Neuropilin-1在子宫内膜癌细胞系中的表达及17β雌二醇对其表达的调控及意义

目的:探讨神经纤毛蛋白(NRP-1)在子宫内膜癌细胞系中的表达及17β雌二醇(17β-E2)对其表达的调控。方法:采用RT-PCR法及Western blot法检测NRP-1在子宫内膜癌HEC-1A及Ishikawa细胞系中的表达;荧光定量PCR法检测17β-E2对HEC-1A及Ishikawa细胞系中NRP-1 mRNA表达的调控;Western blot法检测Ishikawa细胞中NRP-1表达的变化。结果:HEC-1A及Ishikawa细胞中NRP-1 mRNA及蛋白水平均为阳性表达。17β-E2对Ishikawa细胞系中NRP-1 mRNA表达的影响显著强于HEC-1A,且17β-E2浓度为2×10-7mol/L,作用时间48h时对NRP-1 mRNA表达的促进作用最明显。17β-E2对Ishikawa细胞中NRP-1蛋白表达呈时间依赖性。结论:NRP-1表达于高表达雌激素受体(ER)细胞系Ishikawa及低表达ER细胞系HEC-1A中,且2×10-7mol/l E2作用48h能明显促进Ishikawa细胞系中NRP-1的表达,提示NRP-1可能与子宫内膜癌的发生发展密切相关。     

RANKL对人子宫内膜癌细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨RANKL对人子宫内膜癌细胞转移和上皮间质转化的影响。方法:体外构建针对细胞核因子κB受体活化因子(RANK)的过表达质粒载体(p IRES2-3FLAG-EGFP-RANK),脂质体法转染人子宫内膜癌HEC-1A细胞株,形成HEC-1ARANK细胞(过表达质粒组),并与HEC-1A~Control细胞(空白质粒组)相对照。给予1μg/ml可溶性细胞因子sRANKL处理后,细胞划痕试验检测细胞迁移能力,CCK-8试验检测细胞的增殖能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin及Vimentin mRNA及蛋白的表达变化。结果:经1μg/ml sRANKL刺激后,HEC-1ARANK细胞迁移能力增强(P0.01),增殖效应没有明显改变(P0.05),上皮性标记物E-cadherin mRNA及蛋白的表达水平下降,间质性标记物N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白的表达水平显著上调(P0.01)。结论:RANKL可通过诱导HEC-1A细胞发生上皮间质转化促进子宫内膜癌的转移。     

EGFR过表达对子宫内膜癌细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)过表达对子宫内膜癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法:选取子宫内膜癌Ishikawa及KLE细胞株,利用脂质体将携带EGFR基因的质粒转染到Ishikawa细胞株建立EGFR过表达的Ishikawa细胞株,应用RT-PCR、Western blot检测上述3种细胞中EMT相关指标E-cadherin、α-catenin、N-cadherin、Vimentin的表达量。结果:低分化、高侵袭性的KLE细胞中EGFR呈高表达,且KLE细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的蛋白表达量均低于Ishikawa细胞(P<0.01),间质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达量则高于Ishikawa细胞(P<0.01),EGFR过表达处理后,Ishikawa细胞E-cadherin、α-catenin mRNA及蛋白表达量均显著降低(P<0.01),N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表达量则显著升高(P<0.01)。结论:EGFR过表达引起子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化。     

EGFR抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化的影响。方法:蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白E-cadherin、α-catenin,间质标记蛋白N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平。MTT法检测不同浓度AG1478对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。蛋白印迹法检测AG1478对子宫内膜癌细胞E-cadherin、α-catenin,N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白表达水平的影响。体外迁移实验检测AG1478对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响。结果:(1)EGFR过表达可下调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并上调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平(P<0.05)。(2)AG1478对两种子宫内膜癌细胞均有增殖抑制作用,以经转染稳定过表达EGFR的Ishikawa细胞更为敏感(P<0.05)。(3)AG1478上调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并下调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平,以转染EGFR的Ishikawa细胞变化更为显著(P<0.05)。(4)AG1478可减弱子宫内膜癌细胞的迁移能力,以过表达EGFR的Ishikawa细胞更为明显(P<0.05)。结论:EGFR抑制剂AG1478可有效地抑制子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化。     

GPER抑制剂PTX对雌激素作用下子宫内膜癌细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨G蛋白偶联雌激素受体(GPER)抑制剂百日咳毒素(PTX)对17β-雌二醇(E2)作用下子宫内膜癌系ER阳性的Ishikawa及ER低表达的HEC-1A的细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,初步探讨阻断GPER介导的信号传导通路治疗子宫内膜癌的可行性。方法:选取对数生长的细胞随机分为空白对照组(不加任何试剂)、阴性对照组(加10-6mol/L E2)和实验组(10-6mol/L E2+PTX)。应用四甲基亚唑蓝(MTT)法、流式细胞术观察PTX对E2作用下的子宫内膜癌的细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果:(1)随着E2浓度的增加和作用时间的延长,子宫内膜癌Ishikawa细胞在490nm处光密度值增大。E2对Ishikawa细胞具有促增殖作用,且呈时间和浓度依赖性(P均<0.001),而对HEC-1A的细胞增殖作用不显著(P=0.393),各浓度之间差异均无统计学意义(P=0.137)。不同浓度E2作用48h后,Ishikawa细胞G0～G1期比例减少(P=0.001),S期比例增多(P=0.002),HEC-1A变化不显著。(2)随着PTX浓度增加及时间延长,两种细胞增殖能力逐渐下降并呈时间和浓度依赖性(P均<0.001);不同浓度PTX作用48h后,两种细胞的凋亡率、G0～G1比例均升高(P<0.001,P<0.05),S期比例在Ishikawa细胞无显著变化,在HEC-1A细胞降低,G2～M期比例在Ishikawa细胞降低,在HEC-1A细胞无显著变化。结论:PTX可以抑制E2对子宫内膜癌细胞的促增殖作用,促使其发生凋亡,抑制细胞周期进展。GPER介导的信号传导通路可能成为治疗子宫内膜癌的新靶点。     

17β-雌二醇对人子宫内膜癌细胞的增殖及P21ras和p-Erk表达的研究

目的:探讨17β-雌二醇(E2)对人子宫内膜腺癌雌激素受体(ER)阳性的Ishikawa和ER阴性的HEC-1A细胞增殖,细胞周期及其对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关蛋白P21ras和p-Erk表达的影响及意义。方法:用MTT法,流式细胞技术检测不同浓度E2作用Ishikawa和HEC-1A细胞不同时间的细胞吸光度值及细胞周期,用免疫细胞化学法检测上述细胞中P21ras和p-Erk的表达。结果:随E2浓度增加,Ishikawa细胞吸光度值上升并呈时间依赖性(P<0.01),G0～G1期比例下降(P<0.01),S期比例升高(P<0.01);HEC-1A细胞吸光度值及细胞周期无明显变化(P>0.05);10-6mol/LE2作用于Ishikawa细胞30min时,P21ras和p-Erk活化表达最强,作用于HEC-1A细胞15min时,P21ras和p-Erk即有明显表达而且达高峰,随着E2浓度增加两种细胞中P21ras和p-Erk表达均逐渐增加,呈浓度依赖性。结论:E2可促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖和周期进展,而且可以促进Ishikawa和HEC-1A中P21ras和p-Erk表达增加。     

UBE3C在雌激素促进子宫内膜癌细胞迁移及侵袭中的作用机制研究

目的:探讨泛素连接酶E3C(UBE3C)在雌激素(E_2)诱导子宫内膜癌细胞发生迁移、侵袭及上皮间质转化(EMT)过程中的作用。方法:免疫组化法检测子宫内膜癌组织中UBE3C表达情况。qRT-PCR及Western blot法检测UBE3C在子宫内膜癌细胞株、子宫内膜间质细胞株及正常子宫内膜上皮细胞中的表达。雌激素以浓度及时间梯度处理Ishikawa细胞,qRT-PCR及Western blot法检测UBE3C mRNA和蛋白表达。雌激素处理siNC或siUBE3C转染的Ishikawa细胞,划痕试验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blot法检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、snail及slug表达。结果:UBE3C在子宫内膜癌组织及细胞中高表达。雌激素能上调Ishikawa细胞UBE3C mRNA及蛋白表达,且在一定范围内呈剂量时间依赖性。雌激素刺激增强Ishikawa细胞的迁移、侵袭能力,促进EMT;si-UBE3C干扰能显著抑制上述作用,且能减弱雌激素对Ishikawa细胞迁移、侵袭能力的增强及EMT的促进。结论:UBE3C与雌激素能增强子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭能力,促进上皮间质转化,UBE3C可能是雌激素下游重要的靶基因之一,介导雌激素诱导子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化。     

三苯氧胺对人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞增殖的影响

目的:探讨三苯氧胺(TAM)在体外对Ishikawa人子宫内膜癌细胞株增殖的影响及其作用机制。方法:采用MTT法观察不同浓度TAM作用不同时间对Ishikawa细胞增殖的影响,另应用MTT法、流式细胞术、免疫细胞化学方法观察比较TAM、17β-雌二醇(17β-E2)及两者联合作用不同时间后对Ishikawa细胞增殖率,细胞周期时相分布以及C-myc、bcl-2、Bax 3种蛋白表达的影响。结果:TAM对Ishikawa细胞的促增殖作用在一定剂量范围内有浓度依赖性,可使G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例升高;C-myc、bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达下降。结论:体外TAM可能通过调节细胞周期时相分布及上调C-myc蛋白、bcl-2蛋白,下调Bax蛋白表达,促进Ishikawa人子宫内膜癌细胞增殖。     

子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞雌激素受体表达

目的研究子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A雌激素受体(ER)的表达情况。方法应用免疫细胞化学和逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR)技术,检测Ishikawa和HEC-1A细胞中ERα、ERβ蛋白和mRNA表达水平。结果Ishikawa细胞中,ERα、ERβ蛋白均呈阳性表达,而在HEC-1A细胞中ERα呈弱阳性表达,ERβ阴性表达;Ishikawa细胞中ERα、ERβmRNA表达水平均显著高于HEC-1A细胞;(P<0.01)。结论Ishikawa细胞是ER阳性子宫内膜癌细胞系,而HEC-1A细胞则为ER低表达细胞系。     

RNA干扰抑制EZH2基因表达对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:利用RNA干扰技术靶向沉默EZH2基因,检测其对子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:实时荧光定量PCR、Western blot检测EZH2在子宫内膜细胞ESC及子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达差异。利用化学技术合成小分子siRNA转染子宫内膜癌细胞,靶向抑制EZH2基因表达。CCK-8、Transwell小室检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2增殖、迁移能力变化。Western blot检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中EMT相关蛋白E-cadherin、α-catenin、N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果:(1)EZH2在子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达明显高于子宫内膜细胞ESC(P0.01)。(2)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞增殖、迁移能力降低(P0.01)。(3)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的蛋白表达水平上调(P0.05),间质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平下调(P0.01)。结论:EZH2在子宫内膜癌细胞中高表达,siRNA靶向沉默EZH2基因可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化。     

雌、孕激素对子宫内膜癌细胞株Ishikawa体外生长的影响

目的探讨雌激素(17β-雌二醇,E2)、孕激素(P)及其不同配伍对子宫内膜癌Ishikawa细胞体外生长的影响,为临床子宫内膜癌患者术后激素补充治疗(HRT)提供理论依据。方法体外培养人子宫内膜癌Ishikawa细胞株。实验组分别加入不同浓度E2(E2组)、P(P组)及二者不同浓度配伍(E2+P组);对照组加入0.01%乙醇。观察细胞形态变化;测定细胞的增殖、凋亡和细胞周期变化。结果 Ishikawa细胞吸光度(A值)及增殖促进率均随E2浓度的增加呈逐渐上升趋势。E2浓度增至10-8～10-6mol/L,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。相反,P和E2+P两组均随P浓度的增加,对Ishikawa细胞增殖抑制率逐渐升高(P0.05,P0.01)。E2终浓度增至10-6mol/L,P终浓度10-5及0.5×10-4mol/L时,差异有统计学意义(P0.05)。对照组Ishikawa细胞大多处于G0/G1期。经E2、P作用后,细胞周期发生改变,E2组S期细胞比例上升,凋亡率下降(P0.01);P组和E2+P组G0/G1期细胞比例上升,S期比例下降,凋亡率上升。E2组Ishikawa细胞数量增多,核分裂相多见。P组和E2+P组则见Ishikawa细胞数目减少,细胞明显皱缩,体积变小,凋亡小体多见。结论 E2对Ishikawa细胞有促增殖、抗凋亡作用;P则抑制Ishikawa细胞增殖,并诱导其凋亡;E2+P是否具有抑制细胞增殖并诱导凋亡的作用与E2和P具体配伍浓度有关;合理的E2+P配伍不促进Ishikawa细胞的增殖。     

白细胞介素17诱导子宫内膜癌HEC-1-B细胞对单核细胞趋化的研究

目的:探讨白细胞介素17(IL-17)诱导人子宫内膜癌HEC-1-B细胞对单核细胞的趋化作用,及其对趋化因子CCL2、CCL5表达的影响。方法:分别采用0ng/ml(对照组)、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml浓度的IL-17诱导人子宫内膜癌HEC-1-B细胞,24h后收集细胞上清液置于transwell小室的下室,上室放入THP-1细胞,计数进入下室的THP-1细胞并计算趋化指数;采用荧光定量PCR方法和ELISA方法检测1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml IL-17对HEC-1-B细胞CCL2、CCL5 mRNA基因表达以及蛋白表达水平的影响。结果:单核细胞的趋化能力与IL-17呈浓度依赖性,趋化指数在对照组及1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml 3个实验组分别为2.05±0.17、2.93±0.22、3.53±0.28及4.57±0.37,4组的差异有统计学意义(P<0.01)。各实验组细胞CCL2及CCL5 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较明显升高(P<0.05),表达水平均随着IL-17浓度增加而增高。结论:IL-17诱导后的子宫内膜癌细胞液可以促进单核细胞的趋化作用,其机制可能与IL-17促进HEC-1-B细胞分泌趋化因子CCL2、CCL5的表达上调有关。     

脂联素对子宫内膜癌细胞增殖凋亡的影响

目的:研究脂联素对子宫内膜癌细胞增殖凋亡的影响及其信号的传导。方法:免疫细胞化学方法及RT-PCR法检测子宫内膜癌Ishikawa3-H-12细胞AdipoR1/R2蛋白及mRNA的表达,不同浓度脂联素(2.5,5,10,20μg/ml)作用子宫内膜癌细胞30min,Western blot检测AMPK磷酸化程度,不同浓度脂联素作用细胞48h及AMPK抑制剂(复合物C)预处理后脂联素再作用48h后,MTT试验及流式细胞仪检测不同处理组细胞的增殖及凋亡。结果:子宫内膜癌Ishikawa3-H-12细胞AdipoR1/R2蛋白呈棕黄色颗粒状表达,并可见AdipoR1/R2基因表达。除2.5μg/ml浓度外,其余浓度组脂联素均显著诱导AMPK磷酸化,不同浓度组AMPK活化差异有统计学意义(F=27.985,P0.01),脂联素以浓度依赖模式诱导子宫内膜癌细胞AMPK活化。脂联素以浓度依赖模式显著抑制子宫内膜癌细胞增殖(F=13.322,P0.01),诱导子宫内膜癌细胞凋亡(F=46.826,P0.01),复合物C可以阻断脂联素诱导的细胞增殖抑制及凋亡。结论:脂联素可能通过影响AMPK信号通路抑制子宫内膜癌细胞增殖,促进凋亡。     

雌激素跨膜受体GPR30介导子宫内膜癌中IL-6/STAT3炎症信号通路的激活

目的:探讨新型雌激素跨膜受体GPR30对子宫内膜癌中IL-6/STAT3炎症信号通路的调节作用。方法:将子宫内膜癌细胞系Ishikawa、KLE分为5组:对照组、E2组、G1组(GPR30特异性激动剂)、E2+G15组(GPR30特异性抑制剂)、G1+G15组。应用转染技术下调Ishikawa和KLE细胞中GPR30的表达后,分别给予E2和G1作用。Western blot法检测各组细胞中STAT3的蛋白表达水平;ELISA法检测细胞培养上清中IL-6的含量。结果:Ishikawa、KLE细胞系中E2组和G1组的STAT3蛋白及IL-6表达水平均显著高于对照组、E2+G15组、G1+G15组(P<0.05)。GPR30稳定下调后,E2+RNAi组和G1+RNAi组中STAT3蛋白与IL-6表达上调均被阻断(P<0.05)。结论:E2和G1能促进子宫内膜癌细胞中IL-6/STAT3的表达,GPR30的表达下调和阻滞剂能抑制E2和G1诱导的子宫内膜癌细胞IL-6/STAT3的表达。GPR30可通过激活IL-6/STAT3炎症通路而在子宫内膜癌组织中发挥重要作用。     

VPA、SAHA和DAC对子宫内膜癌细胞系抑制作用的研究

目的:观察丙戊酸(VPA)、软木酰苯胺氧肟酸(SAHA)和5-氮-2-脱氧胞苷(DAC)对子宫内膜癌细胞RL-952和HEC-1-B的增殖抑制作用,及对细胞周期、凋亡情况和上皮型钙黏素(E-cad)基因表达的影响.方法:以VPA、SAHA和DAC作用于子宫内膜癌细胞,应用噻唑蓝(MTr)比色法、流式细胞仪和透射电镜对细胞增殖、周期和凋亡情况进行观察.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法观察药物作用后细胞内E-cad mRNA表达的情况.结果:VPA、SAHA和DAC作用HEC-1-B和RL-952细胞,随着药物浓度的增加,增殖抑制率明显增加(6.77％～93.25％和3.24％～89.25％,5.61％ ～97.36％和2.56％～87.85％,8.25％～92.54％和5.56％～93.47％)(P＜0.01);同一浓度药物随着作用时间的延长(24～96小时)对HEC-1-B和RL-952细胞增殖抑制率明显增加(42.41％～82.74％和36.17％ ～71.05％,43.15％～82.09％和40.38％～85.93％,43.26％～91.44％和37.75％ ～ 85.37％)(P＜0.01).HEC-1-B和RL-952细胞G0/G1期所占比例,经VPA、SAHA、DAC作用24小时后均较对照组增高,差异有高度统计学意义(P＜0.01).应用VPA、SAHA和DAC后细胞凋亡发生率均较对照组增高,差异有高度统计学意义(P＜0.01),出现特征性凋亡形态特征.VPA、SAHA和DAC作用后,RL-952和HEC-1-B细胞E-cad mRNA表达上调,较对照组均增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:VPA、SAHA和DAC可有效抑制子宫内膜癌RL-952和HEC-1-B细胞增殖,有明显的细胞周期阻滞和诱导凋亡作用,对E-cad基因具有明显上调作用.     

雌激素和紫杉醇对子宫内膜癌Ishikawa细胞中Bub1 mRNA表达的影响

目的 探讨雌激素和紫杉醇对子宫内膜癌Ishikawa细胞中Bub1 mRNA表达的影响.方法 (1)Ishikawa细胞中加入10 nmol/L的17β雌二醇(17β-E2)作用24、48和72 h,采用活细胞计数(CCK-8)法检测其增殖活力[以吸光度(A)值表示],以17β-E2浓度0 nmol/L者为空白对照.(2)按如下方法处理Ishikawa细胞:①加入不同浓度(0.1、10、1000 nmol/L)的17β-E2作用不同时间(5、15、30 min及1、2、4、8、12、16、24、30 h);②经同步化处理(即先期予无血清培养基培养),然后加入不同浓度(10、100 nmol/L)的紫杉醇作用不同时间(8、24 h);③未经同步化处理,直接加入100 nmol/L的紫杉醇作用4、8、16、24、48 h;均以作用时间0 h者为空白对照.采用实时定量PCR技术检测经上述方法处理后的细胞中Bub1 mRNA的表达水平(设空白对照为1,以倍数表示Bub1 mRNA的表达水平).结果 (1)17β-E2作用后Ishikawa细胞的增殖活力随着作用时间(24、48和72 h)的延长逐渐增加,其A值分别为0.86±0.10、1.66 ±0.10、2.32±0.24,呈时间依赖性(P＜0.01).(2)不同浓度(0.1、10、1000 nmol/L)的17β-E2作用不同时间(5、15、30 min及1、2、4、8、12、16、24、30 h)后,Ishikawa细胞中Bub1 mRNA的表达水平(与空白对照比较)随着17β-E2浓度的升高呈下降趋势,而随着作用时间的延长无明显变化.当17β-E2浓度为10 nmol/L时,细胞中Bub1 mRNA的表达水平最低,与空白对照比较,差异则有统计学意义(P=0.020);而当浓度为0.1、1000 nmol/L时,与空白对照比较,差异则无统计学意义(P=0.746,P=0.197).经同步化处理的Ishikawa细胞,予10 nmol/L的紫杉醇作用8、24 h后,Ishikawa细胞中Bub1 mRNA的表达水平下降,分别为(0.403±0.008)、(0.775±0.144)倍,两者比较,差异无统计学意义(P=0.251);紫杉醇作用8 h时与空白对照比较,差异有统计学意义(P=0.009);而紫杉醇作用24 h时与空白对照比较,差异则无统计学意义(P=0.396).100nmol/L的紫杉醇作用8、24 h后,Ishikawa细胞中Bub1 mRNA的表达水平下降,分别为(0.697±0.017)、(0.850±0.004)倍,两者比较,差异无统计学意义(P=0.061);而分别与空白对照比较,差异则均有统计学意义(P=0.038,P=0.019).未经同步化处理的Ishikawa细胞,予100 nmol/L紫杉醇作用4、8、16、24、48 h后,细胞中Bub1 mRNA的表达水平呈上升趋势,分别为(1.127±0.105)、(1.614±0.154)、(2.092±0.179)、(1.381±0.061)、(1.519±0.182)倍,各时间点间比较,差异有统计学意义(P＜0.01),其中作用16 h时表达最强.结论 雌激素可降调Ishikawa细胞中Bub1 mRNA的表达;紫杉醇对先期无血清培养的Ishikawa细胞可下调其Bub1 mRNA的表达,而对正常培养的细胞则上调其Bub1 mRNA的表达,提示紫杉醇在不同条件下杀伤子宫内膜癌细胞的效力与Bub1mRNA的表达失调有关.     

periostin促进Ishikawa子宫内膜癌肿瘤干细胞的增殖和侵袭

目的:探讨periostin对子宫内膜癌肿瘤干细胞增殖和侵袭的影响,及其可能作用机制。方法:收集100例手术切除的子宫内膜癌组织及距病灶3cm的癌旁组织,免疫组化、荧光定量PCR技术检测子宫内膜癌组织及癌旁组织中periostin的表达。流式细胞仪分选出子宫内膜癌细胞系Ishikawa CD133~+细胞并培养,免疫荧光检测Ishikawa肿瘤细胞球中CD133的表达情况。Western bolt法检测CD133~+ Ishikawa和parental Ishikawa细胞中periostin的表达。构建针对periostin的shRNA表达载体转染Ishikawa CD133~+细胞和过表达periostin的载体转染亲本parental Ishikawa细胞。Western bolt法检测细胞中periostin蛋白表达水平,CCK-8和Transwell小室检测细胞的增殖和侵袭能力,Western bolt法检测Wnt信号通路蛋白(β-catenin、c-myc、CyclinD1、GSK3β)的表达。结果:periostin在子宫内膜癌组织的表达高于癌旁组织(P0.01),并与子宫内膜癌的病理级别呈正相关(r=0.65,P0.01)。子宫内膜癌肿瘤干细胞具有"干细胞"特性,能形成肿瘤球并表达干细胞标记物CD133。periostin在CD133~+ Ishikawa细胞中的表达高于亲本parental Ishikawa细胞(P0.01);相对于转染空载体组细胞,periostin shRNA能有效抑制Ishikawa CD133~+细胞的增殖和侵袭,且抑制Wnt信号通路蛋白(β-catenin、c-myc、CyclinD1、GSK3β)的表达(均P0.01)。Parental Ishikawa细胞过表达periostin慢病毒能增强其增殖和侵袭能力,表现为Wnt/β-catenin信号通路被激活。结论:periostin通过激活Wnt/β-catenin信号通道促进子宫内膜癌肿瘤干细胞的增殖和侵袭。periostin可能成为临床治疗子宫内膜癌的新靶标。     

子宫内膜癌肿瘤微环境内IGFBP-3表达及其对肿瘤侵袭能力的影响

目的:探讨子宫内膜癌肿瘤微环境内IGFBP-3表达与肿瘤-间质相互作用的关系,以及IGFBP-3表达对子宫内膜癌侵袭能力的影响。方法:免疫组化法检测子宫内膜癌、正常子宫内膜组织中IGFBP-3的表达情况。肿瘤相关成纤维细胞(CAF)、正常内膜成纤维细胞(NF)与子宫内膜癌Ishikawa细胞在Transwell小室内共培养,RT-PCR、ELISA法检测IGFBP-3表达水平的改变。Transwell侵袭实验评估IGFBP-3表达改变对Ishikawa细胞侵袭能力的影响。结果:子宫内膜癌组织中IGFBP-3表达显著低于正常子宫内膜组织(P0.01)。CAF、NF与Ishikawa细胞共培养后,两种间质成纤维细胞中IGFBP-3 mRNA表达水平均显著下降(P0.01);而在Ishikawa细胞,CAF可使其IGFBP-3 mRNA表达显著降低(P0.01),但NF对其无显著影响(P0.05)。CAF、NF均能促进Ishikawa细胞的侵袭能力;与单Ishikawa细胞组和NF+Ishikawa共培养组相比,CAF共培养能显著增加Ishikawa细胞的侵袭能力(113.33±8.50 vs 65.17±10.23、75.33±8.21,P0.01)。而加入外源性重组人IGFBP-3后,能显著抑制CAF的促侵袭作用。结论:子宫内膜癌肿瘤与间质相互作用可导致肿瘤微环境内IGFBP-3表达下降,而肿瘤微环境IGFBP-3表达的改变与子宫内膜癌的生长、侵袭和转移密切相关。     

雌激素对子宫内膜癌细胞内钙离子水平的调控的研究

目的:研究雌激素通过子宫内膜癌细胞膜受体非基因效应对细胞内钙离子的调控。方法:17β-雌二醇(E2)和17β-雌二醇偶联牛血清白蛋白(E2-BSA)作用于子宫内膜癌Ishikawa细胞系,在细胞外液分别为细胞培养基、Tyrode's液和磷酸缓冲液(PBS)的条件下,激光共聚焦显微镜检测雌激素作用后子宫内膜癌细胞胞浆钙离子的浓度变化。结果:细胞外液为培养基时,10nmol/L E2和E2-BSA作用100s内即引起钙离子浓度的增高,E2表现为单峰,E2-BSA表现为双峰;细胞外液为Tyrode's液时,E2作用后钙离子浓度无改变,E2-BSA引起钙离子浓度快速增高,100s后回落;细胞外液为PBS时,E2作用后钙离子浓度瞬时下降,E2-BSA作用后钙离子浓度快速下降,50s后趋于稳定。结论:雌激素可调节子宫内膜癌细胞内钙离子浓度,细胞外液可影响其调控作用。     

信号通路抑制剂对PTEN基因不同表达状态子宫内膜癌细胞的作用

目的 比较相关信号通路抑制剂诱导PTEN基因不同表达状态子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡情况.方法 以PTEN反义寡核昔酸及PTEN真核表达载体转染子宫内膜癌细胞(HEC-1A、Ishikawa)后,激光共聚焦显微镜观察PTEN蛋白的表达.表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶及雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制剂--RG-14620、SB203580(SB)及西罗莫司分别处理HEC-1A、HEC-1A-PTEN-null、Ishikawa、Ishikawa-PTEN细胞,荧光染色法、流式细胞仪、四甲基偶氮唑蓝比色法分别检测细胞凋亡时的形态学改变、细胞凋亡率、细胞周期分布、细胞存活率.结果 转染后,Ishikawa-PTEN细胞内PTEN蛋白表达增加,HEC-1A-FFEN-null细胞内PTEN蛋白表达受到抑制.RG-14620、SB及西罗莫司处理后,Ishikawa和HEC-1A-PTEN-null细胞荧光染色见核呈浓集周缩改变;细胞发生明显凋亡及G1期阻滞,尤以SB作用最为显著,Ishikawa+SB、HEC-1A-PTEN-null+SB的细胞凋亡率分别为(37.8±0.8)%、(31.6±0.8)%,G_1期细胞比例增加[分别为(87.5±1.9)%、(84.1±3.2)%];细胞增殖受到抑制,尤以SB处理后作用为显著,Ishikawa+SB、HEC-1A-PTEN-null+SB的细胞存活率仅为(49.0±1.7)%、(54.0±2.1)%.结论 PTEN基因缺失使相应信号通路抑制剂作用的子宫内膜癌细胞增殖明显受抑,细胞阻滞于G1期,细胞凋亡增加,对相关信号通路抑制剂的敏感性增加.