类疱疹病毒-6:分子生物学及临床特征

人类疱疹病毒-6型在人类的感染是普遍存在的,1986年美国首先从6例淋巴增生性疾病的外周单个核细胞分离到一种新病毒.这种病毒的形状结构与疱疹病毒科的其它成员相似,但分子病毒学和免疫学研究则显示它与HSV、VZV、CMV和EBV均不同,故命名为HHV-6.HHV-6主要感染CD4 T.HHV-6分为两种亚型:HHV-6A和HHV-6B.根据遗传学的特征、对于单抗反应性、细胞的亲噬性、疾病的主要症状,都表明了HHV-6A、HHV-6B属于β-疱疹病毒亚科.此病毒宿主范围较狭窄.HHV-6的原发感染多见于6个月至2岁的婴儿,可引起幼儿丘疹或婴儿玫瑰疹,成人一般不引起临床症状,但可抑制机体的免疫反应.HHV-6与人类的多种疾病有关,如多发性硬化症(MS),但机制不清.目前,HHV-6在分子生物学上的发展主要包括:HHV-6受体检测和HHV-6A、HHV-6B基因结构的测序.     

KDM6A基因对急性髓系白血病细胞增殖、凋亡的影响

目的 体外观察过表达和敲减赖氨酸特异性去甲基化酶6A(KDM6A)基因对急性髓系白血病(AML)细胞增殖、凋亡的影响,为急性髓系白血病基因靶向治疗提供理论依据.方法 体外培养U937细胞,分为5组:U937细胞组、sh-control组(转染慢病毒空载体)、sh-KDM6A组(转染shKDM6A慢病毒载体)、pcDNA...     

人类疱疹病毒7U41的表达时相及细胞内定位研究

目的：探讨人类疱疹病毒7（human herpesvirus 7,HHV-7)U4l的表达时相及细胞内定位。方法：免疫荧光检测U4l蛋白的细胞内定位，RT-PCR检测U41RNA的表达时相。结果：免疫荧光检测显示，无论在HHV-7感染细胞或HHV-7U41转染细胞，U41蛋白都是仅在其胞核中弥漫性的分布。在分别加入CHX(cycloheximide)和PFA(phosphomoformic acid)作为蛋白合成和核酸合成抑制剂感染细胞中，U41的表达时相检测结果显示U4l蛋白在HHV-7感染细胞中是一早期表达蛋白。结论：HHV-7U4l在病毒复制的早期表达，并积聚于细胞核中，可能与调控病毒DNA模板延伸以及病毒DNA的合成相关。     

RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤U251细胞化疗敏感性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞化疗敏感性的影响。方法:设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blot检测Aurora A mRNA和蛋白表达情况,同时利用MTT试验和流式细胞仪检测在化疗药物尼莫司汀(ACNU)作用下转染Aurora A siRNA前后U251细胞增殖及凋亡情况的变化。结果:转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低。ACNU对转染Aurora A siRNA后U251细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时在ACNU作用下转染后U251细胞的凋亡率也显著增加(P<0.05)。结论:体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功的抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。     

人疱疹病毒6型DR7蛋白在神经胶质瘤发生中的作用研究

【立论依据】 神经胶质瘤是人类最常见的颅内原发性肿瘤,恶性程度高,对人类健康造成严重威胁。近年来有关神经胶质瘤和病毒感染相关的证据逐渐增多。人疱疹病毒6型 (human herpesvirus 6, HHV-6)是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒,分为HHV-6A和6B两个亚型。HHV-6是一种肿瘤相关病毒,近年来国内外文献均报道在胶质瘤标本中 HHV-6DNA和蛋白的阳性率明显高于对照组,表明HHV-6感染在神经胶质瘤的发生中具有重要作用,但是起关键作用的病毒基因及机制仍不十分清楚。HHV-6 DR7基因是潜在的转化基因,其表达产物是一种转录激活子。文献报道DR7蛋白能导致NIH3T3细胞体外转化以及裸鼠皮下成瘤,DR7蛋白还可以和肿瘤抑制基因p53结合导致p53功能缺失。为探究 DR7在神经胶质瘤发生中的作用,我们通过免疫组化检测了神经胶质瘤组织中DR7的表达,发现神经胶质瘤组织中DR7的阳性率明显高于瘤旁及正常组织。 【设计思路】 首先明确DR7蛋白对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和转移的影响,然后深入研究引起上述变化的分子机制,并在体内进一步证实DR7蛋白对神经胶质瘤肿瘤形成能力的影响。 【实验内容】 (1)构建 DR7过表达载体,建立DR7过表达稳定转染细胞系。(2)细胞水平上研究DR7蛋白对细胞增殖,侵袭和转移等生物学功能的影响。(3)运用基因芯片,real-time PCR和蛋白质印迹等技术确定引起上述变化的机制。(4)体内验证DR7蛋白对神经胶质瘤细胞肿瘤形成能力的影响。 【材料】 HHV-6标准株,U87细胞株,real-time PCR试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体,裸鼠。 【可行性】 (1)理论依据充分。HHV-6是嗜神经的DNA病毒,可长期潜伏于中枢神经系统。潜伏期的HHV-6基因组可整合于宿主染色体,一旦宿主免疫力下降则再激活,激活的HHV-6表达多种病毒蛋白,其中DR7是具有反式激活能力的转化基因。(2)有前期结果。我们已成功建立了DR7过表达稳定转染细胞系,MTT和Transwell实验均表明DR7蛋白能明显促进U87细胞的增殖和侵袭。 【创新性】 本研究基于临床,运用分子生物学的相关技术,首次研究HHV-6DR7在神经胶质瘤发生发展中的作用,将为神经胶质瘤的预防及治疗提供新靶点。     

Effect of Human Cytomegalovirus Infection on Nerve Growth Factor Expression in Human Glioma U251 Cells

Objective To explore the change of endogenic nerve growth factor （NGF） expression in human glioma cells infected with human cytomegalovirus （HCMV）. Methods U251 cells were cultured in RPMI 1640 culture medium and infected with HCMV AD 169 strain in vitro to establish a cell model of viral infection. Morphologic changes of U251 cells were observed under inverted microscope before and after infection with HCMV. Expression of NGF gene and protein of cells was detected by RT-PCR and Western blotting before and after infection with HCMV. Results The cytopathic effects of HCMV-infected cells appeared on day 5 after infection. However, differential NGF expression was evident on day 7. NGF expression was decreased significantly in U251 cells on day 7 after infection in comparison with control group （P〈0.05）. Conclusion HCMV can down-regulate endogenous NGF levels in human glioma cell line U251.     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。     

Stra 6基因的克隆及其在U251细胞中的表达定位

目的:从人胎盘cDNA文库中获得Stra6基因的全长阅读框架,通过融合GFP蛋白的表达观察其在人脑胶质母细胞瘤细胞株U251中的表达定位及形态学影响。方法:应用高保真PCR技术从人胎盘cDNA文库中扩增出特异片段,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-Stra6,转染U251细胞,荧光倒置显微镜观察蛋白表达定位及对形态学影响。结果:获得含人Stra6基因全长阅读框架的重组质粒pEGFP-Stra6,融合GFP的Stra6蛋白大多表达于细胞质和细胞膜。可观察到转染后的细胞呈现分化状态。结论:Stra6基因过表达使U251细胞形态改变,可能在细胞分化中起作用。     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

人类巨细胞病毒感染对U251细胞HOXB1基因表达的影响

目的：通过研究人神经胶质瘤U251细胞株的HOX基因表达状态及人类巨细胞病毒(HCMV)感染对U251细胞HOXBI基因表达的影响，以探讨HCMV致畸的可能机制。方法：应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术。结果：U251细胞表达HOXBI基因；HCMV感染后，U251细胞HOXBI基因表达明显上调；ATRA能显著上调HCMV感染后U251细胞HOXBI基因的表达。结论：HCMV感染能诱导U251细胞HOXBI基因表达上调，HCMV有可能通过调控HOXB基因表达异常引起胚胎发育畸形。     

鸦胆子油乳对胶质瘤U251细胞血管内皮生长因子表达水平的影响

目的:研究鸦胆子油乳对胶质瘤U251细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的抑制情况.方法:体外培养人脑胶质瘤U251细胞,设置对照组和3个药物组(鸦胆子油乳终质量浓度分别为5 g/L、25 g/L和1.25 g/L),利用酶联免疫吸附法测定培养细胞上清液中VEGF含量;应用免疫细胞化学法检测胶质瘤U251细胞中VEGF的变化.结果:酶联免疫吸附法测定培养细胞上清中VEGF含量显示,随着药物浓度的增加U251细胞分泌的VEGF均较对照组明显减少(P<0.01).免疫组织化学显示,随着鸦胆子油乳注射液作用剂量的增加,VEGF蛋白的表达逐渐减少.结论:鸦胆子油乳注射液能抑制胶质瘤细胞中VEGF的表达.